趙菲菲，李 靖，徐國波,，王永林，席曉嵐，廖尚高,*

1貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550004；2貴陽市第一人民醫(yī)院藥劑科，貴陽 550001；3貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴陽 550004

白及為蘭科植物白及(Bletillastriata(Thunb.) Reichb.F.)的干燥塊莖，又名甘根、白根、地螺絲等，是《中國藥典》收載的常用中藥之一，具有收斂止血、清熱利濕、消腫生肌之功效，臨床上主要用于咯血、吐血、外傷出血等治療[1,2]。化學(xué)研究表明白及藥材中除含有大量多糖類物質(zhì)外，還含有較多的非多糖類物質(zhì)，如芪類、聯(lián)芐類、菲類、聯(lián)菲類等近五十種化學(xué)成分[3-8]。近年來，我國科研人員對白及藥材的藥理研究主要集中在白及的多糖部分，但隨著白及藥材中化學(xué)成分研究的不斷深入，白及非多糖部分也成為藥理活性研究熱點(diǎn)。本課題組在前期研究中已證實(shí)BS-80EE[9-12]具有良好的止血藥效，它可顯著縮短肝素化的小鼠出血時間和凝血時間(CT)；可刺激大鼠血小板的活化，使血小板聚集作用增強(qiáng)；可作用于凝血纖溶系統(tǒng)，加速血液的凝固，抑制纖維蛋白降解，同時使血液黏度增加，血流速度變慢而發(fā)揮止血作用。但BS-80EE發(fā)揮止血的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，因此本研究采用超高壓液相色譜-電噴霧-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-ESI-Q-TOF MS)對BS-80EE中的化學(xué)成分進(jìn)行分析，明確其主要化學(xué)成分，并采用ADP、THR誘導(dǎo)的血小板聚集實(shí)驗(yàn)和小鼠CT實(shí)驗(yàn)對已確認(rèn)的化學(xué)成分進(jìn)行止血活性評價，以期初步闡明BS-80EE發(fā)揮止血的活性物質(zhì)。

1 材料與試劑

1.1 動物

SPF級KM小鼠(雌雄各半)，體質(zhì)量20～22 g；SPF級SD大鼠(雌雄各半)，體質(zhì)量200～240 g；均由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)中心提供，許可證號：SCXK(黔)2012～0001。實(shí)驗(yàn)動物在室溫22～24 ℃，相對濕度為60%條件下自由攝食飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。

1.2 藥品與試劑

白及非多糖組分(BS-80EE)(實(shí)驗(yàn)室自制[9])；硫酸魚精蛋白注射液(批號09150303，北京悅康凱悅制藥有限公司)；酚磺乙胺注射液(批號20160715，國藥集團(tuán)容生制藥有限公司)；水合氯醛(批號20151220，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；ADP(批號91M7002V，Sigma公司)；凝血酶(THR，批號20160921，北京索萊寶科技有限公司)；甲醇(色譜純，德國Merck 公司)；乙腈(色譜純，德國Merck 公司)；甲酸(美國TEDIA有限公司，色譜純)；純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；對照品4-hydroxymethylphenylβ-D-glucoside、α-isobutylmalic acid、blestroside、dactylorhin A、gymnosides I、militarine、4,7-dihydroxy-2-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene、gymnosides V、gymnosides Ⅸ、4,7-dihydroxy-p-hydroxybenzyl-2-methoxy-9,10-dihydrophena nthrene armatuside以及1-p-hydroxybenzyl -4-methoxyphenanthrene-2,7-diol均為實(shí)驗(yàn)室自制(純度≥95%)。

1.3 儀器

LGPABEER型血小板聚集凝血因子分析儀(北京世帝科學(xué)儀器公司)；ESI-Q-TOF MS(布魯克道爾頓電噴霧-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀，包括Metabolite ToolsTM、MDF技術(shù)等)；Agilent Technologies 1290 Infinity液相色譜系統(tǒng)(配有1290 Infinity二元泵，高性能自動進(jìn)樣器，二級管陣列檢測器，柱溫箱)；Multifuge X3R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；METTLER AE240十萬分之一電子天平(梅特勒-脫利多儀器上海有限公司)。

1.4 供試品配制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品

分別稱取上述12種對照品適量，加入甲醇至1 mL超聲溶解，10 000 rpm離心10 min，取上清液于進(jìn)樣瓶中備用，即得混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2 BS-80EE溶液

稱取2 mg的BS-80EE，用甲醇2 mL超聲溶解，10 000 rpm離心10 min，取上清液于進(jìn)樣瓶中備用。

1.4.3 硫酸魚精蛋白注射液

取適量硫酸魚精蛋白注射劑，用生理鹽水稀釋，配成0.16 mg/mL濃度，臨用前配制。

1.4.4 肝素鈉注射液

取適量肝素鈉注射劑，用生理鹽水稀釋，配成16 U/mL活性濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.5 酚磺乙胺注射液

取適量酚磺乙胺注射劑，用生理鹽水稀釋，配成5 mg/L活性濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.6 白及各單體化合物

分別稱取白及各單體化合物100 mg或80 mg溶于20 mL生理鹽水中，超聲溶解，配制成5 mg/mL或40 mg/mL濃度，備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 BS-80EE化學(xué)成分分析

2.1.1 色譜條件

色譜柱 Waters BEH C18(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)柱，柱溫：45 ℃，流動相：0.1% 甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，洗脫梯度見表1，進(jìn)樣體積2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源(ESI)，掃描方式為正、負(fù)離子掃描(ESI+、ESI-，m/z50～1 500)；毛細(xì)管電壓(正離子模式4 kV，負(fù)離子模式3.5 kV)，錐孔電壓：80 V，離子源溫度：110 ℃，霧化氣(N2)壓力：1.3 bar，流速：6.0 L/min，溫度:200 ℃，脫溶劑氣溫度：300 ℃，氣體體積流量：50 L/h，脫溶劑氣體積流量：550 L/h，準(zhǔn)確質(zhì)量測定采用甲酸鈉校正標(biāo)準(zhǔn)液，校正模式選用：Enhanced Quadratic。數(shù)據(jù)用HystarPP軟件(BrukerDaltoniks)進(jìn)行分析。

表1 洗脫梯度表

2.2 ADP、THR誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集率的測定

取SD大鼠數(shù)只，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，使用3.8%枸櫞酸鈉抗凝真空采血管大鼠腹主動脈釆集血樣。將血樣800 rpm離心10 min，分離上層血漿即得富血小板血漿(PRP)，余下血液部分3 000 rpm離心10 min，分離上層血漿即得貧血小板血漿(PPP)，用PPP調(diào)PRP中血小板的計數(shù)為(2～3)×1011/L。用PPP調(diào)零后，取PRP 290 μL與各單體化合物(5 mg/mL)10 μL于37 ℃共同孵育60 s，加入終濃度為5 μmol/L ADP或10 U/L THR 10 μL，記錄5 min內(nèi)血小板的最大聚集率。

2.3 肝素化小鼠凝血時間(CT)的測定

取KM小鼠120只(雌雄各半)，隨機(jī)分為12組，每組10只，分為空白對照組(control，Con)、模型組(model，Mod)、魚精蛋白組(protamine sulfate，PS)(1.6 mg/kg)、白及各單體(40 mg/kg)。各組小鼠每天尾靜脈給藥1次，空白組、模型組、魚精蛋白組給予生理鹽水20 mL/kg，其余各組給予相應(yīng)劑量的藥物，連續(xù)5天。第5天，給藥60 min后除空白組外均尾靜脈注射肝素鈉，3.2 U/只(魚精蛋白組15 min后尾靜脈注射魚精蛋白)，60 min后用內(nèi)徑1 mm，長10 cm的毛細(xì)玻璃管從小鼠內(nèi)眼球后靜脈叢取血，待血液充滿玻璃管時開始計時，接著每隔30 s折斷兩端毛細(xì)玻璃管(約0.5 cm)，并緩慢向左右拉開，觀察折斷處有無血凝絲出現(xiàn)，從血液充滿玻璃管開始至出現(xiàn)血凝絲所經(jīng)歷的時間作為小鼠凝血時間(CT),記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 BS-80EE中化學(xué)成分分析

利用UHPLC-ESI-Q-TOF MS對BS-80EE化學(xué)成分進(jìn)行檢測分析，共表征了18個化學(xué)成分(見圖1)。在正離子模式下，通過比較BS-80EE樣品和對照品的保留時間(tR)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)(見表2)，確定了BS-80EE中的11個化合物(1、5、6、7、8、10、11、14、16、17和18，結(jié)構(gòu)見圖2)；在負(fù)離子模式下與對照品的保留時間(tR)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比，確定了6個化合物(1、3、7、8、10和18)。由圖1中的A、C色譜圖可知，BS-80EE中含量較大的化合物有2、3、5、7、8、10、17、18，為BS-80EE的主要成分。

3.2 BS-80EE中單體成分對ADP、THR誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的影響

對BS-80EE中12個化合物進(jìn)行止血活性評價，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與空白組相比，陽性藥酚磺乙胺(etamsylate，Etam))可顯著增加ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集率(P<0.01)，對THR誘導(dǎo)的血小板聚集無顯著影響(P>0.05)。

對ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集反應(yīng)，與空白組相比，化合物1、5、7、14和17均可顯著增加血小板聚集率(P<0.05或0.01)，化合物3、10、11、18顯著抑制血小板聚集率(P<0.01)，化合物6、8、16則對血小板聚集反應(yīng)無顯著影響(P>0.05)(見圖3)。

對THR誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集反應(yīng)，與空白組相比，化合物1、5、6、7、8、11、14和17均可顯著增加血小板聚集率(P<0.05或0.01)，化合物3、18顯著抑制血小板聚集率(P<0.01)，化合物10、16則對血小板聚集反應(yīng)無顯著影響(P>0.05)(見圖4)。

3.3 BS-80EE中單體成分對肝素化小鼠CT的影響

結(jié)合上述BS-80EE化學(xué)成分分析結(jié)果，我們對能夠獲得單體的化合物進(jìn)行了肝素化小鼠體內(nèi)毛細(xì)管凝血時間實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，陽性藥魚精蛋白可顯著縮短肝素化小鼠CT值(P<0.01)，化合物1、3、5、7、8、14和18也可不同程度的顯著縮短肝素化小鼠CT值(P<0.05或0.01)，化合物10、17對肝素化小鼠CT值無顯著影響(P>0.05)(見圖5)。

圖1 BS-80EE(A)和混合標(biāo)準(zhǔn)品(B)在ESI+模式下的TIC色譜圖；BS-80EE(C)和混合標(biāo)準(zhǔn)品(D)在ESI-模式下的TIC色譜圖Fig.1 Total ion current (TIC) chromatograms of BS-80EE (A) and mixed samples (B) in the positive ion mode;TIC chromatograms of BS-80EE (C) and mixed samples (D) in the negative ion mode

表2 BS-80EE中化合物的色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

圖2 BS-80EE中鑒定出的化合物Fig.2 Compounds identified from BS80EE

圖3 BS-80EE中單體成分對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的影響Fig.3 Effects of different compounds from BS-80EE on platelet aggregation induced by ADP in rats s,n =4)注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

圖4 BS-80EE中單體成分對THR誘導(dǎo)的血小板聚集的影響Fig.1 Effects of different compounds from BS-80EE on platelet aggregation induced by THR in rats s,n=4)注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

圖5 BS-80EE中單體成分對肝素化小鼠CT的影響((x ± s,n =10) Fig.5 Effects of different compounds from BS-80EE on CT of heparinized mice s,n =10)注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group.

4 討論

超高壓液相色譜-電噴霧-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-ESI-Q-TOF MS)聯(lián)用技術(shù)是一種同時具備高通量分析檢測及數(shù)據(jù)快速獲取、處理的新型聯(lián)用技術(shù)，具有高效、高靈敏度、專屬性強(qiáng)、檢測模式多樣、分析速度快，并提供豐富的數(shù)據(jù)信息及數(shù)據(jù)處理的特點(diǎn)，該技術(shù)被廣泛用于環(huán)境科學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、中藥化學(xué)成分鑒定等研究之中[13-15]。本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-ESI-Q-TOF MS對BS-80EE中化學(xué)成分進(jìn)行分析，與對照品的保留時間，離子碎片信息進(jìn)行比對，確認(rèn)了BS-80EE中12個化學(xué)成分。

血小板在生理性止血過程中發(fā)揮著重要作用，而血小板活化、聚集是其發(fā)揮止血作用的前提。血小板的活化與激動劑密切相關(guān)，不同的激動劑激活不同的信號傳導(dǎo)通路，進(jìn)而引起血小板的聚集程度也有所差異。THR是一種強(qiáng)誘導(dǎo)劑，它可引起不依賴于顆粒內(nèi)容物的聚集反應(yīng)；弱誘導(dǎo)劑 ADP若要引起不可逆的聚集反應(yīng)需要顆粒內(nèi)容物分泌后的協(xié)助作用[16]，兩者均常用于止血、促凝血藥物的體外活性評價模型[16,17]。BS-80EE可顯著增加血小板的聚集作用，故利用ADP、THR誘導(dǎo)的體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)對BS-80EE中的主要化合物進(jìn)行初步止血活性評價，結(jié)果顯示化合物1、5、7、8、10、14、17可顯著增加ADP或THR誘導(dǎo)的血小板聚集作用，化合物3、18可顯著抑制ADP及THR誘導(dǎo)的血小板聚集作用，且由圖1A、C可知，化合物5、7、8、17在BS-80EE中的峰面積明顯大于化合物3、18，推測BS-80EE中各化合物對血小板聚集的促進(jìn)作用之和明顯大于抑制作用，進(jìn)而使得BS-80EE對血小板聚集表現(xiàn)出促進(jìn)作用。BS-80EE可顯著縮短肝素化小鼠的CT值，故利用較為經(jīng)典、常用的止血藥效篩選指標(biāo)小鼠CT實(shí)驗(yàn)[18]對BS-80EE中主要的且能夠獲得的9個化合物進(jìn)行體內(nèi)藥效驗(yàn)證。結(jié)果顯示化合物1、3、5、7、8、14、18均可顯著縮短肝素化小鼠的CT值，化合物10和17對肝素化小鼠的CT值無明顯影響，各化學(xué)成分的共同作用使BS-80EE表現(xiàn)出明顯的促凝作用。值得注意的是在體外血小板誘導(dǎo)試驗(yàn)中，化合物3、18顯著抑制血小板聚集，化合物10、17顯著增加血小板聚集作用，而在體內(nèi)肝素化小鼠CT實(shí)驗(yàn)時，化合物3、18表現(xiàn)出顯著的促凝作用，10、17則無顯著作用，提示化合物10和17可能只在體外發(fā)揮促凝作用或其在體內(nèi)的促凝作用明顯弱于肝素抗凝作用，而化合物3、18可能抑制血小板系統(tǒng)，但其在體內(nèi)發(fā)揮的共同效應(yīng)表現(xiàn)出促凝作用，故各個單體化合物的止血作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究采用UHPLC-ESI-Q-TOF MS分析確認(rèn)了BS-80EE中12個化學(xué)成分，進(jìn)一步利用ADP、THR誘導(dǎo)的血小板聚集實(shí)驗(yàn)和小鼠CT實(shí)驗(yàn)對其主要成分進(jìn)行初步止血活性評價，發(fā)現(xiàn)化合物1、3、5、7、8、10、14、17、18可顯著增加血小板聚集作用或縮短肝素化小鼠凝血時間，初步闡明了BS-80EE的止血活性物質(zhì)，為白及非多糖組分的深度開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。