周 勇, 樸秀英, 廖先駿, 劉 佳, 朱 航, 馬海昊, 周小毛*,, 李富根*,

(1. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，長沙 410125；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

腐霉利 (procymidone，結(jié)構(gòu)式見式1)是20 世紀80 年代開始在中國投入使用的1 種二甲酰亞胺類內(nèi)吸性殺菌劑，主要通過抑制菌體內(nèi)甘油三酯的合成來抑制葡萄孢屬和核盤菌屬真菌，兼具保護和治療雙重作用，低毒、廉價、高效且具有廣譜殺菌性，目前仍是防治韭菜灰霉病的主要藥劑之一[1-3]。

灰霉病是韭菜上的常見病害，會嚴重降低其產(chǎn)量和品質(zhì)[4]，目前主要的防治手段仍為化學(xué)藥劑防治，但長期使用或不合理用藥易導(dǎo)致韭菜中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)的問題[5]。韭菜基質(zhì)較為復(fù)雜，色素含量高且含有揮發(fā)性含硫化合物，尤其冷凍后的韭菜較難通過微波消除巰基，因此檢測難度較大[6]。

目前關(guān)于腐霉利殘留的研究報道較多，所用分析方法主要有氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-13]等，但這些方法主要采用固相萃取柱對樣品進行凈化，過程繁瑣且成本較高，因此建立新的高效、簡便的分析方法將有助于韭菜中腐霉利殘留檢測工作的開展。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 具有靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點，但關(guān)于采用LC-MS/MS 法檢測韭菜中腐霉利殘留量并進行膳食暴露評估方面的研究目前尚未見報道。本研究采用QuEChERS前處理結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 (HPLC-MS/MS)，建立了韭菜中腐霉利殘留的分析方法，據(jù)此對中國8 個省份試驗點田間規(guī)范殘留試驗的韭菜樣品進行了檢測，并與目前中國制定的韭菜中腐霉利最大殘留限量 (MRL) 標(biāo)準 (0.2 mg/kg)[14]進行比較，對腐霉利的殘留超標(biāo)風(fēng)險進行了驗證。

張旭晟等[13]通過抽查市售韭菜得到殘留監(jiān)測數(shù)據(jù)，結(jié)合上海市居民食物消費量調(diào)查結(jié)果，基于蒙特卡羅分析法及相關(guān)計算方法，進行了韭菜中腐霉利殘留的膳食暴露風(fēng)險評估，提出了應(yīng)合理調(diào)整韭菜中腐霉利MRL 標(biāo)準的建議。本研究擬通過田間規(guī)范殘留試驗得到腐霉利在韭菜上使用后的殘留量數(shù)據(jù)，結(jié)合中國居民人均膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查數(shù)據(jù)，對腐霉利在韭菜上使用后的長期膳食暴露風(fēng)險進行評估，并結(jié)合殘留量超標(biāo)風(fēng)險驗證結(jié)果，就目前韭菜中腐霉利MRL 標(biāo)準的合理性進行評價，以期為腐霉利在韭菜生產(chǎn)上的合理使用提供建議。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥劑及試劑

TSQ Endura 三重四極桿高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 (HPLC-MS/MS，賽默飛世爾科技公司)；Hypersil GOLD C18色譜柱 (2.1 mm × 100 mm，1.9 μm)；Blixer 6 V.V. 乳化攪拌機 (法國ROBOTCOUPE 公司)；TG16-Ⅱ高速離心機及TDZ5-WS低速離心機 (湖南平凡科技有限公司) ；ME104E 1/10 000 電子天平 (梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；JY5002 1/100 電子天平 (上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；MTV-100 多管旋渦混合儀 (杭州奧盛儀器有限公司)；DHG-9030A 電熱鼓風(fēng)干燥箱 (中儀國科北京科技有限公司)；XW-80A 微型漩渦混合儀 (上海滬西分析儀器有限公司)。

99.9%腐霉利 (procymidone) 標(biāo)準品 (天津阿爾塔科技有限公司)；50% 腐霉利可濕性粉劑(WP) (陜西億農(nóng)高科藥業(yè)有限公司)。試劑乙腈、氯化鈉為分析純，甲醇、甲酸為色譜純；石墨化碳黑 (GCB) 及N-丙基乙二胺 (PSA) (上海安譜實驗科技股份有限公司)；超純水 (廣州屈臣氏食品有限公司)。

1.2 田間試驗

根據(jù)NY/T 788―2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》[15]，于2019 年分別在黑龍江 (露地)、遼寧 (大棚)、河南 (大棚)、山東 (露地)、安徽 (露地)、湖南 (大棚)、廣西 (露地) 及福建 (大棚) 8 地開展腐霉利在韭菜中的規(guī)范殘留試驗。每個試驗點分別設(shè)1 個處理小區(qū)和1 個對照小區(qū)，每個小區(qū)面積不小于50 m2，小區(qū)之間設(shè)置隔離帶。以噴清水的處理為空白對照。

50% 腐霉利WP 按推薦最高劑量 (有效成分450 g/hm2，制劑量900 g/ hm2)，用清水溶解、稀釋后噴霧。于韭菜灰霉病發(fā)病初期或前期施藥1 次，分別于施藥后2 h 及10、20、30、40 d 采集韭菜樣品。按對角線法采樣，切碎并充分混勻后四分法留樣150 g，于 -18 ℃以下條件保存，備用。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品提取 準確稱取10.0 g 勻漿后的韭菜樣品于100 mL離心管中，加入40 mL 乙腈，渦旋混合1 min；加入5.0 g 氯化鈉，繼續(xù)渦旋混合1 min；在4 000 r/min 條件下離心3 min，取10 mL上清液于35 ℃下旋蒸至近干后，用1 mL 乙腈潤洗，待凈化。

1.3.2 樣品凈化 取1 mL 上述提取液于裝有20 mg GCB 和40 mg PSA 的離心管中，漩渦混勻，在10 000 r/min 條件下離心3 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，待檢測。

1.3.3 儀器檢測條件

色譜條件：Hypersil GOLD C18色譜柱 (2.1 mm ×100 mm，1.9 μm)；柱溫35 ℃；進樣量5 μL；流動相A 為甲醇溶液，流動相B 為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫條件見表1 (流動相A 和B 的比例均為體積比)。

質(zhì)譜條件：多離子反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) 模式掃描，ESI+電離模式；離子噴霧電壓3 500 V；離子傳輸管溫度320 ℃；噴針溫度300 ℃；霧化氣為氮氣，壓力：中鞘氣 275 kPa，輔助氣 69 kPa，反吹氣6.9 kPa；碰撞氣為氬氣，壓力0.002 kPa；射頻透鏡電壓140 V；定量離子對 (m/z)：284.2-256.0，碰撞能24 V；定性離子對 (m/z)：284.2-95.0，碰撞能16 V。在選定的條件下，腐霉利保留時間為3 .92 min。

表1 梯度洗脫條件Table1 Gradient elution conditions

1.3.4 標(biāo)準溶液配制及標(biāo)準曲線繪制

這一點在孟子對舜與象的關(guān)系建構(gòu)中也能夠得到印證[注]①與“瞽叟殺人”的“親親相隱”問題不同，此處的“受害者”為舜本人。因而此處的首要問題是對于暴力的認識，而非血緣親情與法律的沖突。：“萬章問曰：‘象日以殺舜為事，立為天子，則放之，何也？’孟子曰：‘封之也，或曰放焉?！盵4](P305)孟子與萬章師生此處的討論，顯然是以承認“象至不仁”“日以殺舜為事”這一事實為前提的，然而即使面對殺身之禍，孟子仍勉力于維護舜至善而全能的形象，“仁人之于弟也……親愛之而已矣”，而與基本人性本能、孟子自身強調(diào)的“舍生取義”等相沖突而顯得十分生硬、無奈。

標(biāo)準溶液配制：準確稱取0.050 7 g 腐霉利標(biāo)準品，用甲醇溶解并定容至5 0 m L，配成1 000 mg/L 的標(biāo)準品母液。用甲醇將標(biāo)準品母液逐級稀釋，配成100 和10 mg/L 的標(biāo)準溶液，試驗時再將10 mg/L 的標(biāo)準溶液用甲醇稀釋，配成5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.1 和0.05 mg/L的系列標(biāo)準工作溶液。

基質(zhì)匹配標(biāo)準工作溶液配制：按照1.3.1 節(jié)和1.3.2 節(jié)的方法將空白韭菜樣品進行提取凈化后得到空白基質(zhì)溶液，再用空白基質(zhì)溶液將100 mg/L的腐霉利標(biāo)準溶液逐級稀釋，配成5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.1 和0.05 mg/L 的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準工作溶液。

標(biāo)準曲線繪制：按照1.3.3 節(jié)條件對標(biāo)準工作溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準工作溶液進行檢測，每濃度重復(fù)測定3 次，采用外標(biāo)法定量。以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制腐霉利的溶劑標(biāo)準曲線和基質(zhì)匹配標(biāo)準曲線。

1.3.5 添加回收試驗 向韭菜空白樣品中分別添加0.02、0.2、2.0 和20 mg/kg 4 個水平的腐霉利標(biāo)準工作溶液，每個水平重復(fù)5 次。振蕩混勻并靜置30 min 后，按照1.3.1 節(jié)和1.3.2 節(jié)的方法進行提取凈化，按1.3.3 節(jié)的條件進行分析 (其中添加水平為20 mg/kg 的樣品用乙腈稀釋10 倍后再進樣測定)，計算添加回收率和相對標(biāo)準偏差。

1.4 韭菜中腐霉利殘留的長期膳食暴露評估

根據(jù)規(guī)范殘留試驗中值 (STMR/STMR-P) 或MRL 值，按公式 (1) 計算農(nóng)藥的國家估算每日攝入量，按公式 (2) 計算風(fēng)險商[16-18]。

公式 (1) 中：NEDI (national estimated daily intake) 為國家估算每日攝入量，mg；STMRi(supervised trials median residue) 指農(nóng)藥在某一食品中的規(guī)范殘留試驗中值，mg/kg；STMR-Pi指用加工因子校正后的規(guī)范殘留試驗中值；Fi指一般人群對某種食品的消費量。計算時，若沒有合適的STMR 或STME-Pi值，也可使用所制定的MRL值代替[17]。公式 (2) 中：bw 為體重，中國一般人群的人均體重按63 kg 計算；RQ (risk quotient) 為風(fēng)險商；ADI (acceptable daily intake) 為每1 kg 體重每日允許攝入的農(nóng)藥量，mg/kg (bw)。當(dāng)RQ ≤1 時，可認為該農(nóng)藥殘留量不會對一般人群健康產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險，RQ 越小，表示風(fēng)險越低，并可在此基礎(chǔ)上推薦其MRL 標(biāo)準[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

為提高檢測準確度，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準曲線與溶劑標(biāo)準曲線斜率的比值 (k) 評價基質(zhì)效應(yīng)的強弱[19]：k 值越接近1，表明基質(zhì)效應(yīng)越??；k ＞1 時為增強效應(yīng)；k ＜1 時為減弱效應(yīng)。根據(jù)表2中線性方程斜率之比，計算得到本研究中的k 值為0.86，為基質(zhì)減弱效應(yīng)。

表2 腐霉利的線性方程、決定系數(shù)和定量限Table2 Linear equations, R2 and LOQs of procymidone

2.3 方法的準確度和精密度

添加回收試驗結(jié)果 (表3) 表明，所建立的方法準確度和精密度良好，符合農(nóng)藥殘留檢測要求[15]。韭菜空白樣品及添加樣品色譜圖見圖1，以最小添加水平作為方法的定量限 (LOQ)，則可得腐霉利在韭菜中的LOQ 為0.02 mg/kg，具有較高的靈敏度。

表3 腐霉利在韭菜中的添加回收率及相對標(biāo)準偏差 (n = 5)Table3 The recoveries and relative standard deviation of procymidone in Chinese chives (n = 5)

2.4 腐霉利在韭菜中的最終殘留量

50%腐霉利WP 按有效成分450 g/hm2的劑量，于韭菜灰霉病葉片發(fā)病初期或發(fā)病前期噴霧施藥1 次，結(jié)果 (表4) 表明：腐霉利在韭菜中的殘留量隨時間推移而逐漸降低，施藥后間隔30 d和40 d 所采樣品中，腐霉利的殘留中值分別為0.19和0.13 mg/kg。比較8 個地區(qū)試驗點的殘留結(jié)果發(fā)現(xiàn)，露地栽培韭菜中腐霉利的原始沉積量總體大于大棚，其原因可能是由于露地的開放式環(huán)境使得作物葉面較為干燥，易于藥液的吸收與富集，而大棚環(huán)境濕度較大，不利于藥液的吸收和富集。

2.5 長期膳食暴露風(fēng)險

農(nóng)藥的膳食暴露風(fēng)險由其在農(nóng)產(chǎn)品中的最終殘留量、ADI 值及膳食攝入量等因素共同決定。腐霉利的ADI 值為0.1 mg/kg (bw)[14]；膳食消費量數(shù)據(jù)來源于中國居民人均膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查結(jié)果[20]，由于目前無對應(yīng)登記作物的單獨膳食量數(shù)據(jù)，因此采用分組蔬菜和整體水果的膳食量數(shù)據(jù)進行長期暴露評估；本研究得到的韭菜中腐霉利殘留中值為0.18 mg/kg，遵循風(fēng)險最大化原則，選取同屬于深色蔬菜且具有更高殘留中值的油麥菜進行計算 (本研究長期膳食暴露評估中油菜籽、葉用萵苣、油麥菜及青蒜的殘留中值數(shù)據(jù)均來源于第二屆國家農(nóng)藥殘留標(biāo)準審評委員會第八次會議)，其他作物取MRL 值進行計算，因此本研究的長期膳食暴露評估是結(jié)合了殘留試驗中值和MRL 值的混合評估結(jié)果，以供參考。表5 中結(jié)果表明，腐霉利的國家估算每日攝入量 (NEDI) 為2.556 2 mg，一般人群對腐霉利的長期膳食暴露風(fēng)險商為40.6%，小于1，表明腐霉利按推薦劑量和推薦安全間隔期在韭菜上施用，不會對一般人群的健康產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險。

表4 腐霉利在韭菜中的最終殘留量Table4 The terminal residues of procymidone in Chinese chives

表5 腐霉利長期膳食暴露風(fēng)險評估結(jié)果Table5 Chronic dietary exposure risk assessment results of procymidone

3 結(jié)論與討論

本研究建立了簡便、高效、穩(wěn)定的韭菜中腐霉利殘留量檢測方法，采用QuEChERS 方法進行前處理，樣品經(jīng)乙腈提取，GCB 和PSA 凈化，HPLC-MS/MS 檢測。在0.02～20 mg/kg 添加水平下，腐霉利在韭菜中的回收率為74%～98%，RSD 為4.6%～9.9%，符合農(nóng)藥殘留分析要求[15]。

目前中國在韭菜上登記使用的腐霉利制劑有15%腐霉利煙劑 (SG) 和50%腐霉利可濕性粉劑(WP)，前者用于保護地，后者用于保護地和露地，相比之下，后者的應(yīng)用場所更廣。劉敏艷等[21]采用有效成分劑量相同的百菌清 (chlorothalonil)SG 和WP 在大棚黃瓜上進行對比試驗，施藥1 d后，SG 組的原始沉積量僅為WP 組的3.8%，施藥后2、3、5、7 d，SG 組的消解率均大于WP組，表明與WP 相比，SG 的原始沉積量相對較低且消解速度較快，因此施用煙劑的殘留風(fēng)險相對較低?？紤]到風(fēng)險最大化原則，本研究選擇50%腐霉利WP 進行田間殘留試驗。結(jié)果表明，按推薦最高劑量(有效成分450 g/hm2，制劑量900 g/hm2)于韭菜灰霉病發(fā)病初期或前期施藥1 次，腐霉利在韭菜中的殘留量隨時間推移而逐漸降低，施藥30 d 后，其最終殘留量在0.04～0.96 mg/kg 之間，超出目前韭菜中腐霉利的MRL 標(biāo)準 (0.2 mg/kg)[14]，因此存在一定的殘留超標(biāo)風(fēng)險。

近年來關(guān)于韭菜中腐霉利殘留超標(biāo)的問題時有發(fā)生。呂冰峰等[22]對2018 年國家食品安全監(jiān)督抽檢中蔬菜的抽檢結(jié)果進行分析后發(fā)現(xiàn)，韭菜不合格的原因主要是腐霉利殘留量超標(biāo)。張旭晟等[13]對2016 至2018 年間上海市市售韭菜中腐霉利的殘留情況及居民膳食暴露風(fēng)險進行了評估，得出韭菜中腐霉利的膳食暴露風(fēng)險較低，并提出了應(yīng)進一步收集數(shù)據(jù)完善風(fēng)險評估結(jié)果，以及合理調(diào)整韭菜中腐霉利MRL 標(biāo)準的建議。本研究結(jié)合腐霉利在中國的登記使用情況、田間規(guī)范殘留試驗結(jié)果和居民人均膳食結(jié)構(gòu)所進行的風(fēng)險評估結(jié)果也表明，一般人群對腐霉利的膳食暴露風(fēng)險較低。雖然按照推薦的施藥時期、劑量和方法進行施藥，嚴格依照安全間隔期進行采收，韭菜中腐霉利的最終殘留量仍存在超標(biāo)風(fēng)險，但通過韭菜攝入的腐霉利并不會對一般人群的健康造成不可接受的風(fēng)險，因此同樣也建議應(yīng)對韭菜中腐霉利的MRL 標(biāo)準進行合理調(diào)整。

本研究針對韭菜中腐霉利殘留的長期膳食暴露風(fēng)險進行了評估，但存在以下不足：1) 由于目前尚無韭菜在1 餐或1 d 內(nèi)的大份額膳食數(shù)據(jù)，因此未進行短期膳食暴露評估，導(dǎo)致評估結(jié)果不全面。2) 因缺少對應(yīng)登記作物的單一膳食消費量數(shù)據(jù)，采用分組蔬菜和整體水果的膳食量數(shù)據(jù)進行計算，且鮮玉米和草莓的規(guī)范殘留試驗中值用其MRL 值進行替代，由此所得風(fēng)險評估結(jié)果會明顯高于實際膳食暴露風(fēng)險。喬雄梧[23]分析認為，在采用MRL 值代替規(guī)范殘留試驗中值的情況下，所估算的食品中農(nóng)藥殘留濃度將提高4 倍以上。由此可見登記作物規(guī)范殘留試驗中值基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的完善對膳食風(fēng)險評估結(jié)果的準確性影響較大。相信隨著中國農(nóng)藥殘留膳食暴露評估工作的廣泛開展，有望早日完善食品中農(nóng)藥殘留風(fēng)險評估研究方法和體系，從而得到更為準確、全面的農(nóng)藥殘留膳食暴露評估結(jié)果。