張希濤，葛春蕾，彭井華，賈新華

1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250014；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250011

結(jié)締組織相關(guān)間質(zhì)性肺病(connective tissue disease-associated interstitial lung disease，CTD-ILD)是指患者在自身免疫性疾病基礎(chǔ)上并發(fā)有肺部間質(zhì)性病變。結(jié)締組織病(CTD)主要病理變化為疏松結(jié)締組織發(fā)生黏液性水腫、類纖維蛋白變性、小血管壞死和組織損傷，肺內(nèi)由于含有豐富的膠原、血管等結(jié)締組織,并具有免疫調(diào)節(jié)、代謝、內(nèi)分泌等功能,常成為CTD累及的重要靶器官[1]。一項(xiàng)2 000例結(jié)締組織病患者隨訪20年的研究表明，CTD-ILD的預(yù)后比沒(méi)有并發(fā)間質(zhì)性肺病(ILD)的CTD患者更差，肺疾病占CTD全部死因的21.5%，其中ILD占其中的46.7%，ILD明顯降低了CTD患者的生存率[2]。現(xiàn)階段，對(duì)于CTD-ILD的治療多選用激素+免疫抑制劑的治療方案，但不良反應(yīng)較多并伴有多種并發(fā)癥，且臨床統(tǒng)計(jì)的效果具有明顯的差異性，總體來(lái)說(shuō)并不令人滿意[3]。

雷公藤(Tripterygiumwilfordii)為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，其性寒，味苦，有大毒，歸屬心、肝、胃、腎四經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[4]認(rèn)為，雷公藤具有有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗血管生成、保護(hù)神經(jīng)、保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨等多種藥理作用。臨床多用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、急慢性腎小球腎炎等自身免疫性疾病的治療。然而，對(duì)于其在CTD-ILD中的應(yīng)用并未引起廣泛重視，尤其是關(guān)于其分子機(jī)制的研究多局限在單一成分、靶點(diǎn)、通路上，未曾系統(tǒng)性的評(píng)估雷公藤在CTD-ILD疾病網(wǎng)絡(luò)中所發(fā)揮的作用。

為進(jìn)一步研究雷公藤干預(yù)CTD-ILD的作用機(jī)制，筆者在課題組前期研究的基礎(chǔ)上[5-7]，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)等現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)，從雷公藤的物質(zhì)成分出發(fā)，著眼于整體角度分析雷公藤干預(yù)CTD-ILD的分子機(jī)制，同時(shí)為后續(xù)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 雷公藤主要活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[8](http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取雷公藤的化學(xué)組成成分，根據(jù)ADME屬性值篩選出生物活性較高的成分，設(shè)置篩選參數(shù)為：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)>30，類藥性(drug-like，DL)>0.18，氫鍵給體(hydrogen bond donors，Hdon)≤5，氫鍵受體(hydrogen bond acceptors，Hacc)≤10。篩選完成后，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)，并根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充雷公藤的化學(xué)成分[9,10,11]，在Swiss Target Prediction平臺(tái)(http://www.swisstargetprediction.ch)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。篩選結(jié)束后，統(tǒng)一在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)將化合物的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行規(guī)范化處理，得到對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因名稱。

1.2 CTD-ILD相關(guān)靶點(diǎn)基因篩選

以“Connective Tissue Disease-associated Interstitial Lung Diseases ”作為檢索關(guān)鍵詞，通過(guò)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.omim.org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)挖掘與CTD-ILD相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，進(jìn)入DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca)尋找已經(jīng)獲準(zhǔn)使用的干預(yù)CTD-ILD的西藥作用靶點(diǎn)予以補(bǔ)充[12]。合并3個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值得到CTD-ILD相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 雷公藤成分-CTD-ILD靶點(diǎn)(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)R x64 4.0.0軟件將雷公藤作用靶點(diǎn)與CTD-ILD靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖。提取交集靶點(diǎn)提交至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)模型[13]。將物種類型設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”(> 0.9)，隱藏游離蛋白，余均為默認(rèn)設(shè)置。得到PPI網(wǎng)絡(luò)后，通過(guò)CytoScape3.8.0對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析，提取關(guān)鍵的蛋白質(zhì)功能模塊，并描述其參與的生物進(jìn)程及功能。

1.4 GO及KEGG富集分析

通過(guò)Metascape平臺(tái)(http://metascape.org/gp/index.html)對(duì)雷公藤干預(yù)CTD-ILD的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG生物富集分析。保存數(shù)據(jù)結(jié)果并運(yùn)用R語(yǔ)言進(jìn)行可視化分析。

1.5 雷公藤活性成分-靶點(diǎn)-CTD-ILD信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用CytoScape3.8.0構(gòu)建“雷公藤活性成分-靶點(diǎn)-CTD-ILD信號(hào)通路圖”，并利用CytoScape 3.8.0內(nèi)置工具分析雷公藤有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)篩選出核心靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

對(duì)“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值(degree)排名前4的活性成分與靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org)下載靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)，并尋找與小分子相似的獨(dú)特配體作為原配體(活性口袋位點(diǎn))。靶點(diǎn)蛋白通過(guò)PyMOL移除水分子及原配體，導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6 進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、合并非極性氫后保存成.pdbqt格式，合并非極性氫后保存成.pdbqt格式。設(shè)置Grid Box大小為40×40×40，最后，使用CMD命令字符運(yùn)行AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接[15]，用PyMOL對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤主要活性成分靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)TCMSP平臺(tái)共獲取雷公藤化學(xué)成分144種，經(jīng)ADME篩選后得到活性成分42種，剔除沒(méi)有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)蛋白的13個(gè)，剩余活性成分29個(gè)，包括雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯醇、β-谷甾醇等，文獻(xiàn)補(bǔ)充Tripterinin[10]。為方便后續(xù)繪圖及數(shù)據(jù)處理，予以標(biāo)記(見(jiàn)表1)。雷公藤各成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)424個(gè)，合并刪除重復(fù)值后共得到靶點(diǎn)136個(gè)。

表1 雷公藤主要成分

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2.2 CTD-ILD相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中，Score值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系越密切。根據(jù)文獻(xiàn)[14]，當(dāng)靶點(diǎn)過(guò)多時(shí)設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為CTD-ILD相關(guān)靶點(diǎn)，通過(guò)GeneCards所得靶點(diǎn)的Score最大值為119.41，最小值為0.49，中位數(shù)為11.38，故設(shè)定Score>11.38的基因靶點(diǎn)為CTD-ILD的相關(guān)靶點(diǎn)，篩選后共得到1 032個(gè)。從OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中，共獲取520個(gè)靶點(diǎn)。DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索中以尼達(dá)尼布的作用靶點(diǎn)予以補(bǔ)充，共21個(gè)。合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)并剔除重復(fù)值，最終得到1 496個(gè)CTD-ILD相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將雷公藤活性成分靶點(diǎn)與CTD-ILD疾病靶點(diǎn)取交集，通過(guò)R語(yǔ)言繪制韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)共80個(gè)(見(jiàn)圖1)。將交集靶點(diǎn)提交至STRING平臺(tái)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖2)，并通過(guò)CytoScape3.8.0中的MCODE插件進(jìn)行分子復(fù)合物預(yù)測(cè)，提取PPI網(wǎng)絡(luò)中具有重要生物學(xué)意義的蛋白功能模塊(module，見(jiàn)圖3)。根據(jù)P值，選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中3個(gè)評(píng)分最佳的MCODE對(duì)其生物功能進(jìn)行描述(見(jiàn)表2)。由結(jié)果可見(jiàn)，其功能主要涉及炎癥因子，癌癥通路及參與多種細(xì)胞凋亡。

2.4 GO及KEGG分析

應(yīng)用Metascape平臺(tái)對(duì)雷公藤干預(yù)CTD-ILD相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行GO，KEGG的富集分析，借助R語(yǔ)言對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。由結(jié)果可見(jiàn)多個(gè)靶點(diǎn)的功能與CTD-ILD的發(fā)生密不可分。其中，GO富集分析共得到了3 740個(gè)GO條目(P<0.01，F(xiàn)DR<0.01),其中生物過(guò)程條目1 559條，涉及炎癥、免疫、代謝、細(xì)胞因子介導(dǎo)、生物調(diào)節(jié)等。分子功能相關(guān)條目2 000條，包括抗氧化、激素調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、分子功能調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)等。細(xì)胞組成相關(guān)條39條，包括細(xì)胞外基質(zhì)、線粒體膜、突觸后膜、膜筏等。

圖1 雷公藤-CTD-ILD靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 The venn diagram of T.wilfordii and CTD-ILD targets

圖2 雷公藤-CTD-ILD潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Potential target gene PPI(protein interaction)network of T.wilfordii and CTD-ILD

圖3 潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中的ModuleFig.3 Modules of Potential target gene PPI network

表2 MCODE功能描述

KEGG富集條目共142條(P<0.01，F(xiàn)DR<0.01)，包括與炎癥及免疫相關(guān)的IL17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、Th17細(xì)胞分化通路(Th17 cell differentiation)、Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路(T cell receptor signaling pathway)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)等；與氧化應(yīng)激相關(guān)的HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、FoxO信號(hào)通路(FoxO signaling pathway)等；癌癥相關(guān)通路，如Cancer信號(hào)通路(pathways in cancer)、非小細(xì)胞肺癌信號(hào)通路(non-small cell lung cancer)、結(jié)直腸癌信號(hào)通路(colorectal cancer)等，以及其他蛋白酶，細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路。對(duì)于GO及KEGG富集結(jié)果，根據(jù)P值，對(duì)前20條相關(guān)富集結(jié)果進(jìn)行可視化(見(jiàn)圖4)。

圖4 雷公藤主要成分潛在靶點(diǎn)的富集分析Fig.4 Enrichment analysis of potential targets of main components in T.wilfordii注：A：GO-CC分析；B：GO-BP分析；C：GO-MF分析；D：KEGG分析。Note:A:GO-CC analysis;B:GO-BP analysis;C:GO-MF Analysis;D:KEGG analysis.

2.5 成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)CytoScape3.8.0構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖5)。運(yùn)用CytoScape3.8.0內(nèi)置的NetworkAnalyzer分析通路網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，提取核心活性成分及核心靶點(diǎn)。成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中共有130個(gè)節(jié)點(diǎn)，形成了575個(gè)關(guān)系對(duì)。其中，山奈酚連接度(dgree)為34，介度(betweenness centrality)為0.211 545 2，緊密度(closeness centrality)為0.47426471，預(yù)測(cè)其是干預(yù)CTD-ILD中的重要成分，其次為雷公藤內(nèi)酯醇、川陳皮素、β-谷甾醇等(見(jiàn)表3)。PTGS2連接度26，介度0.153 926 47，緊密度0.507 874 02，預(yù)測(cè)其是雷公藤干預(yù)CTD-ILD的重要靶點(diǎn)，JUN、MAPK8、RELA、SCN5A、TNF等亦為相對(duì)重要的靶點(diǎn)(見(jiàn)表4)。

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

對(duì)雷公藤核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果示(見(jiàn)表5)，分子親和力(affinity)< -5 kcal/mol的占93.75%，表示有較好的結(jié)合活性，分子親和力< -7 kcal/mol的占62.5%，山奈酚與3V3V的親和力最高，為-8.6 kcal/mol,顯示化合物與靶點(diǎn)之間具有良好的對(duì)接活性[16]；而其中5次對(duì)接結(jié)果顯示，部分化合物與靶點(diǎn)受體之間的親和力超過(guò)了原配體，分別是：山奈酚與3QXY，山奈酚與5T01，雷公藤內(nèi)酯醇與3QXY，川陳皮素與5T01，β-谷甾醇與3QXY)(見(jiàn)圖6)，這一部分化合物可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制原配體與靶點(diǎn)受體的結(jié)合而影響其功能，在CTD-ILD中發(fā)揮重要作用。

圖5 雷公藤成分-CTD-ILD靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Constituents of T.wilfordii and CTD-ILD target and signal pathway network注：六邊形代表藥物成分；菱形代表靶點(diǎn)；圓形為通路。節(jié)點(diǎn)的面積及顏色透明度代表其度值，面積越大、顏色越深說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)越重要。Note:Hexagon represents drug composition;Rhomboid represents target;Circle represents pathway.Area and color transparency of nodes represent degree value,larger area and deeper color indicate more important node.

表3 雷公藤核心成分

圖6 分子對(duì)接模型Fig.6 Molecular docking model注：A：川陳皮素—5T01；B：雷公藤內(nèi)酯醇—3QXY；C：β-谷甾醇—3QXY；D：山奈酚—5T01；F：山奈酚—3QXY)。Note:A:Nobiletin-5T01;B:Triptolide-3QXY;C:β-Sitosterol-3QXY;D:Kaempferol-5T01;F:Kaempferol-3QXY).

表5 分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

結(jié)締組織相關(guān)間質(zhì)性肺病(CTD-ILD)在古代中醫(yī)文獻(xiàn)中并未有具體的命名，結(jié)合本病的臨床表現(xiàn)及病因病機(jī)可將其歸屬為“肺痹”的范疇，《內(nèi)經(jīng)》中最早簡(jiǎn)述了肺痹的臨床表現(xiàn)及病因，如《素問(wèn)·痹論篇》曰:“五臟皆有所合，病久而不去者，內(nèi)舍于其合也，……皮痹不已，復(fù)感于邪，內(nèi)舍于肺；所謂痹者，各以其時(shí)重感于風(fēng)寒濕之氣也；凡痹之客五臟者，肺痹者，煩滿喘而嘔；淫氣喘息，痹聚在肺”，又曰：“其入臟者死，其流連筋骨間者疼久，其留皮膚間者易已”，論述本病病情較重，預(yù)后差；目前西醫(yī)大多應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療，但其不良反應(yīng)實(shí)多并伴有多種并發(fā)癥，治療效果不甚理想；隨中醫(yī)藥文化蓬勃發(fā)展，中醫(yī)藥通過(guò)運(yùn)用整體觀念、辨證論治的原則在多種疾病治療中的優(yōu)勢(shì)凸顯，同時(shí)中藥主要來(lái)源于天然的動(dòng)植物、礦物及其加工品等，有效成分眾多。多項(xiàng)研究證實(shí)，中醫(yī)藥在CTD-ILD的治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Qu等[7]從中醫(yī)整體觀及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度出發(fā)，基于“伏毒學(xué)說(shuō)”論治，提出了扶正益氣托毒、化痰通絡(luò)解毒兩種治法，此外本課題組還論述了雷公藤在不同類型的結(jié)締組織相關(guān)間質(zhì)性肺病中的臨床應(yīng)用及作用機(jī)理[5,6]。基于上述理論研究，本篇基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步探討雷公藤干預(yù)CTD-ILD的分子機(jī)制，為雷公藤用于本病治療提供理論依據(jù)，并期待能為新藥的研究提供方向。

筆者運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法篩選出雷公藤有效活性成分29個(gè)，預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)136個(gè)，其中與CTD-ILD相關(guān)的靶點(diǎn)80個(gè)，占總靶點(diǎn)的59%，說(shuō)明雷公藤對(duì)于CTD-ILD的治療具有極高的針對(duì)性，可以通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)聯(lián)合發(fā)揮治療作用，在CTD-ILD的治療中有一定的研究?jī)r(jià)值；根據(jù)PPI及“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治鼋Y(jié)果，得到排名前5的關(guān)鍵化合物分別為山奈酚、雷公藤內(nèi)酯醇、川陳皮素、β-谷甾醇、豆甾醇。

山奈酚屬于黃酮類化合物，廣泛存在于各種植物中?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山奈酚具有抗癌、防癌、抗炎、抗氧化、抗菌等作用。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚在體外可以以非競(jìng)爭(zhēng)性的方式抑制鈣調(diào)磷酸酶(CN)的活性，后者是一種高度保守的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，其參與細(xì)胞因子介導(dǎo)的T細(xì)胞活化，在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，同時(shí)，山奈酚還能抑制Jurkat細(xì)胞中IL-2基因的表達(dá)，發(fā)揮了免疫抑制的作用。川陳皮素具有抗炎、抗癌、抗突變、抗血栓形成、抗膽堿酯酶等作用，Zheng等[18]研究發(fā)現(xiàn)，川陳皮素使細(xì)胞線粒體膜電位下降并隨時(shí)間延長(zhǎng)，Akt、p-Akt蛋白表達(dá)下調(diào)呈時(shí)間依賴性，從而得出川陳皮素可以通過(guò)線粒體途徑抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，而PI3K/Akt信號(hào)通路通過(guò)刺激成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)纖維分泌及膠原沉積等在肺纖維化“損傷-修復(fù)”這一中心環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用。雷公藤內(nèi)酯醇是一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，其在抗氧化，抗類風(fēng)濕，抗老年性癡呆癥，抗癌等方面發(fā)揮重要作用，同時(shí)被廣泛認(rèn)為是雷公藤最主要的抗炎和免疫抑制成分[19]。相關(guān)藥理研究認(rèn)為，雷公藤內(nèi)酯醇可以通過(guò)調(diào)控MAPK和VEGF等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用，Hu等[20]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度闡明雷公藤內(nèi)酯醇抗風(fēng)濕作用機(jī)制為通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在關(guān)節(jié)抑制細(xì)胞因子的表達(dá)，來(lái)減少膠原蛋白的產(chǎn)生、抑制滑膜細(xì)胞增殖、減弱侵襲能力等。實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)[21]，豆甾醇和β-谷甾醇均可通過(guò)顯著降低非酒精性脂肪肝細(xì)胞內(nèi)MDA含量、提高GSH水平，減輕脂質(zhì)蓄積造成的肝細(xì)胞的過(guò)氧化損傷，增強(qiáng)細(xì)胞的解毒功能，其具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可較好地改善細(xì)胞脂質(zhì)沉積所引起的氧化應(yīng)激狀態(tài)。綜上分析，這些關(guān)鍵化合物成分大多具有抗炎、抗癌、抗氧化、免疫抑制等作用，這提示雷公藤可能通過(guò)抗炎，抗氧化，免疫抑制等途徑起到治療CTD-ILD的作用。

富集分析的結(jié)果顯示，IL17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Cancer信號(hào)通路等是雷公藤干預(yù)CTD-ILD的重要通路，其他還包括Th17細(xì)胞分化通路、Toll樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、非小細(xì)胞肺癌信號(hào)通路、結(jié)直腸癌信號(hào)通路等，主要涉及炎癥相關(guān)、免疫相關(guān)、氧化應(yīng)激及腫瘤等。其中IL17可以促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的增殖及向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并且能夠促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ膠原蛋白的合成，進(jìn)而加快肺纖維化的進(jìn)程[22]。TNF-α參與了肺纖維化的急性炎癥反應(yīng)，可以促進(jìn)Ⅱ型肺泡細(xì)胞的凋亡，從而抑制肺損傷的修復(fù)[23]，同時(shí)，TNF-α可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞大量聚集，膠原合成增加[24]。研究結(jié)果還表明，諸多癌癥相關(guān)通路參與了肺纖維化的進(jìn)程，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路不僅參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，同時(shí)也參與肺纖維化的進(jìn)展，有證據(jù)表明Wnt1可誘導(dǎo)信號(hào)蛋白-1(WISP1)是肺泡上皮II型細(xì)胞增生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也是抗纖維化治療重要靶點(diǎn)[25]，并且是治療肺纖維化合并肺癌有希望的靶點(diǎn)之一。

雷公藤干預(yù)CTD-ILD治療的主要靶點(diǎn)為PTGS2。其中前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶(prostaglandin endoperoxide synthase，PTGS)，又稱環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)，是花生四烯酸合成前列腺素的關(guān)鍵限速酶，分為結(jié)構(gòu)型COX-1與誘導(dǎo)型COX-2。Yang等[26]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，COX-2 在博萊霉素肺纖維化組織中有高度表達(dá)，主要分布于細(xì)支氣管上皮細(xì)胞，其能上調(diào)PEG2的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致Th1/Th2型細(xì)胞因子的平衡失調(diào)，刺激體內(nèi)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，加速肺纖維化進(jìn)程。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，CTD-ILD中多個(gè)重要基因與腫瘤密切相關(guān)，如PTGS2、JUN、TNF等。無(wú)論是從靶點(diǎn)亦或是信號(hào)通路角度，腫瘤與CTD-ILD都具有明顯的相關(guān)性，與KEGG富集結(jié)果相符。最后分子對(duì)接的結(jié)果也驗(yàn)證了本次研究結(jié)果的可靠性。

依據(jù)本次研究結(jié)果，雷公藤可以通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路的聯(lián)合干預(yù)CTD-ILD的進(jìn)程，其關(guān)鍵化學(xué)成分為山奈酚、雷公藤內(nèi)酯醇、川陳皮素、β-谷甾醇、豆甾醇，關(guān)鍵靶點(diǎn)為為PTGS2、JUN、MAPK8、RELA等。鑒于雷公藤與CTD-ILD的相關(guān)研究不足，缺乏更多證據(jù)支持，后續(xù)將在此基礎(chǔ)上進(jìn)行動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，對(duì)于CTD-ILD的治療仍需廣大科研工作者進(jìn)行更多的基礎(chǔ)性及臨床性的深入研究；同時(shí)期待本研究預(yù)測(cè)結(jié)果能為研發(fā)新藥或新的治療手段提供方向。