唐紅霞, 黃佳慶, 孫 強(qiáng), 溫廣月, 董茂鋒*,, 王偉民*,

(1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所 農(nóng)藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201106；2. 上?？屏⑻剞r(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 201106)

葉用萵苣Lactuca sativa L. var. ramosa Hort.在種植過程中，極易感染霜霉病、軟腐病、菌核病等多種病害[1]。687.5 g/L 氟菌 · 霜霉威懸浮劑由德國(guó)拜耳作物科學(xué)公司研發(fā)，對(duì)霜霉病、疫病、晚疫病和猝倒病等常見卵菌綱病害具有良好的防治效果[2-3]，常用于防治萵苣病害。中國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[4]中，關(guān)于氟吡菌胺和霜霉威鹽酸鹽 (圖式1) 的殘留定義描述分別為氟吡菌胺和霜霉威，但在JMPR 報(bào)告[5]中，氟吡菌胺的膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估定義分別評(píng)估氟吡菌胺及其代謝物2,6-二氯苯甲酰胺。關(guān)于氟吡菌胺在葉菜類蔬菜中的最大殘留限量 (MRLs) 中國(guó)規(guī)定為30 mg/kg[4]，國(guó)際食品法典委員會(huì) (CAC) 規(guī)定為30 mg/kg[6]，美國(guó)規(guī)定為25 mg/kg[7]。關(guān)于霜霉威在葉菜類蔬菜中的MRL 值，CAC 規(guī)定為100 mg/kg[6]，美國(guó)規(guī)定為150 mg/kg[7]，而中國(guó)目前尚未制定其在葉用萵苣中的MRL 值。

關(guān)于氟吡菌胺殘留的檢測(cè)方法有氣相色譜(GC)和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS），涉及黃瓜[8]、番茄[2-3]、葡萄[9]等作物；關(guān)于霜霉威殘留的檢測(cè)方法主要有液相色譜 (LC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS)和GC-MS/MS，涉及人參[10]、番茄[2-3,11]、馬鈴薯[12-13]和黃瓜[8]等作物。已有學(xué)者開展了氟吡菌胺 · 霜霉威在番茄上的殘留行為研究，但尚未見其在葉用萵苣中殘留消解評(píng)價(jià)和膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究。鑒于此，本研究通過改良的QuEChERS 方法，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定葉用萵苣中霜霉威、氟吡菌胺及其代謝物(2,6-二氯苯甲酰胺) 殘留量，并通過田間試驗(yàn)分析了其消解動(dòng)態(tài)，旨在為制定其在葉用萵苣中的MRL 值和安全使用方法提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 (LC-8040 電噴霧離子源，日本Shimadzu 公司)；MX-F 渦動(dòng)混合器 (中國(guó)Dragonlab 公司)；5415D 離心機(jī) (Eppendorf 公司)。

氟吡菌胺 (fluopicolide，純度93.31%)、2,6-二氯苯甲酰胺 (2,6-dichlorobenzamide，純度99.43%)和霜霉威 (propamocarb，1 000 mg/L，溶劑為丙酮) 標(biāo)準(zhǔn)品，均為北京振翔科技有限公司產(chǎn)品；687.5 g/L 氟菌 · 霜霉威懸浮劑 (SC，含氟吡菌胺62.5 g/L，霜霉威鹽酸鹽625 g/L)，拜耳作物科學(xué)(中國(guó)) 有限公司。

乙腈和甲醇 (色譜純)，美國(guó)Merck 公司；甲酸和乙酸銨 (色譜純)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；氯化鈉 (分析純)，上?；瘜W(xué)試劑公司。

十八烷基鍵合硅膠 (C18)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA) 和石墨化碳黑 (GCB)，日本Shimadzu 公司)；多壁碳納米管 (MWCNTs)，南京先豐納米材料科技有限公司。

1.2 田間試驗(yàn)

按照《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[14]要求，于2019 年分別在上海市松江區(qū)和奉賢區(qū)溫室內(nèi)開展田間試驗(yàn)。供試藥劑為687.5 g/L 氟菌 · 霜霉威懸浮劑，施藥劑量為有效成分928.13 g/hm2，施藥間隔期為7 d，噴霧施藥3 次，每小區(qū)100 m2，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。分別于末次施藥后2 h 及1、3、5、7、10 d 采樣。隨機(jī)采集兩個(gè)獨(dú)立的葉用萵苣樣本，每個(gè)樣本不少于12 株。剪取土表以上的整個(gè)個(gè)體，去除腐壞和萎蔫部分莖葉，留樣至少1 kg。

1.3 檢測(cè)條件

色譜條件：Shimadzu InertSustainSwift C18色譜柱 (2.1 mm × 50 mm，3 μm)；流速0.50 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。流動(dòng)相A 相為甲醇，B 相為5 mmol/L 醋酸銨 (含0.1%甲酸水溶液)，梯度洗脫程序：0～1 min (10% A)；＞1～2.5 min(10% A～90% A)；＞2.5～4.5 min (90% A)；＞4.5～5.0 min (90% A～10% A)；＞5.0～6.0 min (10% A)。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描 (ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM) 模式；離子源接口電壓3.5 kV；脫除溶劑管 (DL 管) 溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；霧化氣流速3.0 L/min (N2，純度99.999%)；干燥氣流速15 L/min (N2，純度99.999%)。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺質(zhì)譜條件參數(shù)Table1 Mass spectrometry parameters for propamocarb, fluopicolide and 2,6-dichlorobenzamide

1.4 樣品前處理

樣品用食品粉碎機(jī)碎粉，勻漿，稱取5.0 g 于50 mL 聚乙烯離心管中，加入20 mL 乙腈，渦旋提取10 min，加入4 g 氯化鈉，再次渦旋30 s，于4 000 r/min 下離心5 min；取上清液1 mL 至盛有7.5 mg 多壁碳納米管的2 mL 離心管中，渦旋1.5 min 后，于10 000 r/min 下離心2 min；取上清液，過0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜，待測(cè)定。

1.5 方法驗(yàn)證

按照《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[14]和歐盟SANTE/11 813/2017[15]準(zhǔn)則要求，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線、添加回收試驗(yàn)開展殘留分析方法驗(yàn)證。

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別準(zhǔn)確稱取一定量的氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解，配制成1 000 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于 -18 ℃保存。

分別取1 000 mg/L 氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺儲(chǔ)備溶液和1 000 mg/L 霜霉威標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈稀釋，配制成10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，再用葉用萵苣空白基質(zhì)溶液稀釋，配制成0.005、0.05、0.1、0.5、1 mg/L 的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3 節(jié)條件測(cè)定，以化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的離子峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 基質(zhì)效應(yīng) 對(duì)于串聯(lián)質(zhì)譜，由于干擾或共同洗脫的基質(zhì)部分影響電噴霧接口的離子化效率，從而引起離子抑制或離子增強(qiáng)導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性或不精確的定量，因此基質(zhì)效應(yīng)是串聯(lián)質(zhì)譜分析方法驗(yàn)證的重要參數(shù)[16-17]。分別用乙腈和空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液 (0.1 mg/L)，按照公式(1) 計(jì)算基質(zhì)效應(yīng) (Me)。當(dāng)Me小于20%時(shí)，認(rèn)為可以忽略基質(zhì)效應(yīng)；反之，則說明存在明顯的基質(zhì)增強(qiáng)或減弱效應(yīng)[17]。

式中，Am表示基質(zhì)溶液中化合物的峰面積，As表示溶劑中化合物的峰面積，Me表示化合物基質(zhì)效應(yīng)。

1.5.3 添加回收試驗(yàn) 向空白葉用萵苣樣品中分別添加0.02、0.2、2 和100 mg/kg 4 個(gè)水平的霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)5 次。添加混勻靜置30 min 后，按1.3節(jié)條件測(cè)定，計(jì)算添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。若上機(jī)濃度超過線性范圍，則用空白基質(zhì)稀釋。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法前處理優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑優(yōu)化 分別比較了添加不同量的甲酸或氨水的乙腈溶液和純乙腈作為提取溶劑時(shí)對(duì)霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺提取效率的影響。分別用10 mL 的0.1%甲酸-乙腈、0.2%甲酸-乙腈、乙腈、0.1%氨水-乙腈和0.2%氨水-乙腈提取目標(biāo)化合物。結(jié)果顯示 (圖1)，在0.1 mg/kg添加水平 (n = 3) 下，雖然5 種溶劑回收率均在71%～108%之間，但以0.1%甲酸-乙腈或0.2%氨水-乙腈作為提取溶劑時(shí)，霜霉威的平均回收率最高，在83%～84%之間，結(jié)合流動(dòng)相中含有甲酸，最終選擇以10 mL 的0.1% 甲酸-乙腈作為提取溶液。

2.1.2 吸附材料篩選 取0.1 mg/L 基質(zhì)匹配混合溶液 (n = 3)，分別用50 mg C18、50 mg PSA、50 mg GCB 和5 mg 的MWCNTs 進(jìn)行分散固相萃取凈化。結(jié)果 (圖2A) 顯示，除當(dāng)使用GCB 時(shí)氟吡菌胺的回收率偏低 (75%) 外，其余3 種材料的回收在89%～118%之間，均符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》要求[14]。在分析蔬菜樣品中的農(nóng)藥殘留時(shí)，色素是最常見的雜質(zhì)，通過外觀鑒別不同凈化劑對(duì)色素的凈化效果 (圖2C) 發(fā)現(xiàn)，使用MWCNTs 處理后的樣本顏色最淺，色素凈化效果最好。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察其用量對(duì)凈化效果的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MWCNTs 添加量分別為2.5、5、7.5 和15 mg 時(shí)，氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺和霜霉威的回收率在86%～103%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 在1%～8%之間 (圖2B)，均符合農(nóng)藥殘留分析的要求[14]。但當(dāng)其用量增加到7.5 mg 后，凈化后樣品的外觀不再發(fā)生明顯變化 (圖2D)。綜合考慮，最終選用7.5 mg MWCNTs 為主要吸附材料以及200 mg 無水硫酸鎂作為分散固相萃取凈化材料。

2.2 方法驗(yàn)證結(jié)果

在0.005～1 mg/L 范圍內(nèi)，霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺的質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值間呈良好線性關(guān)系，R2在0.999～1.000 之間 (表2)，其基質(zhì)效應(yīng)分別為4.3%、21%和64%，需要采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正定量分析。

通過添加回收試驗(yàn)結(jié)果顯示 (表2)，氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、霜霉威在葉用萵苣中的平均回收率在85%～106%之間，RSD 在1%～18%之間，均符合中國(guó)和歐盟殘留分析試驗(yàn)準(zhǔn)則[14-15]要求。

表2 霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺在葉用萵苣中的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table2 The recoveries and RSDs of propamocarb, fluopicolide and 2,6-dichlorobenzamide in leaf lettuce

2.3 殘留消解動(dòng)態(tài)和最終殘留量測(cè)定結(jié)果

2.3.1 殘留消解動(dòng)態(tài) 結(jié)果 (表3) 顯示，隨著施藥后時(shí)間增加，葉用萵苣中目標(biāo)化合物的殘留量呈明顯下降趨勢(shì)，符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程[18]。其中，2,6-二氯苯甲酰胺的殘留量低于定量限(0.02 mg/kg)，與前人在黃瓜上的研究結(jié)果一致[8]。于末次施藥后10 d，氟吡菌胺和霜霉威消解率分別為81%～84%和73%～78%。氟吡菌胺在葉用萵苣中的半衰期為3.9～4.2 d，與前人在番茄 (2～4 d)[3]和黃瓜 (2～3.3 d)[8]上的研究結(jié)果類似；本研究中霜霉威的半衰期為4.8～4.9 d，與其在番茄、馬鈴薯、黃瓜、人參和煙草上的半衰期 (1.29～11.46 d)[2-3,10,12-13,19]差別較大，可能與試驗(yàn)時(shí)的氣候、作物等因素有關(guān)。

表3 霜霉威、氟吡菌胺在葉用萵苣中的消解動(dòng)態(tài)Table3 Dissipation dynamic of propamocarb, fluopicolide in leaf lettuce

2.3.2 最終殘留量 由表4 可知：當(dāng)采收間隔期為5 d 時(shí)，葉用萵苣上氟吡菌胺和霜霉威的殘留量分別為4.88～8.51 和13.6～33.1 mg/kg。而2,6-二氯苯甲酰胺在葉用萵苣中的殘留量均低于定量限(0.02 mg/kg)。中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定氟吡菌胺在葉菜類蔬菜上的最大殘留限量 (MRL) 為30 mg/kg，但尚未制定霜霉威在葉用萵苣或相關(guān)葉菜上的MRL 值。CAC 規(guī)定葉用萵苣上霜霉威的MRL 值為100 mg/kg。參照以上數(shù)據(jù)，結(jié)合葉用萵苣的生長(zhǎng)特點(diǎn)和消費(fèi)習(xí)慣，推薦687.5 g/L 氟菌 · 霜霉威懸浮劑在葉用萵苣上的采收間隔期為5 d。

表4 霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺在葉用萵苣中的最終殘留量Table4 Terminal residue of propamocarb, fluopicolide and 2,6-dichlorobenzamide in leaf lettuce

3 結(jié)論

建立了采用QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定葉用萵苣中氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺和霜霉威殘留量的分析方法，比較了不同酸堿度提取體系對(duì)氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺和霜霉威提取回收率的影響，考察了分散固相萃取吸附劑種類 (C18、PSA、GCB 和MWCNTs) 及其用量對(duì)凈化效果的影響，優(yōu)化了前處理提取和凈化的過程。該方法簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確。通過以多壁碳納米管為吸附材料的分散固相萃取，有效地實(shí)現(xiàn)了樣品凈化，通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量，方法驗(yàn)證結(jié)果符合中國(guó)《農(nóng)作物中殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》要求。運(yùn)用所建立的方法檢測(cè)上海地區(qū)溫室條件下葉用萵苣中氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺和霜霉威的殘留量。結(jié)果表明，氟吡菌胺和霜霉威在葉用萵苣中的消解趨勢(shì)符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，半衰期分別為3.9～4.2 和4.8～4.9 d。當(dāng)樣品采收間隔期為5 d 時(shí)，葉用萵苣中氟吡菌胺和霜霉威的殘留量分別為4.88～8.51 和13.6～31.1 mg/kg。其中氟吡菌胺的最終殘留量低于中國(guó)制定的其在葉菜類上的MRL 值 (30 mg/kg)；霜霉威在葉用萵苣的最終殘留量低于CAC 制定的其在葉菜類上的MRL 值 (100 mg/kg)，而2,6-二氯苯甲酰胺在葉用萵苣中的的殘留量均低于定量限 (0.02 mg/kg)。