方曉暉，鄒明悅，聶少平，殷軍藝

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

猴頭菇營養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、多糖、膳食纖維以及人體必需的8種氨基酸等營養(yǎng)成分。猴頭菇β-葡聚糖(Hericiumerinaceusalkali-extracted polysaccharide，HEAEP)等作為猴頭菇多糖的代表性多糖成分[1-2]，具有增強免疫功能[3-6]、降低血糖與血脂水平[7]、抗炎[8]、抗氧化[9-10]等活性；此外，β-葡聚糖具有增稠、穩(wěn)定和凝膠特性，可以作為食品添加劑添加到食品中，進(jìn)而保持食品體系的穩(wěn)定性[11]。

抗壞血酸，又稱維生素C，具有抗氧化[12-13]、抗衰老[14]等生物活性，在食品中常被作為營養(yǎng)強化劑和抗氧化劑(高濃度時)；低濃度的抗壞血酸還可作為還原劑[15],引發(fā)氧化反應(yīng)，影響食品中多糖的表觀黏度。

在食品加工過程中，多糖可與抗壞血酸共存[16]，這可能會對多糖及相應(yīng)的食品體系產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度抗壞血酸與過氧化氫結(jié)合會使β-葡聚糖表觀黏度降低[17]，而且β-葡聚糖分子質(zhì)量下降。這是因為多糖與抗壞血酸反應(yīng)過程中有羥自由基形成[16-18],且羥自由基誘導(dǎo)多糖糖苷鍵斷裂，從而導(dǎo)致多糖表觀黏度下降[19]。然而，已有報道缺少對不同作用條件(如pH值、溫度、不同金屬離子、作用時間等)下抗壞血酸與多糖相互作用的系統(tǒng)性研究，同時對多糖結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化關(guān)注不夠，更多的是研究單一濃度下抗壞血酸與金屬離子、過氧化氫等共同作用對多糖降解的影響[20-22]。本實驗擬系統(tǒng)研究不同因素作用下抗壞血酸對HEAEP表觀黏度的影響，并從單糖組成、分子質(zhì)量、糖苷鍵等角度探討各因素相互作用后HEAEP結(jié)構(gòu)特征變化情況，希望為抗壞血酸與β-葡聚糖共存食品的生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

猴頭菇產(chǎn)地為吉林省長白山，購于江西南華藥業(yè)有限公司。

抗壞血酸(純度≥99.0%)、碘甲烷(分析純)、氧化氘(分析純)、單糖標(biāo)準(zhǔn)品(色譜級)包括巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，美國Sigma-Aldrich公司；木糖(色譜級)，百靈威科技有限公司；牛血清蛋白(分析純)、不同分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(色譜級)(Mw為2.0×106、7.0×104、6.0×104、4.0×104、1.0×104Da)和葡萄糖(Mw為180 Da)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250(分析純)，F(xiàn)luka進(jìn)口分裝；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

E2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司；Dionex ICS 5000型離子交換色譜系統(tǒng)、Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo公司；Milli-Q型超純水儀，美國Millipore公司；12 L立式冷凍干燥機，美國Labconco公司；ARES-G2型流變儀，美國TA公司；JSM 6701F型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)，日本電子株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1HEAEP的制備

根據(jù)前期的提取方法[23]，即猴頭菇子實體粉碎過40目篩，稱取一定量的猴頭菇粉，以1∶15的料液比(g/mL)，加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液浸泡24 h，取殘渣沸水浸提、棄水。殘渣分別用0.1 mol/L NaOH與0.01 mol/L NaBH4混合液、0.5 mol/L NaOH與0.01 mol/L NaBH4混合液，按1∶10的料液比(g/mL)提取12 h，過濾、去渣。提取液用3 mol/L HCl中和，離心(4 800 r/min，10 min)、收集上清液，并濃縮至原體積的1/3，加入95%乙醇(乙醇終濃度為80%)醇沉過夜。離心收集沉淀，沉淀依次添加無水乙醇、丙酮和無水乙醚浸泡、洗滌、離心，之后加水復(fù)溶并進(jìn)行Sevag法脫蛋白后蒸餾水復(fù)溶，濃縮、透析36 h，冷凍干燥，得到堿提水溶性HEAEP。

1.3.2HEAEP表觀黏度的測定

1.3.2.1 不同抗壞血酸濃度條件下HEAEP表觀黏度的測定

分別向質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%HEAEP溶液中加入不同濃度的抗壞血酸，并置于55 ℃水浴鍋中，攪拌30 min后于室溫下靜置12 h。用流變儀測定多糖的表觀黏度(夾具直徑為40 mm，測定間隙為0.046 mm)，測試溫度為25.0 ℃，剪切速率為0.1～1 000 s-1，采用TA Orchestrator-7軟件采集數(shù)據(jù)。

1.3.2.2 不同作用溫度條件下HEAEP表觀黏度的測定

將一定濃度的抗壞血酸溶液加入不同溫度的0.25%的HEAEP溶液中，磁力攪拌30 min后于室溫靜置12 h，測定多糖的表觀黏度。

1.3.2.3 不同pH值條件下HEAEP表觀黏度的測定

將一定濃度的抗壞血酸溶液加入不同pH值的0.25%的HEAEP溶液中，在55 ℃的水浴鍋中攪拌30 min，室溫靜置12 h，測定多糖的表觀黏度。

1.3.2.4 不同作用時間條件下HEAEP表觀黏度的測定

將加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025 00%的抗壞血酸的HEAEP溶液置于55 ℃水浴鍋中，攪拌一段時間后，室溫靜置12 h，測定多糖表觀黏度。

1.3.2.5 不同金屬離子條件下HEAEP表觀黏度的測定

分別向0.25%的HEAEP溶液中加入不同濃度的硫酸亞鐵、硫酸銅，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025 00%抗壞血酸溶液，55 ℃下攪拌30 min，室溫靜置12 h，測定多糖表觀黏度。

1.3.3HEAEP結(jié)構(gòu)特征分析

基于1.3.2的實驗結(jié)果，向0.25% HEAEP溶液中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025 00%、0.100 00%的抗壞血酸，在55 ℃水浴鍋中磁力攪拌30 min，室溫靜置12 h。將樣品分別轉(zhuǎn)移至透析袋中，用超純水透析72 h，濃縮、冷凍干燥，依次命名為：HEAEP-1、HEAEP-2(HEAEP-1為0.25%HEAEP與0.025 00%抗壞血酸作用產(chǎn)物，HEAEP-2為0.25% HEAEP與0.100 00%抗壞血酸作用產(chǎn)物)。

1.3.3.1 單糖組成分析

準(zhǔn)確稱取5 mg樣品于厚壁耐壓瓶中，在冰浴條件下加入12 mol/L濃硫酸0.5 mL，磁力攪拌30 min后加入2.5 mL超純水。將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至120 ℃油浴鍋中磁力攪拌2 h，然后將水解液加水定容、稀釋，過0.22 μm水系濾膜，進(jìn)樣檢測[24]。

色譜檢測條件：離子交換色譜系統(tǒng)(配有脈沖安培檢測器)，采用CarboPac PA20分析柱(3 mm×150 mm，Dionex，CA)和CarboPac PA20保護(hù)柱(3 mm×30 mm，Dionex，CA)串聯(lián)使用。流動相：A為250 mmol氫氧化鈉，B為超純水，C為1 mol/L醋酸鈉，D為超純水，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.3.2 分子質(zhì)量分析

將多糖用流動相配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，用0.22 μm尼龍濾膜過濾進(jìn)樣，采用高效體積排阻色譜法(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)-多角度激光光散射(multiangle laser light scattering，MALLS)系統(tǒng)分析檢測[25]。流動相：0.1 mol/L NaNO3(含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%NaN3)，流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量為100 μL。利用ASTRA 6.1軟件采集和分析數(shù)據(jù)。

1.3.3.3 紅外光譜分析

在波數(shù)為4 000～400 cm-1范圍內(nèi)對樣品進(jìn)行紅外光譜分析。

1.3.3.4 糖苷鍵連接方式分析

稱取干燥的多糖樣品2～3 mg于反應(yīng)瓶中，加入1 mL無水二甲基亞砜(DMSO)，攪拌至徹底溶解后加入NaOH 20 mg，室溫下攪拌3 h，滴加無水碘甲烷0.3 mL，于室溫下攪拌反應(yīng)2.5 h后加入蒸餾水終止反應(yīng)。用二氯甲烷(1 mL)萃取反應(yīng)體系，向干燥的甲基化多糖中加入0.5 mL 4.0 mol/L的三氟乙酸，密封并置于100 ℃烘箱中水解6 h，用硼氘化鈉還原。向干燥的水解產(chǎn)物中加入0.5 mL醋酸酐，乙?；? h，得到部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物(PMAA)。PMAA經(jīng)氮氣吹干后復(fù)溶于二氯甲烷中，進(jìn)行GC-MS分析[26]。

1.3.3.5 固體形貌分析

將抗壞血酸處理前后的樣品配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液，置于液氮中冷卻10 min，冷凍干燥。噴金后于SEM下觀察，采用XT Microscope Control軟件釆集圖譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗壞血酸對HEAEP表觀黏度的影響

圖1為抗壞血酸濃度、作用溫度、體系中的金屬離子、pH值和作用時間對HEAEP表觀黏度的影響。由圖1(a)可知，當(dāng)抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.006 25%～0.100 00%時，隨濃度的升高，抗壞血酸降低HEAEP表觀黏度效果越好；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.100 00%時，抗壞血酸降低HEAEP表觀黏度效果最好；當(dāng)抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.100 00%～0.500 00%時，結(jié)果相反。由圖1(b)可知，作用溫度對低抗壞血酸降代HEAFP表觀黏度影響較小。圖1(c)和圖1(d)顯示：過渡金屬離子(Cu2+、Fe2+)，會促進(jìn)抗壞血酸降低HEAEP的表觀黏度，且金屬離子濃度越高，HEAEP表觀黏度下降效果越好；在相同離子濃度下，Cu2+比Fe2+具有更好的降解作用，這與Buettner等[27]的發(fā)現(xiàn)相似。此外，作用時間越長，表觀黏度下降越明顯。圖1(e)顯示，pH值對抗壞血酸降低HEAEP表觀黏度效果也有一定影響，pH值在4時效果最為明顯。Kivel?等[22]也報道了抗壞血酸在pH值為4.5時對HEAEP具有最佳的降解效果。

圖(b)～(f)中抗壞血酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0.025 00%。圖1 不同因素對HEAEP表觀黏度的影響Fig.1 Influence of different factors on apparent viscosity of HEAEP

抗壞血酸在低濃度下作為還原劑，可以引發(fā)氧化反應(yīng)[28],破壞β-葡聚糖結(jié)構(gòu)，從而使β-葡聚糖斷鏈，導(dǎo)致其分子質(zhì)量降低、表觀黏度下降[29]。隨著抗壞血酸濃度的升高，抗壞血酸表現(xiàn)出抗氧化性[30]，使得HEAEP表觀黏度下降程度隨抗壞血酸濃度的升高而變小。在過渡態(tài)金屬離子(Cu2+、Fe2+)存在下，抗壞血酸降低多糖表觀黏度效果更明顯，這可能是基于Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，即將抗壞血酸(AH2)氧化為脫氫抗壞血酸(DHA)，F(xiàn)e3+還原成Fe2+[見式(1)]；同時將分子氧還原為H2O2[見式(2)]，然后在Fenton反應(yīng)中將生成的H2O2分解為羥自由基，同時將Fe2+氧化為Fe3+[見式(3)]。

(1)

(2)

(3)

2.2 抗壞血酸對HEAEP結(jié)構(gòu)特征的影響

根據(jù)圖1(a)的分析結(jié)果，選擇抗壞血酸降解HEAEP效果適中(0.025 00%)和最好(0.100 00%)的條件，作用后所得多糖記為HEAEP-1和HEAEP-2，探究抗壞血酸對HEAEP基本結(jié)構(gòu)特征的影響。

2.2.1抗壞血酸對HEAEP單糖組成的影響

單糖組成分析結(jié)果顯示，葡萄糖(62.22%)是HEAEP的主要成分，這與我們前期的研究結(jié)果[21]相似。HEAEP-1、HEAEP-2葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為64.19%、68.57%，即抗壞血酸作用前后HEAEP糖含量有一定提高。

2.2.2抗壞血酸對HEAEP分子質(zhì)量的影響

圖2為HEAEP的示差檢測器信號圖。由圖2可見，HEAEP分子質(zhì)量分布較寬，主要含有峰1和峰2兩個組分。經(jīng)抗壞血酸作用后，HEAEP-1、HEAEP-2的峰1組分對應(yīng)的洗脫時間逐漸后移，表明經(jīng)抗壞血酸作用后多糖分子質(zhì)量下降。

圖2 抗壞血酸作用前后HEAEP的示差檢測器信號圖Fig.2 HPSEC chromatogram of HEAEP before and after ascorbic acid treatment

2.2.3抗壞血酸對HEAEP官能團的影響

圖3為抗壞血酸作用前后HEAEP紅外光譜圖。由圖3可見，HEAEP在波數(shù)為3 400、2 924、1 420、1 075 cm-1處均有多糖的特征吸收峰。在3 400 cm-1的寬吸收峰是O—H的伸縮振動，2 924 cm-1附近的峰為C—H伸縮振動。在894 cm-1處發(fā)現(xiàn)的吸收峰表明β-葡聚糖的存在?？箟难崽幚砬昂笤诙嗵侵卸寄馨l(fā)現(xiàn)所有這些吸收峰，表明抗壞血酸處理后的HEAEP紅外光譜特征未發(fā)生明顯變化。

圖3 抗壞血酸作用前后HEAEP紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of HEAEP before and after ascorbic acid treatment

2.2.4抗壞血酸對HEAEP糖苷鍵類型的影響

抗壞血酸作用前后HEAEP甲基化分析和GC-MS分析結(jié)果見表2。HEAEP主要包含4種糖苷鍵類型，分別是端基葡萄糖殘基Glcp-(1→)、(1→3)-連接的葡萄糖殘基(→3)-Glcp-(1→)、(1→3，6)-連接的葡萄糖殘基(1→3，6)-Glcp-(1→)，以及少量的(1→6)-連接的葡萄糖殘基(→6)-Glcp-(1→)。HEAEP-1、HEAEP-2主要糖苷鍵類型及其比例與HEAEP基本一致。

表2 抗壞血酸作用前后HEAEP的糖苷鍵類型Tab.2 Types of glycosidic bonds of HEAEP before and after ascorbic acid treatment

2.2.5抗壞血酸對HEAEP固體形貌的影響

圖4為抗壞血酸作用前后HEAEP的SEM圖。由圖4可知，HEAEP主要由線性、片狀以及球狀結(jié)構(gòu)組成，抗壞血酸作用前后HEAEP的微觀結(jié)構(gòu)相似，HEAEP-1和HEAEP-2表面都含有大量的球狀物，且線性與片狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)，這表明抗壞血酸與HEAEP相互作用對多糖固體形貌影響較小。

圖片放大倍數(shù)：5 000倍圖4 抗壞血酸作用前后 0.1 mg/mL HEAEP的SEM圖Fig.4 SEM images of 0.1 mg/mL HEAEP before and after action of ascorbic acid treatment

3 結(jié) 論

以HEAEP為研究對象，將其與抗壞血酸相互作用，系統(tǒng)研究了不同條件(抗壞血酸濃度、金屬離子、溫度、pH值等)下抗壞血酸對HEAEP表觀黏度的影響，并深入分析了抗壞血酸對HEAEP結(jié)構(gòu)特征的影響。在抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.100 00%時，隨著抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，抗壞血酸降低HEAEP表觀黏度效果越好；當(dāng)抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過0.100 00%時，質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，降解效果越差。過渡金屬離子(Cu2+、Fe2+)的添加促進(jìn)了抗壞血酸對HEAEP的降解，且金屬離子濃度越高，HEAEP表觀黏度下降效果越明顯。作用溫度對抗壞血酸降低HEAEP表現(xiàn)黏度效果不明顯。相同條件下，抗壞血酸與HEAEP作用時間越長，表觀黏度下降效果越明顯，作用時間為12 h時表觀黏度下降最多。不同pH值對抗壞血酸降低HEAEP表觀黏度的效果也不同，pH值為4時效果最好。HEAEP與抗壞血酸相互作用后單糖組成和固體形貌無顯著性差異，分子質(zhì)量隨抗壞血酸濃度的增加而減小。由紅外光譜和糖苷鍵分析結(jié)果可知，抗壞血酸作用未對多糖官能團特征峰和糖苷鍵類型產(chǎn)生明顯影響。研究不同環(huán)境下抗壞血酸與HEAEP相互作用，有助于認(rèn)識和分析食品加工過程中，當(dāng)HEAEP與抗壞血酸共存時多糖的降解情況，希望本研究可為猴頭菇來源β-葡聚糖在食品加工中的應(yīng)用提供一定的理論參考。