李芳宇，齊 濱，邊 帥，趙 月，盧姝言，遲 迅，王佳雯*

1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)人參科學(xué)研究院；3長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)科研處，長(zhǎng)春 130117

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞之一，具有吞噬、抗原呈遞、免疫防御和炎癥調(diào)節(jié)等多種功能[1]。巨噬細(xì)胞主要通過(guò)其表達(dá)的模式識(shí)別受體和病原體并激活相關(guān)分子，從而吞噬病原體。

自噬是一種維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡的過(guò)程,能吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內(nèi)容物,藉此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新[2,3]。自噬在巨噬細(xì)胞吞噬、抗原呈遞、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)過(guò)程中起重要作用[4]。巨噬細(xì)胞自噬功能下降會(huì)影響其吞噬功能。人參具有增強(qiáng)免疫力的作用，在特異性抗體形成、淋巴細(xì)胞增殖及巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)等多方面均有所體現(xiàn)[5]。故本文選用人參根提取物作用于巨噬細(xì)胞RAW264.7，探究其對(duì)巨噬細(xì)胞的自噬水平、增殖能力及吞噬能力影響，為人參根提取物的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Infinite 200 Pro酶標(biāo)儀(瑞士，TECAN公司)；111型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)，Thermo公司)；熒光顯微鏡IX73(日本，Lympus公司)；1645050型蛋白質(zhì)凝膠電泳儀(美國(guó)，Bio-Rad公司)；iBright智能成像系統(tǒng) FL1000(中國(guó)，Invitrogen公司)。

1.2 藥品與試劑

人參藥材采購(gòu)自吉林撫松(采摘時(shí)間為2018年9月20日)，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院肖井雷副教授鑒定為五加科人參屬植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根；DMEM(美國(guó)HyClone公司)；BS緩沖液(美國(guó)Hyclone)；胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)；CCK-8試劑盒(美國(guó)BOSTER)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，美國(guó)Sigma)；中性紅試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；吖啶橙(AO，索萊寶)；AKT、p-AKT、AMPK、p-AMPK、m-TOR、p-mTOR、ULK1、p-ULK1、β-actin兔多克隆抗體(上海Bioword)；ATG7、LC3B兔單克隆抗體(美國(guó)CST公司)；自噬誘導(dǎo)劑rapamycin、自噬抑制劑CQ試劑(美國(guó)MCE公司)。

1.3 方法

1.3.1 人參根提取物制備

精密稱(chēng)取人參50 g，粉碎，過(guò)篩(80目)，料液比1∶10，40 ℃水浴超聲提取2 h，提取液離心過(guò)濾，超濾濃縮；殘?jiān)铀弦罕?∶10，升溫至80 ℃提取1.5 h，提取液超濾濃縮，濃縮液分別凍干，備用。人參根提取物收率為21.58%。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將巨噬細(xì)胞RAW264.7于高糖DMEM完全培養(yǎng)液中(含有10% FBS、1%的鏈霉素和青霉素)，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

前期經(jīng)過(guò)設(shè)置一系列濃度梯度確定了人參根提取物在0～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7無(wú)毒性，且能夠通過(guò)濃度梯度依賴(lài)性的方式提高細(xì)胞活性(數(shù)據(jù)未顯示)。因此本實(shí)驗(yàn)選用32、125、500 μg/mL三個(gè)濃度作為低中高劑量進(jìn)行研究。

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL，100 μL/孔接種于96孔板中，于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，加入質(zhì)量濃度分別為(32、125、500 μg/mL)的人參根提取物，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(完全培養(yǎng)液、細(xì)胞)和1 μg/mL的LPS陽(yáng)性對(duì)照組；培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL的CCK8于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育40 min，用酶標(biāo)儀在490 nm出測(cè)定吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)存活率。

相對(duì)細(xì)胞存活率=[(實(shí)驗(yàn)組孔吸光值-空白組孔吸光值)/(對(duì)照組孔吸光值-空白組孔吸光值)]

×100%

1.3.4 中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)

將密度為1×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL于CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，加入質(zhì)量濃度分別為(32、125、500 μg/mL)的人參根提取物，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(完全培養(yǎng)液、細(xì)胞)和1 μg/mL的LPS陽(yáng)性對(duì)照組；培養(yǎng)24 h后，吸出上清液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，每孔加入培養(yǎng)液200 μL和中性紅染液20 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h；棄除上清液，再用PBS洗滌2次，每孔加入200 μL裂解液，室溫?fù)u床裂解10 min，用酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按公式計(jì)算吞噬指數(shù)。

吞噬指數(shù)=實(shí)驗(yàn)組A540nm/空白對(duì)照組A540nm

1.3.5 AO染色實(shí)驗(yàn)

將密度為1×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2 mL于CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，加入質(zhì)量濃度分別為(32、125、500 μg/mL)的人參根提取物，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(完全培養(yǎng)液、細(xì)胞)和500 nM的rapamycin陽(yáng)性對(duì)照組；培養(yǎng)24 h后，吸出上清液，PBS緩沖溶液洗3次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，棄上清，PBS緩沖溶液洗3次，加入終濃度為15 μg/mL的AO，室溫避光孵育15 min，棄上清，PBS緩沖溶液洗3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)并照相。

1.3.6 Western blot檢測(cè)RAW264.7 細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)

將密度為1×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2 mL于CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，加入質(zhì)量濃度分別為(32、125、500 μg/mL)的人參根提取物，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(完全培養(yǎng)液、細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，離心(1 000 rpm，5 min)，棄上清，PBS緩沖溶液洗3次，加入細(xì)胞裂解液。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度。電泳分離，轉(zhuǎn)膜(NC膜)、封閉30 min后，一抗孵育4 ℃過(guò)夜，回收一抗，PBST洗3次，二抗室溫孵育1 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，進(jìn)行顯色觀察條帶。

1.3.7 自噬對(duì)細(xì)胞增殖及吞噬能力影響檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

將密度為1×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL于CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，設(shè)置空白對(duì)照組(完全培養(yǎng)液、細(xì)胞)、單獨(dú)給藥組125 μg/mL人參根提取物、500 nM的rapamycin和125 μg/mL人參根提取物共同給藥組、50 μM的CQ和125 μg/mL人參根提取物共同給藥組；500 nM rapamycin組、50 μM CQ組，培養(yǎng)24 h后，分別按照“1.3.3”與“1.3.4”實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖率檢測(cè)

由圖1可知，與對(duì)照組比較，人參根提取物濃度為(32、125、500 μg/mL)和LPS陽(yáng)性組均能提高巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖率(P<0.05，P<0.01)，由此可見(jiàn)人參根提取物可直接刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖。

圖1 人參根提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖的影響Fig.1 Effect of Ginseng root extract on RAW264.7 proliferation of macrophages )注：A：空白對(duì)照組；B：32 μg/mL人參根提取物；C：125 μg/mL人參根提取物；D：500 μg/mL人參根提取物；E：陽(yáng)性對(duì)照組。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。下同。Note:A:Blank control group;B:32 μg/mL ginseng root extract;C:125 μg/mL ginseng root extract;D:500 μg/mL ginseng root extract;E:Positive control group.Compared with the blank group,*P <0.05,**P <0.01.The same below.

圖2 人參根提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬活性的影響Fig.2 Effect of ginseng root extract on macrophage

2.2 巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬活性檢測(cè)

由圖2可知，與空白對(duì)照組相比，當(dāng)人參根提取物濃度為32 μg/mL時(shí)，人參根提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬活性的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)人參根提取物濃度為125、500 μg/mL時(shí)則可提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性，且與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.01)，該結(jié)果表明，一定濃度的人參根提取物可提高巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬能力。

2.3 巨噬細(xì)胞RAW264.7中酸性囊泡的水平檢測(cè)

AO染色被認(rèn)為是標(biāo)記自噬溶酶體的特異性方法，當(dāng)自噬水平較低時(shí)，主要觀察到綠色熒光；當(dāng)自噬水平升高時(shí)，紅色熒光將增強(qiáng)。由圖3可知，與空白對(duì)照相比，隨著人參根提取物濃度的增加，合并后的熒光顏色由綠色逐漸過(guò)渡到黃色，說(shuō)明自噬水平升高。

圖3 人參根提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7中自噬體數(shù)量的影響(×20)Fig.3 Effect of ginseng root extract on the number of autophagosomes in RAW264.7(×20)

2.4 巨噬細(xì)胞RAW264.7自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

由圖4可知，與空白對(duì)照組相比，125、500 μg/mL人參根提取物組巨噬細(xì)胞RAW264.7中ATG7和p-ULK1的表達(dá)提高、LC3B I向LC3B II的轉(zhuǎn)化增加，進(jìn)一步說(shuō)明自噬被誘導(dǎo)。同時(shí)p-AMPK蛋白表達(dá)明顯升高，而p-mTOR和p-AKT表達(dá)降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)。說(shuō)明人參根提取物通過(guò)促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白的增加并激活A(yù)MPK /mTOR和AKT/mTOR信號(hào)通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7發(fā)生自噬。

圖4 人參根提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of ginseng root extract on autophagy-related protein expression in macrophage

2.5 自噬抑制劑中和了人參根提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖以及吞噬活性的增強(qiáng)作用

由圖5、6可知，與空白對(duì)照組相比，單獨(dú)給藥組(人參根提取物濃度為125 μg/mL)和單獨(dú)加入自噬誘導(dǎo)劑(rapamycin)組可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖以及吞噬能力增強(qiáng)(P<0.01)，單獨(dú)加入自噬抑制劑(CQ)組則降低可巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖以及吞噬能力(P<0.05)；與單獨(dú)給藥組相比，rapamycin與人參根提取物共處理可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖以及吞噬能力(P<0.01)；與單獨(dú)給藥組相比，人參根提取物與自噬抑制劑(CQ)共處理后，巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖以及吞噬能力明顯降低(P<0.05，P<0.01)。由此可見(jiàn)，人參根提取物可能通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞RAW264.7的自噬水平，提高細(xì)胞的增殖以及吞噬能力。

圖5 自噬抑制劑中和了人參根提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖的影響Fig.5 Effect of ginseng root extract on RAW264.7 proliferation of macrophages neutralized by 注：F：125 μg/mL人參根提取物+rapamycin；G：125 μg/mL人參根提取物+CQ；H：Rapamycin；I：CQ，下同。Note:F:125 μg/mL ginseng root extract +rapamycin;G:125 μg/mL ginseng root extract +CQ;H:Rapamycin;I:CQ,the same below.

圖6 自噬抑制劑中和了人參根提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬活性的增強(qiáng)作用Fig.6 Autophagy inhibitors neutralize ginseng root extract against macrophage RAW264.7 enhancement

3 討論

增殖是免疫細(xì)胞分化成多種功能表型并在免疫應(yīng)答中發(fā)揮相應(yīng)作用的前提與基礎(chǔ)，吞噬作用則是巨噬細(xì)胞等吞噬細(xì)胞清除外源性病原微生物和內(nèi)源性衰老和死亡細(xì)胞的重要手段[6]。在本研究中，一定質(zhì)量濃度的人參根提取物能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其吞噬能力，表明人參根提取物能夠通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖，以及提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，從而達(dá)到免疫調(diào)節(jié)作用。

自噬是一種保守的細(xì)胞降解途徑。自噬利用溶酶體降解自身受損細(xì)胞器及大分子物質(zhì),其產(chǎn)生的氨基酸和小分子物質(zhì)被重新利用,從而實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)和內(nèi)環(huán)境平衡[7]。自噬形成時(shí)，胞漿型LC3會(huì)酶解一小段多肽形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ與PE結(jié)合形成(自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ)[8]，因此，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低，當(dāng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，細(xì)胞內(nèi)LC3的含量及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化明顯增強(qiáng)。自噬相關(guān)蛋白7(autophagy related protein7，Atg7)在自噬過(guò)程中可以促進(jìn)自噬性溶酶體的形成和受損線粒體的分解[9]。

AMPK /mTOR與Akt/mTOR是兩條經(jīng)典的自噬信號(hào)通路[10,11]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一種絲/蘇氨酸激酶，其活化(磷酸化)后可抑制mTOR活性，提高細(xì)胞自噬水平[12]。蛋白激酶B(Akt或稱(chēng)PKB)同樣也是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，其可協(xié)同磷脂酰肌醇依賴(lài)性蛋白激酶1/2促進(jìn)三磷酸磷脂酰肌醇與其自身結(jié)合，Akt由胞漿轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜并發(fā)生活化(磷酸化)，Akt活化后可激活下游蛋白mTOR(使其磷酸化)，從而抑制自噬的進(jìn)程[11]。

研究結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞RAW264.7中Atg7、LC3蛋白表達(dá)量增加，p-AKT、p-mTOR表達(dá)減少，AMPK磷酸化水平增加，與對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明人參根提取物通過(guò)多種途徑參與調(diào)解巨噬細(xì)胞RAW264.7的自噬反應(yīng)。 自噬在巨噬細(xì)胞行使功能過(guò)程中具有重要作用。通過(guò)自噬調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)自噬水平，可以增強(qiáng)或中和人參根提取物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7功能的影響。

綜上所述，人參根提取物能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖，增強(qiáng)其吞噬功能，通過(guò)AMPK/mTOR和AKT/mTOR信號(hào)通路，提高巨噬細(xì)胞RAW264.7的自噬水平，兩者具有相關(guān)性。本研究為人參根提取物在細(xì)胞自噬、免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)，但其作用的分子機(jī)制仍有待進(jìn)行深入研究。