林升華，王旖婷，蔣金霞，蘇蕓萱，李世康*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 胸外科，廣西 南寧 530000； 2.桂平市人民醫(yī)院 心胸外科，廣西 桂平 537200； 3.桂平市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣西 桂平 537200)

肺癌是世界上發(fā)生率和死亡率最高的惡性腫瘤，我國(guó)肺癌五年生存率為19.8%[1].肺癌依據(jù)組織學(xué)分類(lèi)可分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC).NSCLC主要包括肺鱗狀細(xì)胞癌(lung squamous cell carcinomas，LUSC)和肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)，LUSC占所有肺癌的30%～35%,以中央型肺癌為主.LUAD約占35%～40%，是非吸煙患者中發(fā)生率最高的類(lèi)型,腺癌以周?chē)投嘁?jiàn),中央型也可見(jiàn)到.NSCLC占肺癌發(fā)生總數(shù)的85%，死亡率達(dá)80%～90%[2]，大約70%患者確診時(shí)已處于晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì).肺癌晚期患者的5年生存率低于15%，肺癌早期患者通過(guò)合理治療，5年生存率可高達(dá)80%，NSCLC患者即使處于進(jìn)展期，在行肺癌根治術(shù)后結(jié)合其他合理輔助治療，其5年生存率依舊可達(dá)35%～50%[3].NSCLC的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療對(duì)提高患者5年生存率至關(guān)重要.已有臨床試驗(yàn)證實(shí)痰液中snoRNA檢測(cè)對(duì)診斷肺癌有74.6%的敏感性和83.6%特異性[4].然而snoRNA種類(lèi)繁多，最近發(fā)現(xiàn)的SNORA56在肺癌組織中的表達(dá)異常及其基因性狀不明，目前仍缺乏這方面的研究.本研究通過(guò)癌癥基因組圖譜 (the cancer genome atlas, TCGA) 公共數(shù)據(jù)集并結(jié)合臨床樣本, 探究SNORA56在肺癌組織中的表達(dá),分析其在NSCLC診斷及患者預(yù)后的影響,探索其基因性狀，驗(yàn)證此性狀的可重復(fù)性，分析SNORA56表達(dá)與NSCLC患者臨床相關(guān)數(shù)據(jù)的關(guān)系，評(píng)估SNORA56表達(dá)量對(duì)NSCLC患者的診斷、預(yù)后的價(jià)值，并通過(guò)基因富集分析尋找SNORA56影響肺癌發(fā)展的可能通路.

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

從SNORic數(shù)據(jù)庫(kù) (http:// bioinfo.life.hust.edu.cn/SNORic/) 下載SNORA56表達(dá)數(shù)據(jù)[5]，SNORA56對(duì)應(yīng)的RPKM(Reads Per Kilobase per Million mapped reads)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)R語(yǔ)言“l(fā)imma”程序包進(jìn)行校正預(yù)處理,隨后對(duì)SNORA56相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析, 下載TCGA相應(yīng)臨床資料數(shù)據(jù), 對(duì)臨床病理相關(guān)性分析和預(yù)后進(jìn)行分析.使用Spearman相關(guān)性分析TCGA肺癌患者SNORA56表達(dá)與拷貝數(shù)變異的相關(guān)性，|R2|>0.3及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)<0.05被認(rèn)為具有顯著相關(guān)性.

1.2 基因集富集分析

采用基因集富集分析 (gene set enrichment analysis, GSEA)軟件進(jìn)行分析[6-7].基于1.1所標(biāo)準(zhǔn)化的mRNA數(shù)據(jù)，按SNORA56表達(dá)水平是否高于均數(shù)，將病例分為SNORA56高表達(dá)組和SNORA56低表達(dá)組.本研究利用GSEA網(wǎng)站MsigDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得HALLMARK.gmt數(shù)據(jù)集;然后, 按缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法進(jìn)行富集分析, 設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1 000次，在GSEA軟件中分別對(duì)LUAD和肺鱗癌的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，閾值設(shè)置為FDR<0.05.

1.3 臨床樣本采集

收集于2018年至2019年在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)的NSCLC患者的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，其中LUSC患者的12對(duì)，LUAD患者的18對(duì)，共30對(duì).所有患者術(shù)前均未接受任何治療，包括介入治療或者放化療、靶向治療及免疫治療.肺癌組織及癌旁組織于手術(shù)切除30 min內(nèi)采集至甲醛溶液，迅速放至-80 ℃的樣本收集冰箱進(jìn)行存儲(chǔ)，同時(shí)記錄收集患者的相關(guān)臨床信息.

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qRT-PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá)

用TRIzol試劑(Invitrogen)從新鮮冷凍的肺癌樣品中提取總RNA，用QIAGEN FFPE RNeasy試劑盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)從甲醛固定的肺癌樣品中提取總RNA.用NanoDropND-2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)測(cè)量RNA純度和質(zhì)量，用逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，Madison，WI，USA)對(duì)SNORA56進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄.在CFX96 Touch序列檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上用SYBR Green qPCR SuperMix-UDG試劑(Invitrogen)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè). GAPDH和β-actin分別用作新鮮冷凍肺癌標(biāo)本及FFPE樣品的標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照.使用2-ΔΔCT方法計(jì)算SNORA56相對(duì)表達(dá)水平[8].SNORA56相應(yīng)的引物ACA56為Forward:5′-TCTGGCTCGTGGGACTC-TAG-3′；Reverse:5′-TGACGCTGGACAGAAGAACTC-3′.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)臨床樣本患者年齡、性別、T分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否復(fù)發(fā)等指標(biāo)進(jìn)行量化賦值, 使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過(guò)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩組數(shù)據(jù)之間的差異，多于3組之間的數(shù)據(jù)差異使用單因素方差分析進(jìn)行比較.同時(shí)，使用Kaplan-Meier 曲線(簡(jiǎn)稱(chēng)K-M曲線)對(duì)患者進(jìn)行生存分析.P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)集篩選和臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性分析

在SNORic數(shù)據(jù)庫(kù)上下載得到含有SNORA56表達(dá)量的NSCLC癌旁組織樣本91例,其中，LUSC 45例，LUAD 46例；NSCLC癌組織樣本989例,其中，LUSC 476例，LUAD 513例. 通過(guò)對(duì)臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估和篩選,最后確認(rèn)所有989例病例均含有完整臨床病理參數(shù)和生存資料，根據(jù)mRNA測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)，LUSC癌組織樣本中SNORA56表達(dá)量為(27.029±33.723)，LUAD癌組織樣本中SNORA56表達(dá)量為(16.780±24.167).如果NSCLC癌組織中某一樣本SNORA56表達(dá)大于均數(shù)，則定義為SNORA56高表達(dá)，低于均數(shù)則定義為SNORA56低表達(dá).據(jù)此得出，LUSC癌組織中SNORA56高表達(dá)146例，低表達(dá)330例；LUAD癌組織中SNORA56高表達(dá)157例，低表達(dá)356例.

2.2 基于TCGA分析NSCLC癌組織與癌旁組織中SNORA56差異表達(dá)

對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中snoRNA在NSCLC癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析,結(jié)果顯示, SNORA56在NSCLC癌組織中的mRNA表達(dá)水平，LUSC癌組織中的表達(dá)量為(27.029±33.723)，LUAD癌組織中的表達(dá)量為(16.780±24.167)，明顯高于癌旁組織中snoRNA的表達(dá)水平，LUSC癌旁組織中的表達(dá)量為(1.264±2.340)，LUAD癌旁組織中的表達(dá)量為(0.917±2.220)(P<0.000 1),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1、2，圖1、2).分析476份LUSC癌組織和45份LUSC癌旁組織,發(fā)現(xiàn)SNORA56表達(dá)水平與患者年齡、性別、T分期、M分期及癌癥是否復(fù)發(fā)無(wú)關(guān)(P>0.05)，與是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.02<0.05,圖3).分析513份LUAD癌組織和46份LUAD癌旁組織，發(fā)現(xiàn)SNORNA56表達(dá)水平與患者年齡、性別、T分期、M分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及癌癥是否復(fù)發(fā)均無(wú)關(guān)(P>0.05，圖4).如圖5、6所示，SNORA56表達(dá)水平與肺癌患者預(yù)后無(wú)顯著關(guān)系，LUSC組(Log-rank2=1.248,P=0.27)；LUAD組(Log-rank2=0.067,P=0.80)，SNORA56低表達(dá)與高表達(dá)患者無(wú)論在LUSC組還是LUAD組，生存預(yù)后均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

表1 LUSC患者臨床資料相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of clinical data in patients with LUSD

表2 LUAD患者臨床資料相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of clinical data in patients with LUAD

圖1 SNORA56在LUSC患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of SNORA56 in carcinoma and para-cancerous tissues of patients with LUSC

圖2 SNORA56在LUAD患者癌組織與癌旁組織中的表達(dá)Fig.2 Expression of SNORA56 in carcinoma and para-cancerous tissues of patients with LUAD

圖3 SNORA56在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LUSC患者癌組織中的表達(dá)(TCGA數(shù)據(jù))Fig.3 Expression of SNORA56 in carcinoma tissues of LUSC patients with and without lymph node metastasis(data from TCGA)

圖4 SNORA56在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LUAD患者癌組織中的表達(dá)Fig.4 Expression of SNORA56 in carcinoma tissues of LUAD patients with and without lymph node metastasis

圖5 SNORA56表達(dá)狀態(tài)與LUCS患者預(yù)后關(guān)系Fig.5 Relationship between SNORA56 expression status and prognosis of LUSC patients

圖6 SNORA56表達(dá)狀態(tài)與LUAD患者預(yù)后關(guān)系Fig.6 The relationship between SNORA56 expression status and prognosis of LUAD patients

2.3 SNORA56功能基因集富集分析

最后，本研究根據(jù)NSCLC患者SNORA56的表達(dá)水平均值將肺癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，隨后使用GSEA法對(duì)相應(yīng)的數(shù)據(jù)進(jìn)行通路分析，結(jié)果提示, 在LUAD SNORA56高表達(dá)的樣本中存在13條顯著富集信號(hào)通路 (FDR<0.05)，且其中11條相關(guān)信號(hào)通路富集最為顯著(FDR<0.05).最終通過(guò)韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)，在LUAD和LUSC中，共同存在9條相關(guān)信號(hào)通路，其中Myc Targets V1、 Mtorc1 Signaling、Myc Targets V2、E2f Targets及 G2M Checkpoint相關(guān)信號(hào)通路提示SNORA56極有可能通過(guò)影響細(xì)胞周期凋亡而影響肺癌的發(fā)展，Oxidative Phosphorylation和Fatty Acid Metabolism相關(guān)信號(hào)通路提示SNORA56極有可能通過(guò)影響氧化磷酸化及脂質(zhì)代謝對(duì)肺癌的發(fā)生發(fā)展起相關(guān)作用.

2.4 SNORA56的表達(dá)水平與其拷貝數(shù)變異的相關(guān)性

本研究通過(guò)SNORic數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)SNORA56的mRNA表達(dá)水平與其拷貝數(shù)的相關(guān)性分析.結(jié)果顯示，在LUAD中，SNORA56 mRNA與相應(yīng)基因組所在位置的拷貝數(shù)存在正相關(guān)的關(guān)系(|R2|=0.236 9，P=2.17e-7).SNORA56 mRNA的表達(dá)水平與拷貝數(shù)變異存在相同的趨勢(shì)(|R2|=0.226 6，P=4.45e-6).由此可見(jiàn)，SNORA56在肺癌中的表達(dá)差異可能是因?yàn)槠渲谢蚪M水平上突變而導(dǎo)致的結(jié)果，進(jìn)而影響肺癌的發(fā)生發(fā)展.

2.5 SNORA56在臨床肺癌樣本中的差異表達(dá)

本研究做了30對(duì)臨床樣本SNORA56的PCR分析，標(biāo)本選擇為同一NSCLC患者的癌組織及癌旁組織，排除不同個(gè)體組織比較的各因素的影響.結(jié)果提示(圖7)，30對(duì)NSCLC患者臨床樣本中，NSCLC患者癌組織中SNORA56表達(dá)水平比癌旁組織偏高有16對(duì)樣本，表達(dá)偏低有4對(duì)樣本.T檢驗(yàn)結(jié)果顯示(表3)，SNORA56在NSCLC患者癌組織(0.001 629±0.000 321)中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(0.000 624±0.000 520)，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.004 0<0.05).SNORA56在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LUSC患者癌組織明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LUSC患者癌組織(圖8),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.036 2<0.05).SNORA56表達(dá)水平與性別無(wú)關(guān)(P>0.05).

圖7 SNORA56在NSCLC患者癌組織與癌旁組織中的表達(dá)Fig.7 Expression of SNORA56 in carcinoma and para-cancerous tissues of patients with NSCLC

表3 SNORA56與30對(duì)NSCLC患者樣本各臨床指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between SNORA56 and clinical related indicators of 30 pairs of samples of patients with NSCLC

圖8 SNORA56在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移LUSC患者癌組織中的表達(dá)(臨床樣本數(shù)據(jù))Fig.8 Expression of SNORA56 in carcinoma tissues of LUSC patients with and without lymph node metastasis(data from clinical samples)

3 討論

肺癌是威脅人類(lèi)生命健康的重要疾病，發(fā)生率及死亡率均排在所有惡性腫瘤第一位[9].肺癌總體預(yù)后差，70%左右肺癌病例確診時(shí)已為晚期，而晚期肺癌5年生存率低于15%.肺癌篩查是發(fā)現(xiàn)早期肺癌的關(guān)鍵所在，早期肺癌通過(guò)手術(shù)治療后的5年生存率可高達(dá)83%，而轉(zhuǎn)移后的Ⅲ期肺癌患者5年生存率低至15%以下，Ⅳ期肺癌患者5年生存率僅2%[10].目前雖發(fā)現(xiàn)有多個(gè)基因在肺癌診斷、治療、判斷預(yù)后方面有一定作用[11-12]，但臨床使用的效果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證.早診斷，早治療，對(duì)提高患者生存率至關(guān)重要，因此尋找一種靈敏度、特異度高、副作用小的輔助檢查手段成為迫切需要，同時(shí)尋找對(duì)肺癌預(yù)后判斷及有效治療靶點(diǎn)更刻不容緩.據(jù)報(bào)道，核仁小RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)是一類(lèi)定位于細(xì)胞核的非編碼RNA，含有60～300個(gè)核苷酸,許多生物體內(nèi)存在數(shù)百種snoRNA，是數(shù)量最多的非編碼RNA組[13].根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同,目前snoRNA基本可分為4類(lèi)，數(shù)量多且研究較多的兩類(lèi)為 box C/D snoRNA和box H/ACA snoRNA，小卡扎爾體RNA (small Cajal body-specific RNA, scaRNA) 及孤兒型snoRNA (orphan snoRNA)這兩類(lèi)數(shù)量少且研究較少[14].snoRNAs的功能很多，目前已知最主要的功能是參與rRNAs的生成與成熟.近年來(lái),眾多snoRNA的研究證實(shí)，snoRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，這為進(jìn)一步了解腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制、腫瘤的診斷、治療方法及預(yù)后判斷提供了新的研究方向[15].

本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載SNORA56在NSCLC患者癌組織及癌旁組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)，分析了SNORA56在989例NSCLC患者癌組織及91例NSCLC患者癌旁組織中的表達(dá)量，結(jié)果顯示SNORA56在NSCLC患者癌組織的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，同時(shí)發(fā)現(xiàn)SNORA56在LUSC患者癌組織中高表達(dá)與淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系.術(shù)后腫瘤組織病理確診為L(zhǎng)USC的患者若術(shù)前影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)腫大，術(shù)中因條件限制未能完全切除縱隔淋巴結(jié)，而術(shù)后檢測(cè)SNORA56明顯升高，則患者可能已經(jīng)發(fā)生相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這對(duì)LUSC患者術(shù)后輔助治療的選擇有重要參考意義.本研究數(shù)據(jù)是基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)以及Gong等學(xué)者建立的SNORic數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)結(jié)果可靠性均得到國(guó)際學(xué)者認(rèn)可[5].實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了30對(duì)NSCLC癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中SNORA56的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)SNORA56的表達(dá)水平在NSCLC患者癌組織中明顯升高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LUSC患者癌組織SNORA56表達(dá)水平明顯偏高，SNORA56在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LUAD患者癌組織中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與數(shù)據(jù)庫(kù)中所得結(jié)果相同.此外，基于 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的肺癌基因組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，SNORA56 mRNA的表達(dá)水平與其基因組水平的拷貝數(shù)變異存在正相關(guān)關(guān)系.由此可以推斷，SNORA56基因的拷貝數(shù)出現(xiàn)了變異，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變，進(jìn)而影響肺癌的發(fā)生發(fā)展.為了進(jìn)一步探索SNORA56在肺癌診斷中的潛在功能，本研究進(jìn)行了GSEA分析，結(jié)果顯示SNORA56可能通過(guò)影響細(xì)胞周期凋亡相關(guān)通路在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用.研究表明，無(wú)論是在果蠅還是在脊椎動(dòng)物中，許多snoRNAs都受到Myc的影響而轉(zhuǎn)錄激活[16].在正常發(fā)育過(guò)程中，丟失snoRNAs不利于生長(zhǎng)，但在神經(jīng)元腫瘤模型中，snoRNAs的過(guò)度表達(dá)則會(huì)增加腫瘤的質(zhì)量.此外SNORA56還可能作用于氧化磷酸化及脂質(zhì)代謝等相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致其代謝通路紊亂，進(jìn)一步影響肺癌的發(fā)生發(fā)展.本研究只對(duì)SNORA56進(jìn)行了初步分析，其與NSCLC相關(guān)性的具體作用機(jī)制尚不明晰，還需更深層次的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索.