王新新，李金星

腸道微生物是維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要構(gòu)成部分，近年來相關(guān)研究顯示，其對于體內(nèi)多種慢性疾病的進展有著重要的影響[1-2]。特別是對于諸如潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征及克羅恩病等腸道疾病有著直接的關(guān)系，近年來多項研究結(jié)果顯示，腸道菌群改變與動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生和發(fā)展具有顯著的相關(guān)性，腦卒中作為動脈粥樣硬化后期并發(fā)的心腦血管疾病，其病程與腸道菌群的關(guān)系不言而喻[3-4]。由于腦卒中后患者可能出現(xiàn)行動不便、偏癱等情況，可能需要長時間臥床，在Li等[5]研究中此類患者發(fā)生功能性便秘等腸道疾病情況較為多見，這對于患者生存質(zhì)量會產(chǎn)生顯著的影響。宏基因組檢測方法對于菌群定量分析結(jié)果已經(jīng)被多項研究證實相對較好，所以是目前針對腸道菌群分析中效果顯著的一類[6]。本次研究將宏基因組學應用于評價腦卒中長期臥床患者的腸道菌群，目的在于更全面地了解此類患者腸道菌群狀態(tài)，進一步完善全面評價，為今后的調(diào)整治療方案打下良好的基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2019年1～12月于濟南市第五人民醫(yī)院就診的腦卒中患者40例(卒中組)，所有納入樣本均由本人或親屬簽署知情同意書，并報醫(yī)院倫理委員會審核通過。其中臥床超過1月患者20例納入臥床組(n=20)，發(fā)病未超過3 d的20例患者納入非臥床組(n=20)，而后將同期體檢的20例健康人納入對照組(n=20)。納入標準：①腦卒中患者符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》中診斷的相關(guān)標準[7]；②對照組患者體檢報告中無任何疾病狀態(tài)；③所有樣本年齡>18歲；④所有腦卒中患者均為首次發(fā)病。排除標準：①1月內(nèi)抗生素或微生物制劑服用史；②既往慢性腸道疾病史；③嚴重的器官功能障礙；④既往糖尿病、冠心病病史；④非動脈粥樣所致的腦卒中患者。其中臥床組患者平均年齡(54.74±6.97)歲；平均BMI(23.42±2.54)kg/m2；男12例，女8例。非臥床組平均年齡(53.24±7.14)歲；平均BMI(23.51±1.97)kg/m2；男13例，女7例。對照組平均年齡(55.61±8.37)歲；平均BMI(22.97±2.14)kg/m2；男11例，女9例。三組患者一般資料比較無顯著差異，具有可比性(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 糞便樣本收集 患者在納入研究后12 h內(nèi)完成糞便收集工作，使用無菌收納盒收集患者大便15 g，登記編號后放置于-80 ℃環(huán)境保存，并于48 h內(nèi)完成檢測工作。

1.2.2 DNA提取和鳥槍法宏基因組檢測 相關(guān)操作規(guī)程嚴格按照試劑盒相關(guān)標準進行。使用北京索萊寶科技有限公司提供的D2700-50T型糞便基因組DNA提取試劑盒對樣本中DNA進行提取并送至XX科技有限公司進行宏基因組學分析，使用武漢艾美捷科技有限公司P-1020-48型DNA定量試劑盒對提取樣本進行定量，而后使用美國賽默飛世爾公司提供的二代測序快速DNA建庫試劑盒對樣本制備DNA-Seq文庫，并按照試劑盒質(zhì)控標準對上述文庫進行質(zhì)檢。質(zhì)檢通過后的樣本依托于美國Illumina公司提供的Illumina HiSeq 2500測序平臺對樣本進行雙端測序。

1.2.3 菌群分類 對測序結(jié)果進行篩選，將質(zhì)量欠佳或接頭顯著的序列剔除，再與人類參考基因組Hg19作對照以剔除人為原因污染序列。采用最新的MEGAN軟件對鳥槍法宏基因組數(shù)據(jù)進行菌群分類，將結(jié)果應用KEGGⅢ和eggNOG數(shù)據(jù)庫進一步功能注釋。

1.3 觀察指標

主要分析腸道微生物群結(jié)構(gòu)及其α多樣性。微生物群α多樣性指標包括菌群豐度指標(Chao1指數(shù)和ACE指數(shù))以及菌群多樣性(Shannon和Simpson指數(shù))，其中，Chao1和ACE值越大代表物種總數(shù)越多；Shannon值越大，說明群落多樣性越高；Simpson 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 三組腸道菌群α多樣性情況比較

臥床組Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)及Shannon指數(shù)顯著低于其余兩組，Simpson指數(shù)顯著高于其余兩組(P<0.05)；非臥床組Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)及Shannon指數(shù)顯著低于對照組，Simpson指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)。

表1 三組腸道菌群α多樣性情況比較

2.2 三組腸道菌群構(gòu)成情況比較

所有樣本大便均在種的水平上進行主坐標分析計算各組樣本中各單元的豐度差值與豐度總和的比值之間的差異，結(jié)果如圖1A所示，提示三組腸道菌群物種構(gòu)成具有一定差異。將三組患者分為對照組和卒中組，臥床組和非臥床組，而后分別針對兩種比較情況的菌群種類進行標準化后使用Wilcoxon秩和檢驗計算存在顯著差異的菌種，并使用DESeq2計算各組間表達倍數(shù)取以2為對數(shù)后大于1或者小于-1的差異表達基因，而后選擇樣品中菌群平均表達量不小于100的菌種并繪制熱圖，具體見圖1B，三組樣本中共計19個菌群檢出差異。

圖1 三組腸道菌群構(gòu)成情況比較。A：三組腸道菌群水平主坐標分析圖，每個點表示圖中的一個樣本，X軸：PC1值，Y軸：PC2值，坐標中的百分比表示相應的主坐標能解釋原始數(shù)據(jù)差異的比例；B：三組細菌集熱圖，X軸為檢測樣本，Y軸為檢出有差異的細菌(P<0.05)，紅色為高表達，藍色為低表達

2.3 三組關(guān)鍵菌群LEfSe分析情況比較

對三組樣本中差異菌群利用LEfSe進行進一步判別，結(jié)果顯示：Ruminococcaceae、Parabacteroides、Oscillibacter、Lachnospiraceae、Escherichia、Enterobacteriales、Enterobacteriaceae、Clostridium為卒中樣本中優(yōu)勢菌群；而Lactobacillus、Lactobacillaceae、Faecalibacterium、Bifidobacterium、Barnesiella、Bacteroides則為健康樣本中的優(yōu)勢菌群(LDA>4 log10)，具體見圖2A。Bacteroides、Bifidobacterium、Faecalibacterium、Lactobacillaceae、Lactobacillus、Prevotella為非臥床樣本中優(yōu)勢菌群；而Clostridium、Enterobacteriales、Escherichia、Klebsiella、Lachnospiraceae、Phascolarctobacterium、Pseudomonadaceae、Ruminococcus則為臥床組的優(yōu)勢菌群(LDA>4 log10)，具體見圖2B。

圖2 三組LDA值分布柱狀圖。A：健康樣本與卒中樣本比較；B：臥床樣本與非臥床樣本比較

3 討論

近年來，通過有效的急診干預手段可以有效地提升腦卒中患者的治療效果，改善患者預后，但由于部分患者病情重、一般情況差，可能出現(xiàn)長時間臥床的情況[2]。Patejdl等[8]研究中發(fā)現(xiàn)，長時間臥床的腦卒中患者極易發(fā)生胃腸功能紊亂，從而導致功能性便秘等腸道疾病發(fā)生的可能性顯著增加，導致患者生活質(zhì)量顯著下降，甚至影響患者預后。腸道菌群是胃腸道疾病發(fā)生的重要影響因素之一，而對于腦卒中患者腸道菌群的研究結(jié)果也提示菌群種類及豐度均發(fā)生了顯著的變化，相關(guān)研究結(jié)果顯示，腸道微生態(tài)環(huán)境可能與導致卒中發(fā)生的關(guān)鍵因素動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生機制有著直接關(guān)系，其機制主要有以下幾個方面：①菌群失調(diào)可能導致局部感染，腸系膜通透性增加從而導致微生物直接進入循環(huán)系統(tǒng)，影響巨噬細胞分化為泡沫細胞，并誘導白細胞募集，血管平滑肌增殖，這與AS形成機制類似[9]；②微生物入血后可能誘發(fā)機體免疫反應，從而激活參與AS形成的TLR及NOD等受體[10]；③部分微生物群還可能通過磷脂膽堿代謝直接參與到AS的發(fā)生[11-12]；④腸道微生態(tài)環(huán)境與脂代謝水平顯著相關(guān)，環(huán)境改變可能導致脂代謝異常從而導致動脈周樣硬化的發(fā)生[13]。

本次研究中，相較于健康人，腦卒中患者腸道菌群多樣性和多樣性均顯著下降，而通過LEfSe分析結(jié)果提示，Ruminococcaceae、Parabacteroides、Oscillibacter、Lachnospiraceae、Escherichia、Enterobacteriales、Enterobacteriaceae、Clostridium為卒中樣本中優(yōu)勢菌群，其中又以O(shè)scillibacter、Escherichia及Enterobacteriales優(yōu)勢最為明顯。Oscillibacter與體內(nèi)三甲胺N-氧化物水平存在顯著關(guān)系，而三甲胺N-氧化物是三甲胺在肝臟代謝后的產(chǎn)物，其存在已經(jīng)被證實參與到卒中及相關(guān)神經(jīng)損傷的發(fā)生過程中[14]。Escherichia是Enterobacteriales下常見菌屬，Enterobacteriaceae則是其中最常見的菌群，三者同屬腸桿菌科，是人體最常見的致病菌之一，其含量升高可能導致血液內(nèi)炎性因子水平升高，同時激活免疫反應，這些都是導致卒中發(fā)生的重要因素[15]。同時在渠靜等[16]研究中，Ruminococcaceae可以使皮質(zhì)醇增高，5-羥色胺表達上調(diào)，而上述兩個指標與卒中的發(fā)生及發(fā)展有著密切的關(guān)系。同時以往研究顯示Lactobacillus、Lactobacillaceae、Faecalibacterium、Bifidobacterium、Barnesiella、Bacteroides屬于人體常見的益生菌，此類菌群在卒中患者腸道內(nèi)含量顯著下降，也說明有害菌比例增加可能導致卒中的發(fā)生[17-18]。

對比卒中后長期臥床和卒中急性期患者腸道菌群差異結(jié)果顯示，長期臥床患者豐度和多樣性較急性期患者顯著下降，同時菌群中益生菌如Bacteroides、Bifidobacterium、Faecalibacterium、Lactobacillaceae、Lactobacillus含量更低，有害菌如Escherichia、Enterobacteriales、Enterobacteriaceae、Clostridium的含量進一步增加，其中還檢出了Klebsiella、Phascolarctobacterium、Pseudomonadaceae。有研究[19]顯示，Phascolarctobacterium在腦卒中后抑郁患者腸道菌群內(nèi)含量顯著上升，而其原因與卒中所致神經(jīng)損傷誘發(fā)的胃腸道功能障礙顯著相關(guān)，長期臥床患者發(fā)生胃腸道功能障礙的可能性增加，故該菌群的含量會顯著上升。同時還有研究[20]顯示，Phascolarctobacterium含量與腸道內(nèi)三甲胺N-氧化物水平正相關(guān)，說明該菌種還會導致卒中神經(jīng)損傷的可能增加，從而導致惡性循環(huán)誘導患者病情加重，預后顯著變差。Pseudomonadacea中的銅綠假單胞菌及Klebsiella中的肺炎克雷伯均是導致卒中患者肺部感染的常見病原體，在陳玉珺等[21]研究中，銅綠假單胞菌在52例腦卒中肺炎患者中，銅綠假單胞菌檢出率為16.00%；在孫紅崗等[22]研究中，長期臥床的145例卒中患者肺炎克雷伯菌檢出率高達19.31%，結(jié)合本次研究結(jié)果，提示長期臥床的卒中患者發(fā)生呼吸道感染可能與腸道菌群的改變有關(guān)，但其具體機制還有待進一步研究。

本次研究為單中心小樣本量研究，而且部分影響機制尚未得到證實，在今后會進一步完善影響機制的相關(guān)研究，同時還會針對本次研究結(jié)果開展微生態(tài)制劑干預腦卒中長期臥床患者的臨床研究，進一步完善對于腦卒中的治療方案。

綜上所述，腦卒中長期臥床患者腸道菌群多樣性及豐度顯著下降，益生菌被抑制的同時有害菌群含量上升，這可能是影響此類患者疾病發(fā)展及預后的重要因素。