饒 瑾 王 慧 Nayebare Kakwara Prosper 王 婕 姜 俊 楊秀樹(shù) 劉庭菘 孫芳利

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)工程學(xué)院 杭州 311300； 2.杭州市化工研究院有限公司 杭州 310014)

竹子曾被譽(yù)為“窮人的材料”，但由于其環(huán)保、高效又優(yōu)雅，一躍成為當(dāng)之無(wú)愧的新時(shí)代生態(tài)材料； 尤其在木材資源短缺的當(dāng)下，可持續(xù)、綠色環(huán)保的竹材是替代木材的一個(gè)很好選擇(李延軍等，2016)，可廣泛應(yīng)用于室內(nèi)外家具、地板和裝飾等領(lǐng)域。與木材相同，竹材主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，容易遭受腐朽菌降解，且竹材中豐富的糖類、淀粉和蛋白質(zhì)等也能為霉菌和腐朽菌所利用，在使用過(guò)程中容易發(fā)生腐朽和霉變(孫芳利等，2006)。腐朽會(huì)造成竹材力學(xué)強(qiáng)度下降，嚴(yán)重時(shí)甚至完全失去使用價(jià)值(王文久等，2000)，因此，防腐處理對(duì)于竹材高效和可持續(xù)利用具有重要意義。

目前，竹材防腐大多借鑒木材防腐處理方法，常用的防腐劑有五氯酚鈉、銅鉻砷化合物(chromated copper arsenate，CCA)、銅季胺鹽(ammoniacal copper quaternary，ACQ)和銅唑(copper azole，CA)等，其中五氯酚鈉和CCA因?qū)Νh(huán)境和人畜毒性較大而被禁止或限用(孫芳利等，2017)。相比之下，ACQ和CA可有效抑制真菌侵入，毒性相對(duì)較小，但其最大的缺點(diǎn)是銅流失，長(zhǎng)期使用該類防腐劑不僅會(huì)對(duì)水體和土壤造成一定危害(Schultzetal.，2002)，而且處理材易霉變也使該類防腐劑難以直接用于木竹材保護(hù)，因此非金屬或有機(jī)殺菌劑，如硼化合物、三唑類和天然提取物等，成為木竹材保護(hù)領(lǐng)域研究和應(yīng)用的新方向(Obandaetal.，2008； 周月英等，2013； 沈哲紅等，2009)； 但是這些殺菌劑也存在抗流失性差和長(zhǎng)效性短問(wèn)題。長(zhǎng)期以來(lái)，人們利用鉻的絡(luò)合作用提高銅、鋅和砷在木材中的固著性，如CCA、銅鉻硼(CCB)和銅鉻鋅(CZC)等，而在ACQ和CA中，銅離子則通過(guò)與木質(zhì)素絡(luò)合而固著，前者采用重金屬鉻，對(duì)環(huán)境污染較大，后者對(duì)銅離子的固著性較弱，仍有銅離子流失，也會(huì)造成環(huán)境污染?？梢?jiàn)，探索新的、更為天然環(huán)保的途徑固著具備抑菌和抗菌功能的化合物或基團(tuán)具有重要的科學(xué)價(jià)值和應(yīng)用前景。漆酶是一種從植物和真菌中提取出來(lái)的環(huán)保型生物催化劑(Sharmaetal.，2007； Widstenetal.，2009)，能夠催化氧化碘化物產(chǎn)生碘自由基，還能氧化多種芳香族和非芳香族化合物，在高分子化合物木質(zhì)素的降解和交聯(lián)中起著重要作用(曹明樂(lè)等，2012； Witayakranetal.，2010； Yoshikawaetal.，2012； Prosperetal.，2018)。碘及其衍生物具有較好的殺菌性，且毒性低，但應(yīng)用到木竹材中同樣存在抗流失性差的問(wèn)題(肖忠平等，2010)。 如果能夠通過(guò)漆酶的催化氧化作用將碘固著于竹材上，則可提高竹材的抗菌性能，同時(shí)抗流失性差的問(wèn)題也會(huì)得到一定程度解決。鑒于此，本研究利用漆酶催化氧化碘化物產(chǎn)生碘自由基的特性，探索將具有殺菌或抑菌作用的活性成分固著于竹材上，提高竹材的防腐性能和抑菌成分的固著性，以期為木竹材保護(hù)和改性提供一種環(huán)保、高效的新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材 3～4年生新鮮毛竹(Phyllostachysedulis)采自浙江省杭州市臨安區(qū)三口鎮(zhèn)，去除竹青和竹黃后制成精刨竹條，規(guī)格為20 mm(L)× 20 mm(T)× 5 mm(R)，流失和未流失組中每種處理各設(shè)6個(gè)重復(fù)試樣； 飼木為馬尾松(Pinusmassoniana)和青楊(Populuscathayana)邊材，規(guī)格為20 mm(R)× 20 mm(T)× 5 mm(L)。

1.1.2 菌種 白腐菌選用彩絨革蓋菌(Trametesversicolor)，褐腐菌選用密黏褶菌(Gloeophyllumtrabeum)，購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.3 藥劑 磷酸二氫鉀(KH2PO4，AR，杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)； 碘化鉀(KI，AR，杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)； 2，2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS，上海阿拉丁試劑有限公司)； 活性為0.50 U·mL-1的漆酶(Laccase，Sigma-Aldrich公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 試樣漆酶碘化鉀處理 采用加壓浸漬法將漆酶、碘化鉀和ABTS等藥劑浸漬到竹材內(nèi)進(jìn)行原位反應(yīng)，探究不同酶活的漆酶催化碘化竹材的防腐性能。具體方法如下：首先配制pH=5.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)作為各處理液的溶劑，然后配制不同酶活的漆酶碘化鉀混合溶液，具體配方和編號(hào)按表1進(jìn)行，未經(jīng)任何處理的試樣作為對(duì)照樣。將干燥后的待處理試樣放入500 mL燒杯中，上壓帶孔的玻璃壓片以防試樣浮出，置于真空處理罐中，抽真空至 0.1 MPa，保持30 min后恢復(fù)常壓，吸入配制好的混合溶液，靜置2 h后取出燒杯置于水浴鍋中，40 ℃恒溫處理20 h使其充分反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取出試樣。

表1 試樣處理配方Tab.1 Sample treatment description

1.2.2 流失試驗(yàn) 為探索流失前后竹材的防腐性能變化，按照AWPA E11—2007《Standard Method of Determining the Leachability of Wood Preservatives》進(jìn)行流失試驗(yàn)。具體步驟如下：取處理好的編號(hào)為Control、KI、0.05LAK、0.18LAK和0.60LAK的試樣分別放入500 mL燒杯中進(jìn)行浸漬，將燒杯置于真空裝置中，抽真空至 0.1 MPa，保持30 min，恢復(fù)常壓后取出放在恒溫震蕩器上進(jìn)行流失試驗(yàn)，每種處理設(shè)6個(gè)重復(fù)試樣，按照每個(gè)試樣50 mL加入蒸餾水浸沒(méi)試樣，先每隔6、24和48 h更換1次蒸餾水，后每隔48 h更換1次蒸餾水，共計(jì)14天。收集所有流失液待測(cè)，流失試驗(yàn)后的試樣分別標(biāo)記為L(zhǎng)-Control、L-KI、L-0.05LAK、L-0.18LAK和 L-0.60LAK。

1.2.3 防腐性能試驗(yàn) 參考ASTM D1413—99《Standard Test Method for Wood Preservatives by Laboratory Soil-Block Cultures》，無(wú)菌條件下將待測(cè)腐朽菌分別接入培養(yǎng)皿，在溫度(25±2)℃、相對(duì)濕度75%±5%的環(huán)境中培養(yǎng)2～3周，待菌絲布滿整個(gè)培養(yǎng)皿后，用打孔器從菌絲邊緣取直徑為4.5 mm的菌餅，待用。向培養(yǎng)瓶中加入保水率32.1%、pH6.3的土壤培養(yǎng)基，添加量為115 g·120 cm-3。先將飼木按照每瓶2塊放入，121 ℃蒸汽滅菌鍋中滅菌30 min，然后在無(wú)菌環(huán)境下將上述菌餅放入培養(yǎng)瓶中心，接好后置于溫度(25±2)℃、相對(duì)濕度75%±5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周，使菌絲長(zhǎng)滿飼木。

將流失試樣和未流失試樣置于(103±2)℃烘箱中烘至絕干后稱重(精確到0.001 g)，記為m1。待培養(yǎng)瓶中菌絲長(zhǎng)滿飼木時(shí)，在無(wú)菌條件下將絕干后的試樣接到飼木上，置于溫度(25±2)℃、相對(duì)濕度75%±5%的恒溫恒濕箱中進(jìn)行防腐性能試驗(yàn)。3個(gè)月后取出，輕輕擦拭掉試樣表面的菌絲，氣干3天后置于(103±2)℃烘箱中烘至絕干后稱重，記為m2。以腐朽前后試樣的質(zhì)量損失率(mass loss,ML)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，最終數(shù)據(jù)取平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，具體公式如下：

ML=(m1-m2)/m1×100%。

1.2.4 SEM和XPS分析 為進(jìn)一步研究漆酶催化碘化竹材的防腐性能，選取L-Control和L-0.60LAK經(jīng)白腐菌和褐腐菌侵染后的試樣進(jìn)行SEM和XPS分析。制備橫切面和徑切面樣品，絕干后置于載物臺(tái)上進(jìn)行噴金處理，采用掃描式電子顯微鏡(TM 3030，日本日立)觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)，使用X射線光電子能譜儀(Thermo Fisher Scientific，USA)對(duì)試樣進(jìn)行XPS分析，以單色化A1 Kα射線(1 486.6 eV)為靶材，在真空度小于5×10-7Pa的分析室中掃描試樣，掃描步長(zhǎng)0.1 eV，掃描范圍0～1 100 eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 流失前后竹材防白腐菌效果

圖1為試樣流失前后對(duì)白腐菌的耐腐性能結(jié)果。未處理竹材質(zhì)量損失率為18.75%±1.01%；經(jīng)3個(gè)月腐朽后，單獨(dú)碘化鉀處理竹材質(zhì)量損失率為11.75%±0.82%；漆酶催化碘化竹材的質(zhì)量損失率明顯降低，酶活為0.05、0.18和0.60 U·mL-1的漆酶催化碘化竹材質(zhì)量損失率分別為8.74%±0.78%、8.43%±0.80%和7.92%±0.51%，均低于10%，屬于強(qiáng)耐腐等級(jí)，說(shuō)明漆酶催化碘化竹材可提高竹材的防白腐性能。分析其原因，可能是漆酶作用于竹材中的木質(zhì)素，使其產(chǎn)生自由基，同時(shí)漆酶能夠氧化碘化鉀產(chǎn)生碘自由基，二者反應(yīng)后使碘結(jié)合到木質(zhì)素上，形成具有抗菌作用的復(fù)合物。由于抗菌成分碘與竹材發(fā)生反應(yīng)，提高了碘在竹材中的固著性，這一點(diǎn)在Prosper 等(2018)中已得到證明，漆酶催化碘化竹材后，碘的固著性從3.7%提高至50.1%。若防腐劑能夠通過(guò)化學(xué)結(jié)合固著于竹材中，則能夠抵抗流失，保持穩(wěn)定的防腐性能(王雅梅等，2008)。對(duì)流失后的處理竹材進(jìn)行防腐試驗(yàn)，單獨(dú)碘化鉀處理竹材質(zhì)量損失率升至12.9%±1.22%，漆酶催化碘化竹材質(zhì)量損失率均低于10.5%±1.34%，其中酶活0.60 U·mL-1的漆酶催化碘化竹材防白腐菌效果最佳，質(zhì)量損失率只有9.85%±0.64%(圖1b)。由此得出，漆酶催化氧化碘化鉀處理后竹材具有較好的防腐性能和抗流失性，這一性能將拓寬該防腐技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，為高效、環(huán)保和抗流失的竹材防腐處理提供新思路。

圖1 未流失試樣(a)和流失試樣(b)經(jīng)白腐菌腐朽后的平均質(zhì)量損失Fig. 1 The average mass losses for unleached (a) and leached (b) samples exposed to T. versicolor

2.2 流失前后竹材防褐腐菌效果

白腐菌主要降解木質(zhì)素，褐腐菌主要降解纖維素和半纖維素，因此褐腐菌比白腐菌對(duì)竹材的降解更嚴(yán)重(金重為等，1989； 馬星霞等，2012)。由圖2可知，防腐試驗(yàn)結(jié)束后未處理竹材質(zhì)量損失率為24.95%±0.80%，遠(yuǎn)高于褐腐菌腐朽后的質(zhì)量損失率。單獨(dú)碘化鉀處理能提高竹材的耐褐腐性，質(zhì)量損失率降至14.3%±0.53%。通過(guò)漆酶催化碘化竹材可進(jìn)一步提高竹材的防腐性能，酶活0.05、0.18和0.60 U·mL-1的處理竹材接種褐腐菌后質(zhì)量損失率分別為12.94%±0.81%、9.51%±0.91%和9.44%±0.74%，均低于未處理竹材和單獨(dú)碘化鉀處理竹材，且漆酶酶活越高，防腐性能越好。試樣經(jīng)14天流失試驗(yàn)后，單獨(dú)碘化鉀處理竹材質(zhì)量損失率從14.3%±0.53%提高至15.34%±0.88%，0.60 U·mL-1漆酶催化碘化竹材質(zhì)量損失率從9.44%±0.74%提高至10.35%±0.78%，可見(jiàn)，即使經(jīng)過(guò)流失處理，漆酶催化碘化竹材仍能保持較高的防腐性能。結(jié)合2.1可知，漆酶催化碘化竹材后質(zhì)量損失率均有所下降，3種不同酶活漆酶的防腐效果差距不是特別明顯，但能看出酶活0.60 U·mL-1的漆酶催化碘化竹材不管是否經(jīng)過(guò)流失試驗(yàn)，其質(zhì)量損失率均是最低的，由此說(shuō)明酶活0.60 U·mL-1的漆酶催化碘化竹材防腐效果較佳。

2.3 防腐試驗(yàn)后試樣的形貌變化

采用掃描電鏡觀察流失試驗(yàn)后未處理材和0.60 U·mL-1漆酶催化碘化竹材受腐朽菌腐朽后的微觀結(jié)構(gòu)差異，結(jié)果如圖3、4所示。未處理竹材經(jīng)白腐菌侵染3個(gè)月后菌絲深入細(xì)胞腔，細(xì)胞壁也出現(xiàn)分層松散情況。從縱切面(圖3c)來(lái)看，導(dǎo)管周圍有明顯穿孔現(xiàn)象，且隨著腐朽加深，穿孔開(kāi)始連成一片。一般來(lái)說(shuō)，腐朽菌侵害竹材均是從導(dǎo)管處侵入，在其中大量繁殖后才向周邊擴(kuò)散(陳敏忠等，1995)。從圖3b和圖3d可看出，處理竹材細(xì)胞腔中未見(jiàn)菌絲，各組織結(jié)構(gòu)較完整，未被破壞，這說(shuō)明0.60 U·mL-1漆酶催化碘化竹材具有較好的耐白腐性。

圖2 未流失試樣(a)和流失試樣(b)經(jīng)褐腐菌腐朽后的平均質(zhì)量損失Fig. 2 The average mass losses for unleached (a) and leached (b) samples exposed to G. trabeum

圖3 流失試樣經(jīng)白腐菌腐朽后的SEMFig. 3 SEM of samples after leaching exposed to T. versicolor a和c為未處理材橫切面和徑切面； b和d為處理材橫切面和徑切面。下同。a and c are the transverse section and the radial section of untreated bamboo; b and d are the transverse section and the radial section of treated bamboo.The same below.

未處理竹材經(jīng)褐腐菌腐朽后的質(zhì)量損失率高于白腐菌，這是因?yàn)榘赘纸饽举|(zhì)素能力較強(qiáng)，褐腐菌則破壞纖維素和半纖維素，竹材中纖維素和半纖維素占比大，故質(zhì)量損失率較高。從圖4a可看出，未處理竹材質(zhì)地脆弱，細(xì)胞完整性已遭到嚴(yán)重破壞，不僅細(xì)胞壁變薄、胞間層降解，而且細(xì)胞壁上存在非常明顯的穿孔現(xiàn)象。處理竹材雖然細(xì)胞腔中出現(xiàn)零星菌絲，但是穿孔并不明顯，細(xì)胞壁也未收縮和變形。從縱切面(圖4c)來(lái)看，菌絲深入細(xì)胞腔，從一個(gè)細(xì)胞鉆到另一個(gè)細(xì)胞，常常直接鉆過(guò)紋孔，由此導(dǎo)致菌不斷向鄰近細(xì)胞蔓延，細(xì)胞壁變薄且紋孔破壞，最終使未處理竹材的結(jié)構(gòu)嚴(yán)重降解。處理竹材雖有少量菌絲附著，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，由腐朽菌造成的穿孔較少。從以上分析可證實(shí)褐腐菌侵染竹材造成的降解破壞比白腐菌嚴(yán)重。

2.4 腐朽前后的XPS分析

為進(jìn)一步探索漆酶催化碘化竹材的防腐機(jī)制，對(duì)腐朽前后的0.60LAK處理竹材進(jìn)行XPS分析(表2)。圖5為腐朽前后竹材表面的C1s XPS譜圖，結(jié)合表2可看出，代表木質(zhì)素含量的C1峰經(jīng)白腐菌侵染后下降較多，這是因?yàn)榘赘饕到饽举|(zhì)素，導(dǎo)致木質(zhì)素含量相對(duì)降低，而對(duì)纖維素和半纖維素影響不大。褐腐菌侵染后處理竹材C1和C2峰均下降，是因?yàn)楹指饕到饫w維素和半纖維素，對(duì)木質(zhì)素也有一定改變和降解作用。以上結(jié)果說(shuō)明，白腐菌造成的9.85%質(zhì)量損失率主要源于木質(zhì)素降解，而褐腐菌造成的10.35%質(zhì)量損失率主要源于纖維素和半纖維素降解。腐朽前后O/C變化不明顯，進(jìn)一步說(shuō)明2種菌對(duì)0.60LAK處理竹材氧化程度較低，沒(méi)有造成太大破壞。相關(guān)文獻(xiàn)表明，漆酶可催化氧化竹材木質(zhì)素中的酚羥基形成苯自由基或苯氧自由基，同時(shí)也可催化碘離子形成碘自由基，經(jīng)自由基反應(yīng)后形成C—I共價(jià)鍵(Prosperetal.，2018)。經(jīng)過(guò)14天流失試驗(yàn)，絕大部分可溶的KI或I2都會(huì)從竹材中流失，I/C可用于評(píng)估竹材中C—I鍵的組成情況，0.60LAK處理竹材經(jīng)14天去離子水處理后I/C為0.002 7，這說(shuō)明KI通過(guò)漆酶介體系統(tǒng)與竹材發(fā)生反應(yīng)，從而形成穩(wěn)定的C—I鍵，也正是由于這部分C—I鍵的存在，才使0.60LAK處理材產(chǎn)生一定的防腐性能。

圖4 流失試樣經(jīng)褐腐菌腐朽后的SEMFig. 4 SEM of samples after leaching exposed to G. trabeum

表2 處理材腐朽前后的O/C、I/C以及不同化學(xué)態(tài)C的百分比①Tab.2 O/C ratio, I/C ratio and Carbon states of treated bamboo before and after decaying

圖5 處理竹材腐朽前后表面的C1s XPS譜Fig. 5 C1s XPS spectra of treated bamboo before and after decaying

3 討論

白腐菌和褐腐菌是2種造成竹材腐朽的常見(jiàn)真菌，對(duì)竹材破壞較為嚴(yán)重。腐朽后竹材結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重破壞，質(zhì)地松軟，結(jié)構(gòu)不完整，幾乎失去利用價(jià)值(任紅玲等，2013； 金重為等，1989)。本研究利用漆酶催化碘化鉀產(chǎn)生碘自由基的特性處理竹材，經(jīng)過(guò)3個(gè)月防腐試驗(yàn)和14天流失試驗(yàn)，探索漆酶催化碘化竹材的耐腐性能和抗流失性，并采用掃描電鏡和X射線光電子能譜分析腐朽后試樣的形貌特征和碳氧組成。結(jié)果表明，單獨(dú)碘化鉀處理能在一定程度上提高竹材的防白腐性能。漆酶催化碘化竹材可進(jìn)一步提高防白腐性能，其中酶活0.60 U·mL-1的漆酶防白腐菌效果最佳，質(zhì)量損失率只有7.92%，經(jīng)流失試驗(yàn)后，質(zhì)量損失率略有增加，為9.85%，仍能達(dá)到強(qiáng)耐腐等級(jí)。

褐腐菌腐朽3個(gè)月后未處理竹材質(zhì)量損失率高達(dá)24.95%，這是由于褐腐菌能迅速降解纖維素，從而導(dǎo)致木材組織破壞和強(qiáng)度損失(于文喜等，1994； Zabeletal.，1992)。0.60 U·mL-1漆酶催化碘化竹材質(zhì)量損失率降至9.44%，屬于強(qiáng)耐腐等級(jí)。經(jīng)14天流失試驗(yàn)，0.60 U·mL-1漆酶催化碘化竹材質(zhì)量損失率增加0.91%，說(shuō)明漆酶催化碘化竹材經(jīng)過(guò)流失試驗(yàn)對(duì)褐腐菌仍有較強(qiáng)的抵抗能力。

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，未處理材經(jīng)腐朽菌侵染后細(xì)胞壁松散，且有明顯穿孔現(xiàn)象，導(dǎo)管上的紋孔破壞嚴(yán)重，特別是褐腐菌，這一點(diǎn)與馬星霞等(2012)發(fā)現(xiàn)褐腐菌最先降解的部位是導(dǎo)管細(xì)胞壁的觀點(diǎn)相同。而處理材菌絲少，結(jié)構(gòu)較完整，破壞輕。腐朽后試樣的XPS分析表明，0.60 U·mL-1漆酶催化碘化竹材對(duì)細(xì)胞壁物質(zhì)的降解機(jī)制與文獻(xiàn)報(bào)道一致(杜甫佑等，2005； 金重為等，1989)，白腐菌主要降解木質(zhì)素，褐腐菌主要降解纖維素和半纖維素。

漆酶催化碘化竹材具有一定的防腐和抗流失性能，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，探索生物酶固著低毒或無(wú)毒殺菌劑以提高竹材的耐腐性具有重要意義。

4 結(jié)論

單獨(dú)碘化鉀處理竹材具有一定的防腐效果，但易流失。漆酶催化碘化竹材具有較好的防白腐和防褐腐性能，腐朽菌侵染3個(gè)月后質(zhì)量損失率明顯低于未處理竹材和單獨(dú)碘化鉀處理竹材。漆酶催化碘化竹材具有一定的抗流失性，流失試驗(yàn)后，漆酶催化碘化竹材質(zhì)量損失率低于單獨(dú)碘化鉀處理竹材。利用生物酶催化氧化特性提高低毒或無(wú)毒抗菌劑的防腐性能和抗流失性能將為防腐處理向天然環(huán)保方向發(fā)展提供新的思路。