郭永春，王淑燕，王鵬杰，陳金發(fā)，周 鵬，歐陽(yáng)立群，趙 峰，葉乃興*

1福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；2福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122；3國(guó)家茶葉質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，安溪 362400；4福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福州 350002

茶樹(shù)Camelliasinensis(L.) O.Kuntze是一種多年生葉用經(jīng)濟(jì)作物，在世界上多個(gè)國(guó)家被廣泛種植[1]。雜草可與茶樹(shù)爭(zhēng)奪肥水和生長(zhǎng)空間，影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)[2]，草甘膦是一種常見(jiàn)的內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，具有高效、廉價(jià)和殺草譜廣等優(yōu)點(diǎn)，近幾十年來(lái)在茶園雜草管理中被廣泛應(yīng)用[1]?，F(xiàn)階段，我國(guó)的福建、貴州等部分省份已通過(guò)地方法規(guī)限制茶園使用草甘膦，但生產(chǎn)中依舊難以避免由于不合理用藥導(dǎo)致的茶園草甘膦污染[3]。

草甘膦具有廣譜性，在殺滅雜草的同時(shí)，也會(huì)被作物根部吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)至全株，影響作物生長(zhǎng)代謝[4]。其作用機(jī)理是通過(guò)干擾植物莽草酸代謝途徑，影響芳香氨基酸的合成，使植物代謝紊亂，因此草甘膦作用于植物莽草酸代謝的過(guò)程必然會(huì)影響農(nóng)作物的品質(zhì)[5]。已有研究表明，草甘膦施用后，玉米[6]、馬鈴薯[5]和柑橘[7]等農(nóng)作物的產(chǎn)量下降。也有學(xué)者開(kāi)始關(guān)注草甘膦對(duì)茶樹(shù)生長(zhǎng)和代謝的影響，例如，Gao等[8]指出，茶園施用田間推薦劑量的草甘膦除草劑后，茶樹(shù)地上部未有藥害表征；Tong等[9]通過(guò)水培體系研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦經(jīng)茶樹(shù)根部吸收后轉(zhuǎn)運(yùn)到葉部，極有可能是茶葉中草甘膦殘留的主要途徑。本課題組前期通過(guò)對(duì)幼齡和成年茶樹(shù)施用草甘膦發(fā)現(xiàn)，噴灑到土壤的草甘膦被茶樹(shù)根部吸收后，經(jīng)莖部轉(zhuǎn)運(yùn)富集至葉部[10]。目前，草甘膦的施用對(duì)茶樹(shù)葉片主要生化成分(如：氨基酸、兒茶素和生物堿)的具體影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)觀察草甘膦施用后茶樹(shù)葉片的表觀藥害，并對(duì)草甘膦施用前(0天)和施用后(7和33天)茶樹(shù)葉片中的農(nóng)藥殘留(草甘膦和氨甲基膦酸)及主要生化成分(兒茶素、生物堿和氨基酸)進(jìn)行定量測(cè)定，從而探究草甘膦施用后茶樹(shù)葉片的表觀藥害、草甘膦在茶樹(shù)葉片中的代謝情況及其施用對(duì)茶葉主要生化成分的具體影響，相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果可為草甘膦在茶葉生產(chǎn)質(zhì)量的安全管控方面提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料處理及制備

以全國(guó)優(yōu)良品種金觀音(C.sinensis‘Jin-guanyin’)一年生茶樹(shù)為試驗(yàn)材料，將泥炭土和珍珠巖按照1∶1(體積比)混勻后作栽培基質(zhì)。將茶樹(shù)植于體積為2 L的盆缽并進(jìn)行2個(gè)月的適應(yīng)性培養(yǎng)，選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的植株，于2019年10月將草甘膦異丙胺鹽定量施于栽培基質(zhì)上，具體方法為：(1)分別將45、450和900 mg/mL的草甘膦施于栽培基質(zhì)(每單位體積土壤基質(zhì)的施用量，即濃度分別為0.3 mg/mL(低于推薦施用濃度)、3 mg/mL(推薦施用濃度)和6 mg/mL(高于推薦施用濃度)的草甘膦在每個(gè)盆缽(2 L)定量噴施300 mL)，取茶樹(shù)葉片進(jìn)行藥害表征觀察。(2)將45 mg/mL的草甘膦施于栽培基質(zhì)(濃度為0.3 mg/mL的草甘膦在每個(gè)盆缽(2 L)定量噴施300 mL)，分別于0(施用前)、7和33天采集茶樹(shù)嫩梢第二三葉(每個(gè)時(shí)期6次生物學(xué)重復(fù))，采集后的樣品以液氮速凍，通過(guò)冷凍干燥機(jī)干燥后，放入研缽磨碎成粉，用于農(nóng)藥殘留及茶葉品質(zhì)化學(xué)組分的測(cè)定。

1.1.2 儀器與試劑

儀器：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS，美國(guó)Agilent公司)；超高效液相色譜串聯(lián)-飛行時(shí)間質(zhì)譜連用儀(UPLC-TOF-MS，美國(guó)Wateser-G2-S公司)。

試劑：草甘膦異丙胺鹽(有效成分30%，山東三農(nóng)生物科技有限公司)；草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品草甘膦內(nèi)標(biāo)(1，2-C13N15草甘膦，上海安譜有限公司)；乙酸銨、甲酸和36%鹽酸(色譜純，西隴科學(xué)股份有限公司)；十水四硼酸鈉和磷酸二氫鉀(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)；甲酸銨(試劑級(jí)，西隴科學(xué)股份有限公司)；乙腈和甲醇(色譜級(jí)，山東禹王和天下新材料有限公司)；氯甲酸-9-芴基甲酯(FMOC-Cl，分析純，純度不低于99.0%，上海源葉生物科技有限公司)；60 mg/3 mL陽(yáng)離子交換柱(PCX,博納艾杰爾科技公司)；氨基酸衍生試劑盒(美國(guó)Waters公司)。

茶氨酸(theanine，Thea)、天冬酰胺(asparagine，Asn)、谷氨酰胺(glutamine，Glu)、豆葉氨酸和L-胱氨酸購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)公司；氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，包括：天冬氨酸(aspartic acid，Asp)、谷氨酸(glutamic acid，Glu)、絲氨酸(serine，Ser)、甘氨酸(glycine，Gly)、組氨酸(histidine，His)、蘇氨酸(threonine，Thr)、丙氨酸(alanine，Ala)、精氨酸(arginine，Arg)、色氨酸(tryptophan，Try)、脯氨酸(proline，Pro)、酪氨酸(tyrosine，Tyr)、纈氨酸(valine，Val)、蛋氨酸(methionine，Met)、賴(lài)氨酸(lysine，Lys)、苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)、瓜氨酸(citrulline，Cit)、肌氨酸(sarcosine，Sar)、異亮氨酸(isoleucine，Ile)、乙醇胺(ethanolamine，EOHNH2)、鳥(niǎo)氨酸(ornithine，Orn)、DL-β-氨基異丁酸(β-aminoisobutyric acid，β-AiBA)、l-α-氨基己二酸(α-aminoadipate，α-AAA)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、L-亮氨酸(leucine，Leu)、羥賴(lài)氨酸(hydroxylysine，Hy-Pro)、L-肌肽、半胱氨酸、羥基-L-脯氨酸、尿素、鵝肌肽、牛磺酸、δ-1-甲基-L-組氨酸、高胱氨酸、L-α-氨基丁酸、3-甲基-L-組氨酸、β-丙氨酸、L-肌酸酐、胱硫醚、氯化銨；兒茶素(catechin，C)、表兒茶素(epicatechin，EC)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)、表沒(méi)食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)、沒(méi)食子兒茶素(gallocatechin，GC)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(gallic acid catechin gallate，GCG)、兒茶素沒(méi)食子酸酯(catechin gallate，CG)等8種兒茶素單體標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自香港Farco chemical supplies公司；茶葉堿和咖啡堿(caffeine，CA)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自香港Farco chemical supplies公司；可可堿(theobromine，TB)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Stanford Chemicals公司，標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 草甘膦及氨甲基磷酸的測(cè)定

按照SN/T 3983-2014《出口食品中氨基酸類(lèi)有機(jī)磷除草劑殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》以UPLC-MS/MS測(cè)定樣品中的草甘膦及其主要代謝物氨甲基膦酸的含量。

1.2.2 游離氨基酸及其衍生物的測(cè)定

按照Chen等[11]的方法，具體如下：稱(chēng)取0.050 g待測(cè)茶樣，加純水定容至5 mL，渦旋混勻，于25 ℃超聲提取30 min，上清液移入離心管離心5 min，取10 μL經(jīng)0.22 μm PTFE濾膜過(guò)濾的提取液與70 μL AccQ-Fluor硼酸鹽緩沖液(PH=8.8)混合，加入20 μL AccQ-Fluor試劑(3 g/L)，渦旋后于55 ℃烘箱中反應(yīng)10 min，冷卻至室溫后采用UPLC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定。

色譜條件：HSS T3 C18色譜柱(Waters,2.1×150 mm,1.8 μm)；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相A：甲酸銨水溶液(10 mmol/L)，流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；洗脫梯度：0～12 min，0%→20% B；12～16 min，20%→35% B；16～18 min，35%→90% B；18～20 min，90%→5% B；進(jìn)樣體積：0.5μL。質(zhì)譜條件：電噴霧電離，正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；電噴霧電壓，4.5 kV；氣簾氣壓力：0.21 MPa；霧化氣壓力：0.38 MPa；輔助氣壓力：0.38 Mpa；輔助氣溫度550 ℃。

1.2.3 生物堿和兒茶素組分的測(cè)定

按照Z(yǔ)hou等[12]的方法，具體如下：稱(chēng)取0.100 g待測(cè)茶樣，加提取液(甲醇∶乙腈∶水=2∶1∶3，V/V)定容至5mL，渦旋后于室溫下超聲提取30 min，15 000 rpm離心3 min，取上清液至離心管，過(guò)0.22 μm PTFE濾膜后采用超高效液相色譜串聯(lián)-飛行時(shí)間質(zhì)譜連用儀UPLC-TOF-MS進(jìn)行測(cè)定。

色譜條件：HSS T3色譜柱(Waters,100×2.1 mm，1.8 μm)；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相 A：0.1 %甲酸，流動(dòng)相 B：乙腈；流速：0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～10 min，95%→75% B；10～13 min，75%→48% B；13～15 min，48%→20% B；15～15.01 min，20%→5% B；15.01～17 min，5%B；17～17.01 min，5%→95% B；進(jìn)樣體積：5 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧電離，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；掃描范圍：50～1 200 Da；離子源溫度：120 ℃；去溶劑化溫度：400 ℃；去溶劑化流速：800 L/h。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

通過(guò)Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示每個(gè)處理組的試驗(yàn)結(jié)果；采用IBM SPSS Statistics 19.0的ANOVA進(jìn)行組間差異顯著性分析；將游離氨基酸、生物堿和兒茶素的定量結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后以Tbtools繪制熱圖；采用SIMCA P 14.1軟件進(jìn)行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)；采用Origin 2019軟件作柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦施用后茶樹(shù)葉片的藥害表征及其殘留

由圖1A可知，45、450和900 mg/L的草甘膦施用33天，相較于未施藥前(0天)，茶樹(shù)生長(zhǎng)正常，葉片未出現(xiàn)干枯、皺縮和脫落等常見(jiàn)藥害表征?，F(xiàn)階段，國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2019規(guī)定茶葉中草甘膦的最大殘留限量(maximum residue limits，MRLs)為1.0 mg/kg[3]，如圖1 B所示，即使在45 mg/L較低施藥劑量下，茶樹(shù)葉片在7天和33天均檢測(cè)到草甘膦及其主要代謝物氨甲基膦酸(aminomethylphosphonic acid，AMPA)殘留。葉片中的草甘膦含量在7天較高，達(dá)到2.6 mg/kg(大于MRLs)，在33天已降低至0.33 mg/kg(小于MRLs)；AMPA含量在7天達(dá)0.21 mg/kg，在33天降低至0.08 mg/kg。

圖1 草甘膦施用不同時(shí)間后的葉片表征(A)及茶樹(shù)葉片中的草甘膦和氨甲基膦酸含量(B)Fig.1 Observation of the phytotoxicity (A) and the content of PMG and AMPA in tea leaves (B) under the spraying of PMG at different times

2.2 草甘膦對(duì)茶樹(shù)葉片游離氨基酸含量的影響

本試驗(yàn)樣品共定量到28個(gè)游離氨基酸組分(見(jiàn)表1)，其中的27個(gè)游離氨基酸組分的含量在施藥后發(fā)生顯著性變化(P<0.05)，游離氨基酸總量在草甘膦施藥7天和33天均顯著降低(P<0.05)。茶氨酸的含量在7天和33天下降較明顯，降幅分別達(dá)到38.03%和62.03%；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的含量在草甘膦施用后7天升高，在施用后33天降低并低于施用前(0天)。此外，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、組氨酸、蛋氨酸、鳥(niǎo)氨酸的含量在7天和33天均顯著降低；肌氨酸、羥脯氨酸、賴(lài)氨酸和精氨酸的含量在草甘膦噴施后7天變化不顯著，在3天后顯著上升；蘇氨酸、丙氨酸和γ-氨基丁酸在7天變化不顯著，在33天顯著降低；脯氨酸、纈氨酸、天冬酰胺、異亮氨酸、乙醇胺、L-2-氨基己二酸和絲氨酸的含量在7天顯著升高，在33天顯著降低；β-氨基異丁酸和亮氨酸在7天顯著升高，在33天變化不顯著。

表1 草甘膦施用對(duì)茶樹(shù)葉片游離氨基酸組分含量的影響(n=6)

2.3 草甘膦對(duì)茶樹(shù)葉片兒茶素類(lèi)化合物含量的影響

本試驗(yàn)共有6個(gè)兒茶素組分的含量高于定量限(見(jiàn)表2)，其中，6個(gè)兒茶素組分的樣品組間存在顯著性差異(P<0.05)，兒茶素總量在草甘膦施用后7天和33天均顯著下降。此外，草甘膦施用后，C和EC的含量在7天降低，在33天升高；而EGC和GC的含量在7天升高，在33天降低；ECG和EGCG(酯型兒茶素)的含量在7天和33天均下降。

表2 草甘膦施用對(duì)茶樹(shù)葉片兒茶素組分含量的影響(n=6)

2.4 草甘膦對(duì)茶樹(shù)葉片生物堿類(lèi)化合物含量的影響

本試驗(yàn)樣品共定量到2個(gè)生物堿組分(見(jiàn)表3)，2種生物堿組分的樣品組間均存在顯著性差異(P<0.05)，生物堿總量在草甘膦施用后7天顯著升高，在33天顯著下降?？煽蓧A的含量在7天和33天均持續(xù)性地顯著降低，而咖啡堿的含量在7天顯著上升，在33天顯著降低且低于處理前(0天)。

2.5 草甘膦對(duì)茶樹(shù)葉片主要生化成分影響的多元統(tǒng)計(jì)分析

2.5.1 熱圖可視化分析

為更直觀地反映各組間樣品的含量變化規(guī)律及組內(nèi)樣品的聚集模式，將上述生物堿、兒茶素和游離氨基酸組分的定量結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并繪制熱圖。如圖2所示，組內(nèi)樣品聚集良好，組間樣品得以完全區(qū)分。36種化學(xué)組分按照其含量變化特征聚為兩類(lèi)：A類(lèi)中的7個(gè)組分含量在33天明顯升高，B類(lèi)中的27個(gè)組分含量在33天明顯下降。其次，A1類(lèi)4個(gè)組分含量在7天變化不明顯，A2類(lèi)3個(gè)組分含量在7天下降；B1類(lèi)18個(gè)組分含量在7天升高，B2類(lèi)9個(gè)組分含量在7天下降，GC和Cit的變化趨勢(shì)不明顯。

表3 草甘膦施用對(duì)茶樹(shù)葉片生物堿含量的影響(n=6)

圖2 草甘膦施用后茶樹(shù)葉片中36種化學(xué)組分的含量熱圖Fig.2 Heat map of 36 chemical components in tea leaves after glyphosate applying注：顏色刻度表示標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換后的值，藍(lán)色表示低含量水平；紅色表示高含量水平。Note:The color scale indicates the standardized converted value,blue indicates a low content level;red indicates a high content level.

2.5.2 偏最小二乘判別分析(PLS-DA)

為進(jìn)一步確定各組樣品間的差異，對(duì)36種茶葉代謝組分進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。由圖2A可知，模型累積方差貢獻(xiàn)率為95.3%，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為98.5%，表明了該模型用于區(qū)分樣品的可行性。圖3B顯示了PLS-DA模型的交叉驗(yàn)證結(jié)果，圖中左側(cè)所有的R2和Q2點(diǎn)均低于最右側(cè)的R2和Q2原始點(diǎn)，縱軸低截距(R2=0.174，Q2=-0.361)進(jìn)一步表明原始模型的有效性。由圖2 B可知，0天、7天和33天的樣品分別位于第四、一和三象限，0天和7天的樣品在t[2]軸上完全分開(kāi)，0天和33天的樣品在t[1]軸上完全分開(kāi)，7天和33天的樣品需t[1]軸和t[2]軸相結(jié)合才能區(qū)分。由此可見(jiàn)，草甘膦噴施后7天和33天的樣品差別較小，而與草甘膦噴施前的樣品(0天)存在較大差異。

如圖3D所示，共有10種化合物的VIP(variable importance for the projection,VIP)值大于1，變量VIP值由高至低依次是茶氨酸(Thea)、咖啡堿(CA)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、谷氨酰胺(Gln)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、表兒茶素(EC)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)和表沒(méi)食子兒茶素(EGC)。此外，這10種化合物在因子載荷圖(見(jiàn)圖3C)中發(fā)現(xiàn)這些化合物均屬于離密集區(qū)較遠(yuǎn)的變量。

3 討論

3.1 草甘膦施用后茶樹(shù)葉片的表觀藥害及農(nóng)藥殘留情況

Tong等[9]研究發(fā)現(xiàn)，水培營(yíng)養(yǎng)液中的草甘膦濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)，茶樹(shù)葉片會(huì)出現(xiàn)黑褐色斑點(diǎn)；Gao等[8]研究發(fā)現(xiàn)，推薦劑量的草甘膦噴灑到茶園后，茶樹(shù)嫩梢生長(zhǎng)正常。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，1.5～15 g/m2劑量的草甘膦噴灑到成年茶樹(shù)根部后，茶樹(shù)地上部未觀察到藥害產(chǎn)生[10]。本試驗(yàn)與后二者研究結(jié)果相似，45～900 mg/L劑量的草甘膦噴灑到幼齡茶樹(shù)的栽培基質(zhì)后，茶樹(shù)生長(zhǎng)正常。此外，在45 mg/L較低施藥劑量下，茶樹(shù)葉片在7天檢測(cè)到較高草甘膦(大于MRLs)及AMPA殘留，在較長(zhǎng)施用間隔期后(33天)仍可檢測(cè)到少量草甘膦(小于MRLs)及AMPA殘留。AMPA 作為草甘膦的主要降解產(chǎn)物，是一種植物毒素，對(duì)哺乳動(dòng)物具有長(zhǎng)期的毒性作用[13]，說(shuō)明茶園草甘膦的施用不易使茶樹(shù)葉片產(chǎn)生藥害表征，但在葉片中殘留時(shí)間久且存在草甘膦殘留超標(biāo)及AMPA生物毒性的風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 草甘膦對(duì)茶樹(shù)葉片主要生化成分的影響

草甘膦通過(guò)抑制植物莽草酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶活性，影響3種芳香氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)的生物合成[14]。本研究顯示，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的含量在草甘膦施用后7天升高，在33天降低并低于施用前(0天)，原因可能是茶樹(shù)在初期對(duì)草甘膦產(chǎn)生逆境響應(yīng)，3種氨基酸的含量升高，而后草甘膦持續(xù)抑制EPSPS活性，最終導(dǎo)致3種氨基酸的含量下降。草甘膦作用于植物莽草酸代謝的過(guò)程可間接影響生物堿類(lèi)化合物和部分次生代謝物(如：茶氨酸和兒茶素)的合成[15]。Malalgoda等[16]指出，草甘膦對(duì)小麥的氨基酸代謝具有負(fù)面影響；Rainio等[17]通過(guò)對(duì)馬鈴薯的土壤基質(zhì)進(jìn)行草甘膦處理，發(fā)現(xiàn)植株內(nèi)的糖苷生物堿濃度下降。與之研究結(jié)果相似，草甘膦施用后，茶葉中的特征氨基酸—茶氨酸含量大幅降低，可可堿、表兒茶素沒(méi)食子酸酯和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯含量顯著下降，說(shuō)明施用草甘膦可能通過(guò)抑制莽草酸代謝途徑，間接阻止這些化合物的生物合成。此外，游離氨基酸、兒茶素和生物堿的總量及其組分構(gòu)成，對(duì)茶葉品質(zhì)具有重要作用[18]。草甘膦施用后，游離氨基酸和兒茶素總量降低，生物堿總量先升后降；2個(gè)生物堿、5個(gè)兒茶素和27個(gè)游離氨基酸組分的含量發(fā)生顯著變化(P<0.05)。說(shuō)明施用草甘膦改變了茶樹(shù)葉片中游離氨基酸、兒茶素和生物堿類(lèi)化合物的總量及其組分構(gòu)成，影響鮮葉品質(zhì)。

PLS-DA模型的因子載荷圖中離密集區(qū)越遠(yuǎn)的變量對(duì)分類(lèi)越關(guān)鍵[19]，VIP總結(jié)變量X(代謝組分)和自變量Y(樣品)相關(guān)性，VIP值大于1，表示該代謝組分對(duì)樣品組間區(qū)分的貢獻(xiàn)較大[20]，共有10個(gè)化合物的VIP值大于1，且在因子載荷圖中屬于離密集區(qū)較遠(yuǎn)的變量，依次是茶氨酸、咖啡堿、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、谷氨酰胺、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和表沒(méi)食子兒茶素。此外，這10個(gè)化合物的絕對(duì)含量在0、7和33天均具有顯著差異(P<0.05)，因此，這10個(gè)化合物是區(qū)分茶樹(shù)草甘膦施用前(0天)和施用后(7天和33天)的關(guān)鍵化合物。

4 結(jié)論

草甘膦在茶樹(shù)葉片中殘留時(shí)間較長(zhǎng)，并存在草甘膦殘留超標(biāo)及AMPA生物毒性的風(fēng)險(xiǎn)；其次，草甘膦的施用能夠間接阻止茶樹(shù)葉片中茶氨酸、可可堿、表兒茶素沒(méi)食子酸酯和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯等組分的合成，并改變茶樹(shù)嫩梢的游離氨基酸、兒茶素和生物堿類(lèi)化合物的總量及其組分構(gòu)成，最終影響鮮葉品質(zhì)。此外，通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析篩選出10個(gè)茶樹(shù)草甘膦施用前后差異較大的關(guān)鍵化合物，變量VIP值由高至低依次為：茶氨酸、咖啡堿、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、谷氨酰胺、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和表沒(méi)食子兒茶素。因此，建議在茶葉生產(chǎn)中盡量不使用草甘膦除草劑。