項錦敏，趙瓊瑜，遠(yuǎn) 航，彭振輝，宋 偉

浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，寧波 315100

黑色素是目前所知唯一能保護(hù)生物體免受輻射傷害的天然內(nèi)源性生物聚合體，具有很強(qiáng)的生理活性，能夠有效的消除自由基[1]，對人體具有提高機(jī)體免疫力[2]、防止衰老[3,4]、抑制病毒[5]等功能。因此，黑色素被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和保健品等領(lǐng)域。目前，天然黑色素的開發(fā)研究主要集中在植物、真菌類材料。動物中黑色素與蛋白質(zhì)、脂肪等緊密相連、不易分離。因此，動物來源的黑色素研究局限在烏骨雞[6]、泥鰍[7]、大鯢[8]、海參[9]等少數(shù)烏質(zhì)性狀動物材料中。

“清溪烏鱉”(Pelodiscussinensis，以下簡稱“烏鱉”)是從中華鱉的體色變異個體經(jīng)過擴(kuò)繁得到的新品種[10]，是浙江省特有地方品種，其典型形態(tài)特征是全身體色烏黑，富含黑色素，具有很高的食藥用價值[11]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者主要從形態(tài)特征[10]、養(yǎng)殖性能[12]、營養(yǎng)成分[13]、同工酶[14]、細(xì)胞水平和DNA分子水平[15]等方面對烏鱉種質(zhì)資源進(jìn)行研究。有關(guān)烏鱉中黑色素的研究卻鮮見報道。本文以烏鱉肌肉為原材料采用“脫脂-酶解-酸解”三步法制備烏鱉黑色素，探討其結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及抗氧化活性，以期為烏鱉綜合利用以及高值化產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：烏鱉，體重約為500 g，購于浙江清溪鱉業(yè)有限公司。

試劑：黑色素標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)；木瓜蛋白酶，酶活力≥2 000 U/mg(生工生物工程(上海)股份有限公司)；甲醇、無水乙醚、無水乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、丙酮、二甲基亞砜、鹽酸、氫氧化鈉、乙酸、氫氧化鈉、溴化鉀、濃硫酸、磷酸鈉、鉬酸銨、甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑、乙二胺四乙酸二鈉、核黃素，AR(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，≥97.0%(HPLC)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

儀器：百萬分之一微量天平XS3DU(梅特勒-托利多公司)；DS-1高速組織搗碎機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)；Alphal-4LSCplus冷凍干燥機(jī)(德國Christ公司)；5810大容量低溫高速臺式離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；DHG-9246A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；CM-700D色差計(日本柯尼卡美能達(dá)公司)；Cary100紫外可見分光光度計(安捷倫科技有限公司)；Vertex 70傅立葉紅外光譜儀(德國布魯克公司)；VarioMicro cube元素分析儀(德國Elemtar公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 烏鱉肌肉黑色素的提取

參考Huang等[6]的方法，略作修改?；铙w宰殺后剝離肌肉，在高速組織勻漿機(jī)中打碎成肉糜，于冷凍干燥機(jī)中凍干，-20 ℃密封保存?zhèn)溆?。精密稱取一定量樣品置于索氏提取器中，按照乙醇回流脫脂8次，料液比1∶60(m∶V)條件進(jìn)行脫脂，脫脂反應(yīng)結(jié)束后，濾渣置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒重；脫脂后用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解工藝為酶底比為1∶2(m∶m)、酶解溫度60 ℃、酶解時間5 h、料液比1∶25(m∶V)、酶解pH 5.0，酶解處理結(jié)束后，10 000 rpm離心15 min，蒸餾水沖洗離心2～3次，沉淀物置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒重；最后利用鹽酸進(jìn)行純化，純化工藝為鹽酸濃度6 mol/L、料液比3∶50(m∶V)、時間4 h、溫度90 ℃，酸化處理結(jié)束后，10 000 rpm離心15 min，蒸餾水沖洗離心2～3次，沉淀物置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒重，低溫密封保存?zhèn)溆?。此提取工藝條件下，烏鱉黑色素提取率達(dá)1.09%。提取率計算公式如下：

提取率=[“脫脂-酶解-酸解”三步法制備的烏鱉黑色素(g)/烏鱉干肉重(g)]×100%

1.2.2 烏鱉黑色素的結(jié)構(gòu)特征檢測

1.2.2.1 紫外可見光分光光度掃描

精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入10 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液，震蕩均勻，在80 ℃水浴中恒溫加熱1 h(避光)，獲得黑色素溶液。待冷卻至室溫后(避光)，紫外可見光分光度計測定190～800 nm范圍內(nèi)吸光值，繪制隨波長變化的曲線圖。

1.2.2.2 傅里葉紅外掃描

精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，將樣品分別與0.1 g溴化鉀混合，在瑪瑙研缽中研成細(xì)粉，混合均勻后用紅外壓片機(jī)壓片。測定樣品在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)的紅外吸收光譜。

1.2.2.3 元素組成分析

參考Tu等[16]的方法，根據(jù)國標(biāo)GB/T 19143-2017《巖石有機(jī)質(zhì)中碳、氫、氧元素分析方法》和國標(biāo)GB/T 19145-2003《沉積巖中總有機(jī)碳的測定》的方法，采用元素分析儀測定烏鱉黑色素中的 C、H、O、N、S等元素含量。

1.2.3 烏鱉黑色素的理化性質(zhì)檢測

1.2.3.1 粉末顏色

黑色素粉末的外觀顏色通過色差計測定，色差值采用L*、a*和b*表示。

1.2.3.2 溶解性研究

溶劑選擇：精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入10 mL不同溶劑(甲醇、乙醇、乙酸、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、二甲基亞砜、蒸餾水、1 mol/L鹽酸溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液)于80 ℃水浴中恒溫加熱1 h(避光)，待溶液冷卻至室溫后(避光)，測定其在215 nm處的吸光值。

溶解溫度：精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入10 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液，搖勻后分別置于25、40、60、80、100 ℃恒溫水浴中保持1 h(避光)，待溶液冷卻至室溫后(避光)，測定其在215 nm處的吸光值。

溶劑濃度：精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入10 mL的0.25、0.5、1、1.5、2 mol/L的氫氧化鈉溶液，溶液搖勻后于80 ℃水浴中恒溫加熱1 h(避光)，待溶液冷卻至室溫后(避光)，測定其在215 nm處吸光值。

料液比：分別精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，按照料液比(m∶V)1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入1 mol/L氫氧化鈉溶液混合均勻，將溶液置于80 ℃水浴中恒溫加熱1 h(避光)，待溶液冷卻至室溫后測定其在215 nm處吸光值。

時間：精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，加入25 mL的1 mol/L的氫氧化鈉溶液，混合均勻后將溶液在80 ℃下恒溫加熱10、20、30、60、90、120 min(避光)，待溶液冷卻至室溫后(避光)，測定其在215 nm處吸光值。

1.2.3.3 穩(wěn)定性研究

時間穩(wěn)定性研究：精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，加入25 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液于80 ℃恒溫溶解1 h，待溶液冷卻至室溫，分裝8管，每管3 mL，依次編號1～8，置于暗處保存。依次測定0、1、2、3、4、8、12、24 h后黑色素溶液在215 nm處吸光值。

光照穩(wěn)定性：精確稱取5 mg烏鱉黑色素樣品和5 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，加入125 mL的1 mol/L 氫氧化鈉溶液于80 ℃恒溫加熱1 h，待溶液冷卻至室溫，分裝37管，每管3 mL，依次編號對照0、紫外1～12、日光1～12、黑暗1～12，分別置于環(huán)境溫度相同的暗箱、30 W白熾燈箱、30 W紫外燈箱等設(shè)施中處理。1 h內(nèi)每隔10 min各取一管不同處理組樣品，在215 nm處檢測其吸光值。

溫度穩(wěn)定性：精確稱取2 mg烏鱉黑色素樣品和2 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，加入50 mL的1 mol/L 氫氧化鈉溶液于80 ℃水浴中恒溫加熱1 h，待溶液冷卻至室溫，分裝9管，每管3 mL，依次編號1～9，每三個管子為一組(1～3、4～6、7～9)分別置于25、60、100 ℃水浴中暗處理1 h，在0、30、60 min時各取一管不同處理組樣品，在215 nm處檢測其吸光值。

1.2.4 烏鱉黑色素的抗氧化性檢測

參考Wang等[9]方法，烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品用二甲基亞砜充分溶解，總抗氧化檢測中樣品配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10、0.15和0.20 mg/mL的溶液；其他抗氧化檢測(DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、羥自由基清除能力)中樣品配制成質(zhì)量濃度為 0.1、0.5、1.0、1.5和2.0 mg/mL的溶液。

1.2.4.1 總抗氧化能力的測定

參考Prieto等[11]的方法。在10 mL具塞比色管中分別加入1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液(烏鱉黑色素溶液或黑色素標(biāo)準(zhǔn)品溶液)、1 mL H2SO4溶液(3 mol/L)、1 mL Na3PO4溶液(0.028 mol/L)、1 mL (NH4)2MoO4溶液(4 mmol/L)、蒸餾水定容至5.0 mL，搖勻后95 ℃加熱30 min，溶液冷水浴冷卻至室溫，695 nm測定吸光度。以蒸餾水代替烏鱉黑色素溶液和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白參比。

1.2.4.2 DPPH 自由基清除能力的測定

參照Chen等[12]的方法，略作修改。分別準(zhǔn)確吸取1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液、3 mL DPPH(0.1 mmol/L，無水乙醇配制)、1 mL蒸餾水于10 mL具塞比色管中充分混勻，在室溫下反應(yīng)30 min；在517 nm處測定其吸光度。按照下面公式計算DPPH清除率。

DPPH清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

式中：A0：對照液的吸光度；A1：加入樣品溶液后的吸光度；A2：為樣品溶液本底吸光度。

1.2.4.3 超氧陰離子自由基清除能力的測定

參照Beauchamp等[13]的方法，略作修改。分別取0.05 mL樣品溶液、1.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.8，50 mmol/L)、0.3 mL甲硫氨酸(130 mmol/L)、0.3 mL氮藍(lán)四唑(750 μmol/L)、0.3 mL乙二胺四乙酸二鈉(100 μmol/L)、0.3 mL核黃素(20 μmol/L)和0.25 mL蒸餾水等溶液加入到10 mL具塞比色管中并充分混勻，混勻后置暗處，于560 nm處測定其吸光度。按照下面公式計算超氧陰離子自由基清除率。

超氧陰離子自由基清除率=[A0- (A1-A2)]/

A0×100%

式中：A0：空白對照液的吸光度；A1：加入樣品溶液后的吸光度；A2：為樣品溶液本底吸光度。

1.2.4.4 羥自由基清除能力的測定

參考Liu文獻(xiàn)[17]的方法,略作改進(jìn)。試管中依次加入1 mL PBS緩沖液(pH 7.4，0.4 mol/L)、1 mL鄰菲羅啉溶液(2.5 mmol/L)、1 mL樣品溶液、1 mL硫酸亞鐵溶液(2.5 mmol/L)、0.5 mL H2O2溶液(20 mmol/L)，應(yīng)在37 ℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行，準(zhǔn)確反應(yīng)1 h后，快速記錄536 nm處的吸光度。按照以下公式計算羥自由基清除率：

羥自由基清除率=[A0- (A1-A2)] /A0×100%

式中：A0：空白對照液的吸光度；A1：加入樣品溶液后的吸光度；A2：為樣品溶液本底吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏鱉黑色素的結(jié)構(gòu)特性

2.1.1 紫外可見光掃描圖譜

烏鱉黑色素的紫外可見光譜圖如圖1所示，烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品在掃描范圍內(nèi)(190～800 nm)出現(xiàn)了一致的吸收變化規(guī)律，兩種黑色素在紫外區(qū)域都有強(qiáng)烈的吸收，其中在215 nm處有最強(qiáng)特征吸收峰，伴隨波長的逐漸增加，吸光度呈現(xiàn)下降的趨勢。這與已報道的不同來源動物黑色素的特征吸收峰在210 nm左右一致，如魷魚黑色素在201 nm處有特征吸收峰[15]，大鯢皮膚黑色素紫外最大吸收波長為214 nm[8]，螞蟻黑色素在214 nm處有特征吸收峰[18]。

2.1.2 傅里葉紅外掃描圖譜

圖2是黑色素的傅里葉紅外光譜圖，從兩種黑色素共同的吸收峰來看，在3 400 cm-1處有較強(qiáng)的吸收峰，是由O-H和吲哚的N-H伸縮振動產(chǎn)生的，是黑色素的一個特征吸收峰[16]；2 930 ～ 2 850 cm-1處附近存在相對較弱的吸收峰，推測為烷烴結(jié)構(gòu)的C-H吸收區(qū)[8,9]；在1 600 cm-1處附近由因芳香環(huán)骨架振動引起的較強(qiáng)的吸收峰，說明結(jié)構(gòu)中吲哚環(huán)占比較大，屬于黑色素典型的苯醌類結(jié)構(gòu)[16]；烏鱉黑色素在1 528 cm-1附近的吸收峰和標(biāo)準(zhǔn)品在1 380 cm-1附近的吸收峰由因吸收COO-的變形振動或C=C/C=N變形振動歸屬于苯并噻嗪環(huán)[16]。說明烏鱉黑色素具有非常典型的吲哚結(jié)構(gòu)，與動物源黑色素多屬吲哚型的觀點相符。

2.1.3 元素分析

Ito等[19]研究表明，合成的真黑色素和棕黑色素的S∶N分別為0.01和0.46、C∶N分別為7.76和5.75、O∶N分別為3.29和2.81。由表1可知，烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)品的S∶N為 0.05和0.02，這表明烏鱉黑色素主要含有真黑色素；烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)品的C∶N為10.45和8.11，明顯高于合成真黑色素和棕黑色素的C∶N，這說明烏鱉黑色素含有脂肪族；烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)品的O∶N分別4.09和3.61，說明烏鱉黑色素中-COOH含量更高。這與已報道的泰和烏骨雞[16]、林蛙卵[20]等來源的黑色素的元素組成相似。

2.2 烏鱉黑色素的理化性質(zhì)

2.2.1 烏鱉黑色素外觀顏色檢測結(jié)果

色差計測定中L*表示亮度，a*表示紅/綠，b*表示黃/藍(lán)。由表2可知，烏鱉黑色素L*值較大，而a*值和b*較小，這表明烏鱉黑色素是趨近于黑色并略帶黃色的固體粉末；黑色素標(biāo)準(zhǔn)品L*值較小，并且a*值和b*趨近于0，這表明黑色素標(biāo)準(zhǔn)品是趨近于黑色的固體粉末。

表1 黑色素元素組成分析

表2 烏鱉黑色素的外觀顏色

2.2.2 烏鱉黑色素溶解性試驗結(jié)果

2.2.2.1 溶劑選擇

由表3可知，烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品在甲醇、乙醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、丙酮等常見的有機(jī)溶劑是不溶的，而且在無機(jī)溶劑以及水中也是不溶的。但在二甲基亞砜中微溶，在氫氧化鈉溶液中易溶解。烏鱉黑色素的溶解性與報道的烏骨雞[16]、黑螞蟻[18]、林蛙卵[20]中黑色素的溶解性十分相似。

2.2.2.2 溶解溫度

溶解溫度對烏鱉黑色素溶解性的影響見圖3。由圖3可知，隨著溫度的升高，黑色素的吸光度增加，即黑色素的溶解量增加。到達(dá)80 ℃時，黑色素的吸光度最大，之后隨著溫度的升高，黑色素的吸光度減小。100 ℃黑色素的吸光度減小可能是由于過高的溫度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)的溶出，影響黑色素的溶解。

2.2.2.3 溶劑濃度

溶劑濃度對烏鱉黑色素溶解性的影響見圖4。由圖4可知，隨著氫氧化鈉溶液濃度的增加，黑色素吸光度不斷增大，當(dāng)氫氧化鈉濃度增大至1.0 mol/L時吸光度達(dá)到最大值，此時黑色素的溶解量最大，此后黑色素的吸光度隨著氫氧化鈉濃度的增大而減小。黑色素溶解性隨著氫氧化鈉濃度增大先升高后降低可能是因為濃度過高時造成殘留的雜質(zhì)(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等)溶出，影響黑色素的溶解。

圖5 NaOH濃度對烏鱉黑色素溶解性的影響Fig.4 The effect of concentration of NaOH on the solubility of melanin from Chinese soft-shelled turtle

圖5 料液比對烏鱉黑色素溶解性的影響Fig.5 The effect of solid-liquid ratio on the solubility of melanin from Chinese soft-shelled turtle

2.2.2.4 料液比

料液比對烏鱉黑色素溶解性的影響見圖5。由圖5可知，隨著料液比的增加，黑色素的吸光值先升高后降低，當(dāng)料液比在1∶20(mg∶mL)時吸光度達(dá)到最大值，此時黑色素的溶解量最大。這可能因為隨著液料比的增加，內(nèi)外黑色素濃度差就增大，傳質(zhì)推動力就增大，有利于黑色素溶解在堿溶液中，當(dāng)液料比過大時黑色素中其他堿溶性雜質(zhì)的溶出增加，致使黑色素被雜質(zhì)包裹，導(dǎo)致黑色素的溶解量減少。

2.2.2.5 溶解時間

溶解時間對烏鱉黑色素溶解性的影響見圖6。由圖6可知，隨著溶解時間的增長烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度先升高后降低，溶解時間為60 min時吸光度最大，此時黑色素的溶解量最大，之后隨著時間的增長，黑色素的溶解量趨于穩(wěn)定，略有點下降。

圖6 溶解時間對烏鱉黑色素溶解性的影響Fig.6 The effect of time on the solubility of melanin from Chinese soft-shelled turtle

2.2.3 烏鱉黑色素穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.2.3.1 時間穩(wěn)定性

時間對烏鱉黑色素穩(wěn)定性的影響如圖7所示，從圖7可以看出，烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品隨著放置時間的延長吸光度變小，其中在黑色素溶液放置1 h后急劇下降，4 h后下降趨于平緩。黑色素溶液放置前1 h內(nèi)烏鱉黑色素僅損失4.44%、黑色素標(biāo)準(zhǔn)品損失8.91%，表明1 h內(nèi)烏鱉黑色素具有較好的穩(wěn)定性。

圖7 時間對烏鱉黑色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 The effect of time on the stability of melanin from Chinese soft-shelled turtle

2.2.3.2 光穩(wěn)定性

光照對烏鱉黑色素穩(wěn)定性的影響如圖8所示，從圖8可以看出，烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品在不同光照條件(黑暗、日光照射、紫外照射)下處理，黑色素溶液的吸光度相對變化無顯著差異，表明黑色素的光穩(wěn)定性較好。與泰和烏骨雞[21]黑色素的光穩(wěn)定性相似。黑色素是由吲哚類單元結(jié)構(gòu)不規(guī)則聚合而成，特殊的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其具有吸收紫外線的功能，良好的光穩(wěn)定性可能也與此有關(guān)。

圖8 光照對烏鱉黑色素穩(wěn)定性的影響Fig.8 The effect of illumination on the stability of melanin from Chinese soft-shelled turtle注：1、2、3分別為烏鱉黑色素暗處理、日光處理、紫外處理；4、5、6為黑色素標(biāo)準(zhǔn)品暗處理、日光處理、紫外處理。Note:1,2,3 were melanin of Chinese soft-shelled turtle in dark treatment,sunlight treatment and UV-treatment;4,5,6 were melanin standard in dark treatment,sunlight treatment and UV-treatment.

2.2.3.3 熱穩(wěn)定性

耐熱性是考察色素開發(fā)利用潛能的一個重要指標(biāo)。溫度對烏鱉黑色素穩(wěn)定性的影響如圖9所示，從圖9可以看出，烏鱉黑色素溶液和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別在25、60、100 ℃情況下保持1 h，隨著加熱溫度的升高和加熱時間的延長，黑色素的保存率有所下降，但在60 ℃下加熱1 h，相對色素保存率達(dá)到85.0%以上；在100 ℃加熱1 h，相對色素保存率達(dá)到80.0%以上。這表明烏鱉黑色素較為耐熱，具有一定的熱穩(wěn)定性，這與Tu等[21]和Zou等[22]的研究結(jié)果相似。

2.3 烏鱉黑色素的抗氧化活性

2.3.1 總抗氧化能力

通過比較不同質(zhì)量濃度(0.01～0.2 mg/mL)的烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品與磷鉬酸反應(yīng)后的吸光度大小來評價其總抗氧化能力強(qiáng)弱。吸光度越大則說明還原能力越強(qiáng)，抗氧化性也越強(qiáng)。圖10是烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品的總抗氧化力測定結(jié)果，從圖10中可以看出隨著質(zhì)量濃度的增大，兩種黑色素的總抗氧化力也都增大，黑色素標(biāo)準(zhǔn)品的總抗氧化能力高于烏鱉黑色素。烏鱉黑色素的總抗氧能力與黑螞蟻[18]、烏骨雞黑色素[14]相近。

圖10 烏鱉黑色素總抗氧化能力 Fig.10 Total antioxidant activity of melanin from Chinese soft-shelled turtle

2.3.2 DPPH 自由基清除能力

烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品對DPPH的清除作用如圖11所示，從圖11可以看出，在實驗設(shè)置的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(0.1～2.0 mg/mL)，兩種黑色素對DPPH均有一定的清除作用，隨著質(zhì)量濃度的增大，其清除能力也增大，其中黑色素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度在0.5 mg/mL后，對DPPH清除率趨于平緩；烏鱉黑色素質(zhì)量濃度在2 mg/mL時，對DPPH的清除率達(dá)到77.28%。烏鱉黑色素清除DPPH自由基能力與烏骨雞黑色素[14]、林蛙卵黑色素[20]、黑木耳黑色素[22]等相似。

圖11 烏鱉黑色素清除DPPH自由基能力 Fig.11 DPPH radical scavenging activity of melanin from Chinese soft-shelled turtle

2.3.3 超氧陰離子自由基清除能力

烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品對超氧陰離子自由基的清除作用如圖12所示，從圖12可以看出，在測試濃度范圍內(nèi)(0.1～2.0 mg/mL)，烏鱉黑色素對超氧陰離子的清除率隨著濃度的提高而逐漸增大，當(dāng)濃度在2.0 mg/mL時，烏鱉黑色素對超氧陰離子自由基的清除率為44.05%，該研究結(jié)果與大鯢皮膚黑色素[8]、林蛙卵黑色素[20]、烏骨雞黑色素[14,21]等對超氧陰離子自由基的清除能力相似。黑色素標(biāo)準(zhǔn)品對超氧陰離子的清除率隨著濃度的提高而逐漸增大，在濃度在0.5mg/mL時，其對超氧陰離子的清除率增大趨于平緩，這與Chen等[23]研究結(jié)果一直。這表明烏鱉黑色素具有一定的超氧陰離子清除能力，但低于陽性對照黑色素標(biāo)準(zhǔn)品的超氧陰離子清除能力。

圖12 烏鱉黑色素清除超氧陰離子自由基能力Fig.12 Superoxide radical scavenging activity of melanin from Chinese soft-shelled turtle

2.3.4 羥自由基清除能力

羥自由基通常產(chǎn)生于抽氫反應(yīng)和加成反應(yīng)過程中，其可輕易通過細(xì)胞膜，并與細(xì)胞內(nèi)的碳水化合物、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[23]。烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品對羥自由基的清除作用如圖13所示，從圖13可以看出，在測試濃度范圍內(nèi)(0.1 ～ 2.0 mg/mL)對羥自由基的清除率隨著濃度的增大而增大，其中黑色素標(biāo)準(zhǔn)品在0.5 mg/mL時對羥自由基清除率趨于平緩；烏鱉黑色素質(zhì)量濃度在2 mg/mL時，對羥自由基的清除率達(dá)到48.44%，這表明烏鱉黑色素對羥自由基的清除能力低于陽性對照組黑色素標(biāo)準(zhǔn)品的清除能力，烏鱉黑色素的羥自由基清除能力與大鯢皮膚黑色素[8]、林蛙卵黑色素[20]、烏骨雞黑色素[14,21]等黑色素的清除能力相似。

圖13 烏鱉黑色素清除羥自由基能力 Fig.13 Hydroxide free radical scavenging activity of melanin from Chinese soft-shelled turtle

3 結(jié)論

動物中黑色素與蛋白質(zhì)的緊密相連、不易分離，要獲得比較純凈的黑色素，就必須盡可能去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。因此，本研究采用“脫脂-酶解-酸解”三步法精制烏鱉黑色素，減少多余雜質(zhì)對烏鱉黑色素結(jié)構(gòu)分析、理化性質(zhì)和抗氧化活性的影響。通過烏鱉黑色素紫外可見光掃描圖譜(215 nm處有特征吸收峰)、傅里葉紅外掃描圖譜(3 400 cm-1和1 600 cm-1處附近有較強(qiáng)的吸收峰，是以吲哚結(jié)構(gòu)為主體)和元素組成分析(S∶N為 0.05，以真黑色素為主)等結(jié)構(gòu)特性顯示均具有非常典型黑色素典型特征，結(jié)構(gòu)完整。這些結(jié)果表明，本試驗獲得的烏鱉黑色素純度高、結(jié)構(gòu)完整，可完全滿足烏鱉黑色素的理化性質(zhì)和抗氧化活性等方面的研究。

烏鱉黑色素具有黑色素典型的性質(zhì)：色差計測得黑色素粉末呈黑色，略帶黃色；不溶于水、酸液和一般的有機(jī)溶劑，微溶于二甲基亞砜，溶于堿性溶液；烏鱉黑色素在一定時間段內(nèi)(1 h)具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性，長時間存放可引起黑色素活性損失。另外，烏鱉黑色素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，隨溶解液質(zhì)量濃度的增加而增大。其中，質(zhì)量濃度在2.0 mg/mL時，烏鱉黑色素溶液總抗氧化能力在77%左右，羥自由基清除率和DPPH自由基清除率均在40%以上，說明烏鱉黑色素具有一定的抗氧化作用。該研究結(jié)果有利于黑色素的有效提取利用和產(chǎn)品開發(fā)等研究提供可靠的科學(xué)依據(jù)，從而對大幅增加烏鱉的藥用資源的附加值，發(fā)掘我國的優(yōu)秀物種資源，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和現(xiàn)實意義。