王 茜 尚麗麗 晏婷婷 陳 媛 付躍進 李改云

(中國林業(yè)科學研究院木材工業(yè)研究所 北京 100091)

沉香為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬(Aquilaria)植物遭遇創(chuàng)傷后在自我修復(fù)過程中形成的含有樹脂的木材，不僅是傳統(tǒng)的名貴藥材，有“藥中黃金”的美譽，也是頂級的天然香料，被譽為“香中之王”(Bardenetal.，2000)，具有極高的經(jīng)濟價值。由于過度開采，目前沉香屬植物均被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅱ，沉香產(chǎn)地溯源可為其合法性提供科學依據(jù)。

沉香物種來源豐富，從南亞次大陸的東北部到印度尼西亞群島、巴布亞新幾內(nèi)亞群島，分布著至少20余種沉香屬植物(Santisuk，2007)。依據(jù)產(chǎn)地和氣味特征，沉香習慣上被劃分為3個產(chǎn)地：產(chǎn)自中國海南、廣東、廣西等地的沉香被稱作莞香系沉香； 產(chǎn)自越南、柬埔寨、老撾等國的沉香被稱作惠安系沉香，也有收藏者將中國產(chǎn)沉香劃入惠安系(Liuetal.，2017)； 產(chǎn)自印度尼西亞、菲律賓、文萊、馬來西亞等地的沉香被稱作星洲系沉香。不同沉香產(chǎn)地主要通過氣味和滋味依賴經(jīng)驗判斷，主觀性強，缺乏科學依據(jù)(Hashimetal.，2016)。近年來，反映物質(zhì)所含化學成分信息的直接分析-飛行時間質(zhì)譜(DART-TOFMS)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)等技術(shù)在產(chǎn)地判別上的應(yīng)用研究日趨增加，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地沉香所含化學成分的組成和含量差異性很大，品質(zhì)也有較大差別(Espinozaetal.，2013； 李遠彬，2017； 賈東宇等，2018)，但尚無法實現(xiàn)產(chǎn)地判別。2-(2-苯乙基)色酮類化合物是沉香的重要指標性成分，對沉香鑒別具有重要意義，尚麗麗等(2018)利用沉香中共有的2-(2-苯乙基)色酮類特征成分建立了適用于野生沉香和人工沉香的高效液相特征圖譜鑒別方法，但僅是2-(2-苯乙基)色酮類的部分化合物，仍有大量化合物未被檢測和利用。目前，對于來自莞香系、惠安系、星洲系沉香2-(2-苯乙基)色酮類化合物的系統(tǒng)研究尚未見報道。

鑒于此，本研究針對不同地區(qū)所產(chǎn)沉香品質(zhì)差別較大以及傳統(tǒng)沉香產(chǎn)地鑒別主要依據(jù)經(jīng)驗判斷等問題，基于高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)技術(shù)進行沉香中2-(2-苯乙基)色酮類化合物的完整分析，篩選不同產(chǎn)地沉香的高效液相色譜指紋特征，并利用指紋特征峰變量進行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA),建立沉香產(chǎn)地判別方法，以期為沉香資源品質(zhì)評價與原產(chǎn)地保護提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

36批試驗樣品采自沉香主產(chǎn)地和市場收集，經(jīng)中國林業(yè)科學研究院木材工業(yè)研究所依據(jù)LY/T 2904—2017《沉香》鑒定。其中，S1～S12為莞香系沉香，S13～S24為惠安系沉香，S25～S36為星洲系沉香。

沉香四醇對照品(成都菲德生物技術(shù)有限公司)，乙腈(色譜純，美國Fisher公司)，甲酸(色譜純，美國Fisher公司)，無水乙醇(分析純，北京化工廠)，超純水(屈臣氏)。三頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，植物粉碎機(德國IKA，A11型)，萬分之一天平(德國Sartorius公司，R2000型)。

1.2 對照品溶液和樣品溶液的制備

按照尚麗麗(2018)對沉香四醇標準品和36批沉香樣品進行處理。

1.3 高效液相色譜分析

高效液相色譜儀，包括高壓二元泵、紫外檢測器、柱溫箱、自動進樣器和工作站(日本島津公司)； 色譜柱為Phenomenex luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)； 柱溫31 ℃； 檢測波長252 nm； 進樣量10 μL； 流速1.2 mL·min-1。HPLC梯度洗脫程序：0～7 min，10%～20%A； 7～13 min，20%～25%A； 13～24 min，25%～30%A； 24～40 min，30%～35%A； 40～41 min，35%A； 41～58 min，35%～42%A； 58～82 min，42%～60%A。

1.4 定性分析

超高效液相色譜-四極桿高分辨飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括高壓二元泵、二極管陣列檢測器、柱溫箱、自動進樣器和工作站(安捷倫科技有限公司)； 色譜柱、流動相、柱溫、進樣量、流速和梯度洗脫程序同上； 質(zhì)譜條件：正離子模式，碰撞氣體為氦氣，高純度氮氣作為霧化器并進行干燥，流速11.0 L·min-1； ESI源； 毛細管電壓3 500 V； 源噴射壓力130 V； 干燥氣體溫度300 ℃； 霧化器壓力30 psi； 離子掃描范圍為全掃描，掃描范圍10～1 000m/z。

1.5 方法學考察

1.5.1 精密度 采用1.2方法平行制備6份樣品溶液，在相同HPLC分析方法下進樣分析，將所得色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(以下簡稱相似度評價系統(tǒng))，以沉香四醇特征峰為參照，計算主要色譜峰相對保留時間的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.5.2 重復(fù)性 采用1.2方法制備沉香樣品溶液，取同一樣品溶液，在相同HPLC分析方法下連續(xù)進樣6次，后續(xù)操作同上。

1.5.3 穩(wěn)定性 采用1.2方法制備沉香樣品溶液，取同一樣品溶液，分別于0、2、4、8、24、36 h在相同HPLC分析方法下進樣分析，后續(xù)操作同上。

1.6 多元統(tǒng)計分析

基于相似度評價系統(tǒng)分析沉香HPLC數(shù)據(jù)，以沉香四醇特征峰為參照，對HPLC 圖譜其他色譜峰的保留時間和峰面積進行校正。選取時間窗寬度為0.2 min，采用中位數(shù)法多點校正自動匹配，尋找共有峰并計算相對峰面積，生成對照圖譜進行相似度計算。以共有峰相對峰面積為變量，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件進行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)和變量投影重要性(variable importance plot，VIP)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜分離條件的優(yōu)化與方法學考察

沉香中2-(2-苯乙基)色酮類化合物數(shù)量眾多，結(jié)構(gòu)相似，沉香四醇等8種化合物是沉香的重要指標性成分，并已針對這些成分建立了適用于野生沉香和人工沉香的高效液相特征圖譜(尚麗麗等，2018)。在保持該特征的前提下，本研究經(jīng)優(yōu)化色譜柱類型、流動相梯度洗脫程序和流速等分離條件，建立了適宜對沉香中2-(2-苯乙基)色酮類化合物進行完整分析的高效液相色譜方法，見1.3。

精密度試驗所得色譜峰的相似度均大于0.99，RSD為0.7%，主要色譜峰相對保留時間的RSD在0.01%～0.14%之間。重復(fù)性試驗所得色譜峰的相似度均大于0.99，RSD為0.5%，主要色譜峰相對保留時間的RSD在0～0.54%之間。穩(wěn)定性試驗所得色譜峰的相似度均大于0.99，RSD為0.6%，主要色譜峰相對保留時間的RSD在0～0.49%之間。綜上可知，方法學考察中主要色譜峰相對保留時間的RSD均小于2%，圖譜相似度均大于0.9，說明該方法重復(fù)性、精密度良好，樣品在36 h內(nèi)穩(wěn)定，符合方法驗證學要求。

2.2 沉香高效液相色譜的產(chǎn)地特征分析與篩選

36批次不同產(chǎn)地沉香的高效液相圖譜經(jīng)相似度評價系統(tǒng)分析，12批次莞香系沉香共得到65個共有峰(圖1)，12批次惠安系沉香共得到29個共有峰(圖2)，12批次星洲系沉香共得到36個共有峰(圖3)。結(jié)合3類沉香的共有峰圖譜，將歸屬于相同化合物的色譜峰編號合并，3個產(chǎn)地共統(tǒng)計出85個特征峰，據(jù)此建立不同產(chǎn)地沉香的高效液相色譜指紋圖譜(圖4)。

圖1 12批次莞香系沉香的HPLC圖譜Fig.1 HPLC characteristic chromatogram of 12 batches of agarwood of Guan-Xiang Zone

圖2 12批次惠安系沉香的HPLC圖譜Fig.2 HPLC characteristic chromatogram of 12 batches agarwood of Hoi-An Zone

圖3 12批次星洲系沉香HPLC圖譜Fig.3 HPLC characteristic chromatogram of 12 batches agarwood of Sin-Chew Zone

圖4 不同產(chǎn)地沉香的HPLC指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprint chromatogram of agarwood from different origins指紋圖譜中3個產(chǎn)地均含有的色譜峰用大寫字母A～O(共15個)標注，某2個產(chǎn)地共有峰用小寫字母a～p(共16個)標注，產(chǎn)地各自共有峰用阿拉伯數(shù)字(共54個)標注。The chromatogram peaks shared by the three origins in the fingerprints are marked with capital letters A-O(15 in total), the peaks shared by a certain two origins are marked with lowercase letters a-p(16 in total), and the peaks shared by each of the three origins are marked with Arabic numerals(54 in total).

圖5 不同產(chǎn)地沉香指紋圖譜熱圖Fig.5 Heatmap of chromatogram peaks in agarwood chromatographic fingerprints from different origins

根據(jù)指紋圖譜中不同產(chǎn)地沉香共有色譜峰信息并結(jié)合前期研究結(jié)果(尚麗麗等，2018)繪制熱圖(圖5)發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地沉香的化學成分差異在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個區(qū)域均有體現(xiàn)。Ⅰ區(qū)相對保留時間0～7 min，主要成分為沉香專屬性成分5，6，7，8-四氫-2-(2-苯乙基)-色酮型色酮(THPECs)(Yangetal.，2016； 尚麗麗等，2018)，3類沉香在該區(qū)域各自共有峰出峰時間和數(shù)量大致相似，僅在色譜峰強度方面有少許差異，說明不同產(chǎn)地沉香在該區(qū)域的化學成分相似，相對含量存在一定差別，其中星洲系沉香樣品的沉香四醇特征峰(id：I)響應(yīng)值極高，可作為星洲系沉香的一個特征； Ⅱ、Ⅲ區(qū)相對保留時間18～36 min，主要成分為5，6，7，8-二環(huán)氧-2-(2-苯乙基)色酮(DEPECs)和5，6-環(huán)氧-2-(2-苯乙基)色酮(EPECs)，這2類色酮被認為是沉香色酮合成過程中的前驅(qū)體和早期中間體(Yangetal.，2016)，莞香系沉香富含這2類色酮，惠安系次之，星洲系較少； Ⅳ區(qū)域相對保留時間37～85 min，主要成分為沉香中廣泛分布的Flidersia型 2-(2-苯乙基)色酮(FTPECs)，莞香系沉香富含較多種類和含量的FTPECs，惠安系次之，星洲系最少。

綜上分析發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地沉香色酮類成分的組成和含量存在較大差異，顯示出一定地域性：1) 莞香系樣品相似度為0.794～0.939，相似度大于0.8的樣品占比91.67%，匹配得到共有峰最多，且共有峰相對峰面積占所有峰面積比例為43.7%，說明莞香系沉香樣品間差異較小，共有成分數(shù)量和相對含量較一致，且色酮種類和數(shù)量最為豐富； 2) 星洲系樣品相似度為0.758～0.920，相似度大于0.8的樣品占比75%，匹配得到共有峰較多，共有峰相對峰面積占所有峰面積比例為25.5%，共有成分數(shù)量較多而相對含量較低，沉香四醇色譜峰極高，其余化合物色酮數(shù)量和相對含量均較低，具有鮮明的地域特征； 3) 惠安系樣品相似度為0.446～0.888，相似度大于0.8的樣品占比31.3%，匹配得到的共有峰數(shù)量較少，共有峰相對峰面積占所有峰面積比例為17.0%，說明惠安系沉香色酮種類繁多，組成復(fù)雜，THPECs和FTPECs占比較多，個別樣品中具有一種高含量的FTPECs(S13)，DEPECs和EPECs相對含量較低，總體色酮相對含量較莞香系稍低，較星洲系稍高。

分析其原因，莞香系沉香樹種主要為A.sinensis(董夢妤等，2016)，惠安系沉香樹種主要為A.crassna、A.baillonii和A.banaense等(傅婷等，2013)，星洲系沉香樹種主要為A.malaccensis和A.filaria(Liuetal.，2017)，不同樹種之間的基因差異可能是不同產(chǎn)地沉香品質(zhì)差異的主要原因。同時，地理環(huán)境分隔會阻礙不同種源間的擴展和基因交流，即使是同一譜系，地域之間也存在一定基因差異(Zouetal.，2012)。本研究中，莞香系沉香與星洲系沉香之間色酮類成分差異較大，HPLC圖譜差異明顯，可能是由于2個產(chǎn)區(qū)地理位置分隔較遠，基因差異相對較大，而惠安系沉香地理位置基本上處于二者中間，HPLC圖譜中，Ⅰ和Ⅳ區(qū)色譜峰較莞香系稍少，響應(yīng)值較高，但Ⅱ和Ⅲ區(qū)較星洲系稍多，響應(yīng)值較低，體現(xiàn)出一定過渡性。此外，沉香品質(zhì)還強烈依賴于生長地域的地理條件和生態(tài)因子，如溫度、光照、水分、土壤和海拔等(Tamulietal.，2005; 朱報著等，2014)，氣溫高、陽光足、降雨量大等外界條件可使沉香結(jié)香效果更好(張靜斐等，2017)，莞香系、惠安系到星洲系沉香產(chǎn)地地理環(huán)境存在緯度逐漸減小、氣溫逐漸升高、降雨量逐漸增多的趨勢，高溫多雨的氣候條件可能一定程度上會加快植物的新陳代謝，從而影響2-(2-苯乙基)色酮的生物合成過程。

2.3 沉香高效液相色譜產(chǎn)地指紋特征的驗證

不同產(chǎn)地沉香高效液相色譜指紋圖譜差異為沉香產(chǎn)地判別提供了基礎(chǔ)，為了更直觀反映利用HPLC指紋特征對沉香產(chǎn)地判別的可行性，進一步結(jié)合多變量統(tǒng)計建立沉香產(chǎn)地判別方法。

PCA利用樣品在主成分得分上的分布可直觀反映出樣品化學成分之間的異同，樣品聚集度高，表明樣品化學成分具有高度相似性，反之，說明存在明顯差異。本研究以36批次沉香85個特征峰的相對峰面積為變量進行主成分分析，色酮類共有峰可用5個主成分刻畫，累計方差貢獻率為62.5%，說明5個主成分對于產(chǎn)地區(qū)分的影響力為62.5%。PCA 得分(圖6)顯示，在前2個主成分二維得分視圖平面上，位于左側(cè)的莞香系樣品與右側(cè)的星洲系樣品可以完全分開，中間的惠安系樣品與其他產(chǎn)地有一定重疊，與產(chǎn)地特征分析結(jié)果一致，即莞香系、星洲系內(nèi)部相似度明顯大于惠安系。

主成分分析對不同產(chǎn)地沉香顯示出一定分類效果，但還無法達到明確區(qū)分的目的，因此，本研究進一步采用OPLS-DA建立分類模型，以實現(xiàn)不同產(chǎn)地間的分類和標志性差異化合物的篩選(阿基業(yè)，2010)。在全部樣品中隨機抽取30批次樣品作為訓練集建立OPLS-DA模型，另外6批次樣品不參與建模，作為驗證集。模型對訓練集和驗證集樣品的判別正確率均為100%，說明采用36批次來自不同產(chǎn)地沉香的85個特征峰作為產(chǎn)地判別方法的變量是可行的。

利用OPLS-DA建立的判別模型對自變量的擬合指數(shù)R2(X)=0.652、對因變量的擬合指數(shù)R2(Y)=0.976，表明 65.2%的自變量(共有峰)變化能夠解釋因變量(產(chǎn)地分類)97.6%的差異，模型主成分回歸系數(shù)Q2=0.611，大于0.5，表明模型預(yù)測能力較強(李遠彬，2017； 皮勝玲等，2017； Gaoetal.，2014)，反映出3個產(chǎn)地間具有明確分離的趨勢(圖7)，與圖譜分析中莞香系沉香與星洲系沉香差異明顯、惠安系沉香在二者之間具有較為明顯的過渡性特征一致。

為了進一步找出對沉香產(chǎn)地分類起貢獻作用的變量，制作OPLS-DA模型的VIP圖(圖8)，VIP代表各變量對模型貢獻率的大小，值越大，貢獻越大。以VIP大于1為界限進行篩選(陳林等，2017； 柯朝甫等，2014； 李永迪等，2017)，有 34個特征峰變量的VIP>1，說明這34個特征峰變量對不同產(chǎn)地沉香樣品分類具有顯著影響(李遠彬，2017)，可作為不同產(chǎn)地沉香的標志性差異化合物(表1)(Lietal.，2016； Liaoetal.，2018； Meietal.，2013； Naef, 2015； Yangetal.，2016； 楊錦玲等，2014； 張倩等，2015)，選取的特征峰變量具有很好的代表性。

圖7 OPLS-DA得分Fig. 7 Score plot in OPLS-DA

圖8 特征峰變量的VIPFig.8 VIP value of the characteristic peak variable

續(xù)表1 Continued

3 結(jié)論

本研究以36批次來自3個不同產(chǎn)地的沉香為研究對象，通過優(yōu)化高效液相色譜分離條件進行沉香中2-(2-苯乙基)色酮類化合物的完整分析，建立不同產(chǎn)地沉香高效液相色譜指紋圖譜。不同產(chǎn)地沉香因樹種、地理位置和生態(tài)環(huán)境等的共同影響，2-(2-苯乙基)色酮類化合物顯示出一定地域性，具有獨特的高效液相色譜指紋特征。利用HPLC圖譜指紋特征結(jié)合OPLS-DA，可實現(xiàn)對莞香系、惠安系和星洲系3個不同產(chǎn)地沉香的判別。