王紅珠，吳華芬，呂高卿，趙云磊，黃立斌，余敏豪，黃長江*

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325000； 2.麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000； 3.麗水市生產(chǎn)力促進(jìn)中心，浙江 麗水 323000； 4.麗水學(xué)院，浙江 麗水 323000)

由于礦產(chǎn)資源的大量開發(fā)利用，各種化學(xué)農(nóng)藥及化肥的廣泛使用，含重金屬的污染物通過各種途徑進(jìn)入土壤，造成土壤重金屬污染日益嚴(yán)重。目前，植物修復(fù)技術(shù)因其與環(huán)境生態(tài)相協(xié)調(diào)等優(yōu)勢，在治理重金屬污染方面具有巨大的應(yīng)用前景[1-2]。該技術(shù)對重金屬富集植物的要求較高，大部分富集植物因適生范圍窄、根系擴(kuò)展深度有限、植株整體生長緩慢等缺陷導(dǎo)致修復(fù)污染土壤所需要的時間漫長[3]。大量研究表明，植物內(nèi)生菌具有促進(jìn)植物生長、降低重金屬脅迫毒害植物等作用，在植物修復(fù)領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用潛力。張凱曄等[4]從田菁種子分離純化得到一株BacillusSC60內(nèi)生菌，并證明該菌可分泌IAA、溶解無機(jī)磷、提高種子活力、促進(jìn)胚根發(fā)育。Li等[5]從高粱根中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌K3-2(Enterobactersp.)，能產(chǎn)ACC脫氨酶、IAA、鐵載體和精氨酸脫羧酶。盆栽試驗表明，菌株K3-2顯著提高了在銅礦廢棄地生長的蘇丹紅高粱的干重和根系銅積累量。

近年來，關(guān)于耐重金屬內(nèi)生菌的研究主要集中在菌株的分離鑒定、促生特性檢測等方面，但關(guān)于產(chǎn)促生物質(zhì)影響因素的研究卻鮮有報道。本試驗以重金屬超富集植物為材料，從中分離篩選出耐重金屬優(yōu)勢內(nèi)生菌，研究其促生特性及影響因素，并模擬重金屬污染環(huán)境，考察其實際促生效果，為內(nèi)生菌植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染的研究提供理論依據(jù)，以推動內(nèi)生菌在植物修復(fù)重金屬污染土壤工程中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

鉆葉紫苑、野茼蒿、牛筋草、博落回采集于麗水市水閣村重金屬污染較為嚴(yán)重的地區(qū)，大豆種子由麗水市農(nóng)科院提供。

冷凍高速離心機(jī)(SIGMA Laborzentrifugen GmbH，3 K 15)，紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司，UV-4802)，原子吸收分光光度計(島津，AA-6300C)等。高氏一號培養(yǎng)基；LB液體培養(yǎng)基；PKO液體培養(yǎng)基；SA液體培養(yǎng)基等。

1.2 耐重金屬內(nèi)生菌的初篩

將外表面消毒的植物組織碾磨并分別置于牛肉膏蛋白胨、馬丁氏和高氏等液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)。吸取0.1 mL富集液涂布于含不同Pb2+濃度的上述3種培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)3～6 d后，挑取抗性優(yōu)勢菌，純化后4 ℃保存。培養(yǎng)基Pb2+濃度分別為100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 mg·L-1。

1.3 耐重金屬內(nèi)生菌的復(fù)篩

將初篩獲得的菌株接種到PKO平板、LB液體培養(yǎng)基(含100 mg·L-1色氨酸)和CAS平板上，28 ℃培養(yǎng)。每天觀察PKO培養(yǎng)基上溶磷圈的大小，判斷溶磷效果。用比色法檢測LB液體培養(yǎng)基，確定產(chǎn)IAA能力。以CAS平板上橙黃色透明圈大小確定產(chǎn)鐵載體能力。根據(jù)溶磷性、IAA與鐵載體的定性測定，篩選出優(yōu)勢菌株。對篩選出的優(yōu)勢菌株進(jìn)行產(chǎn)ACC脫氨酶定性檢測[6]。

1.4 優(yōu)勢抗性菌株的鑒定

觀察優(yōu)勢抗性菌株的菌落形態(tài)、革蘭氏染色和芽孢染色結(jié)果，依據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊，鑒定其種屬。

1.5 優(yōu)勢抗性菌株促生效果影響因素研究

各取1.5 mL菌懸液分別接種于15 mL LB、PKO、SA液體培養(yǎng)基中，于140 r·min-1、28 ℃培養(yǎng)72 h后測其IAA、可溶性磷和鐵載體含量。以單因素試驗考察初始接種量、Pb2+濃度和培養(yǎng)時間對優(yōu)勢抗性菌株促生效果的影響。各因素水平設(shè)置如下：培養(yǎng)時間為1～8 d，重金屬Pb2+濃度分別為0、100、200、300、400、500、600、700 mg·L-1，產(chǎn)IAA試驗的接種量分別為2、3、4、5、6%，可溶性磷和產(chǎn)鐵載體試驗的接種量分別為4、7、10、13、16%。IAA定量檢測采用比色法，磷含量定量檢測參考陳超瓊[7]的方法，鐵載體定量檢測參考雷平[8]的方法。

1.6 優(yōu)勢抗性菌株對大豆生長及其重金屬積累影響

試驗組用優(yōu)勢抗性菌株侵染大豆種子，對照組用無菌水做相同處理，土培介質(zhì)用含Pb2+的霍格蘭氏營養(yǎng)液處理，添加的Pb2+濃度為800 mg·kg-1。培養(yǎng)30 d后，測定大豆植株的生長參數(shù)，并用火焰法測定大豆植株的重金屬含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

本試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)表示。兩樣本之間的比較用t檢驗，多樣本之間的比較使用單因素或雙因素方差分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析作圖使用GraphPad Prism 7.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐重金屬內(nèi)生菌的篩選與鑒定

本試驗從鉆葉紫苑等4種植物中共篩選出24株具有重金屬抗性的內(nèi)生菌，其中3株為內(nèi)生真菌，其余21株均為內(nèi)生細(xì)菌，最高Pb2+耐受濃度為1 000 mg·L-1。對初篩分離的耐重金屬內(nèi)生菌進(jìn)行促生效果鑒定，結(jié)果表明，初篩分離出的24株耐重金屬內(nèi)生菌中，13株能產(chǎn)IAA，17株能產(chǎn)鐵載體，6株具有溶磷效果。其中4株內(nèi)生菌同時具備這3種能力，分別為MZ01、GZ01、GZ02、GY01菌株。菌株GZ01的IAA檢測變色最明顯，鐵載體變色圈和溶磷圈較大，分別為1.10和1.14 mm，且具有產(chǎn)ACC脫氨酶能力，能利用ACC為唯一氮源進(jìn)行生長。因此，選定該菌株為后續(xù)試驗菌種。

耐重金屬內(nèi)生菌GZ01菌落平展，近圓形，中央隆起，白色，有光澤，不透明，邊緣光滑(圖1)。該菌為革蘭氏陽性球菌(圖2)，2～4個菌連成鏈狀，不產(chǎn)芽孢(圖3)。依據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊判斷該菌為鏈球菌屬。

圖1 菌落形態(tài)

圖2 革蘭氏染色結(jié)果

圖3 芽孢染色情況

2.2 菌株GZ01促生效果的影響因素

2.2.1 初始接種量

不同接種量對菌株GZ01產(chǎn)IAA具有顯著影響，對溶磷效果和產(chǎn)鐵載體具有極顯著影響。接種量在2～3%時IAA含量逐漸上升，在3%～6%時IAA含量逐漸降低，IAA含量在接種量為3%時最高，為23.47 μg·mL-1(圖4)。鐵載體活性與磷含量均隨著接種量的增加先上升后下降，同時在接種量為10%時最高，分別為35.84%和8.80 μg·mL-1(圖5～6)。因初始接種量對代謝產(chǎn)物的合成有較大的影響，接種量小，延遲期較長，使繁殖時間延長，營養(yǎng)物質(zhì)耗損過多，導(dǎo)致目的產(chǎn)物產(chǎn)量不高；接種量過大時，菌體迅速生長，溶氧量急劇減小，從而降低次級代謝產(chǎn)物的合成，故在最適接種量下，內(nèi)生菌各產(chǎn)物產(chǎn)量最高。因此，內(nèi)生菌GZ01產(chǎn)IAA的最適接種量為3%，溶磷效果與產(chǎn)鐵載體的最佳接種量均為10%。

圖4 接種量對菌株GZ01產(chǎn)IAA的影響

圖5 接種量對菌株GZ01產(chǎn)鐵載體的影響

圖6 接種量對菌株GZ01產(chǎn)可溶性磷的影響

2.2.2 重金屬Pb2+濃度

不同Pb2+濃度對菌株GZ01產(chǎn)IAA具有極顯著影響，對產(chǎn)鐵載體具有顯著影響。隨Pb2+濃度的增加，IAA含量增高，在500 mg·L-1時達(dá)到最大，之后Pb2+濃度增加，IAA含量趨于穩(wěn)定(圖7)。表明內(nèi)生菌產(chǎn)IAA的能力受Pb2+濃度誘導(dǎo)，且該誘導(dǎo)效果在Pb2+濃度為500 mg·L-1時達(dá)到最強(qiáng)。鐵載體活性單位隨Pb2+濃度的增加而增加，在Pb2+濃度為100～200 mg·L-1時活性穩(wěn)定且保持較高，在Pb2+濃度超過200 mg·L-1后，活性下降，在濃度為200～400 mg·L-1，下降尤為明顯。在Pb2+濃度超過400 mg·L-1后，活性單位變化不明顯，但仍高于30%(圖8)。表明該菌產(chǎn)鐵載體能力受Pb2+誘導(dǎo)，在Pb2+濃度為200 mg·L-1時，該能力達(dá)到最強(qiáng)。過高Pb2+濃度刺激(Pb2+>200 mg·L-1)會抑制鐵載體的分泌，但即使在高濃度Pb2+下，GZ01仍可以產(chǎn)生活性較高的鐵載體(活性>30%)。由于重金屬鉛對可溶性磷化合物有很強(qiáng)的吸附性，能形成難溶性的磷酸化合物，影響試驗結(jié)果。因此，本試驗未涉及Pb2+濃度對可溶性磷含量的影響。

圖7 Pb2+濃度對菌株GZ01產(chǎn)IAA的影響

圖8 Pb2+濃度對菌株GZ01產(chǎn)鐵載體的影響

2.2.3 培養(yǎng)時間

不同培養(yǎng)時間對菌株GZ01溶磷、產(chǎn)IAA和鐵載體的能力具有極顯著影響。1～5 d，IAA含量上升，5～8 d，IAA含量降低，IAA含量在5 d達(dá)到最高值，為34.17 μg·mL-1(圖9)。因此，內(nèi)生菌GZ01合成IAA最適培養(yǎng)時間為5 d。1～6 d培養(yǎng)液中鐵載體含量逐漸升高，在6 d達(dá)到頂峰，為88.41%。6 d之后鐵載體活性下降(圖10)?？芍獌?nèi)生菌GZ01產(chǎn)鐵載體最佳的培養(yǎng)時間為6 d?？扇苄粤缀侩S著時間的變化先升高后降低，在6 d達(dá)到最高峰，為35.41 μg·mL-1，此時溶液中大量難溶性磷轉(zhuǎn)化成可溶性磷，故溶磷效果最佳為6 d(圖11)。

圖9 培養(yǎng)時間對菌株GZ01產(chǎn)IAA的影響

圖10 培養(yǎng)時間對菌株GZ01產(chǎn)鐵載體的影響

圖11 培養(yǎng)時間對菌株GZ01產(chǎn)可溶性磷的影響

2.3 菌株GZ01對大豆生長及其重金屬積累的影響

模擬培養(yǎng)結(jié)果表明，接種GZ01的大豆植株在株高、莖葉鮮重、莖葉干重和Pb2+含量4個指標(biāo)與對照組有極顯著差異(表1)。在添加Pb2+濃度為800 mg·kg-1的條件下，對照組植株體內(nèi)Pb2+濃度為0.32 mg·g-1，染菌組植株體內(nèi)Pb2+濃度為0.25 mg·g-1，比對照組低21.88%。且該處理條件下，染菌組的株高、莖葉鮮重、莖葉干重、根鮮重和根干重分別比對照組增加了137.44%、135.14%、83.33%、15.00%、78.57%。可見，即使在高Pb2+濃度環(huán)境下，菌株GZ01仍對大豆的生長有明顯促進(jìn)作用。推測該菌可能通過分泌IAA，產(chǎn)鐵載體等途徑,降低Pb2+對宿主植物的毒害使幼苗長勢良好。

表1 接種菌株GZ01后大豆生長參數(shù)的變化

3 討論

植物修復(fù)土壤重金屬污染以其高效、低廉、生態(tài)友好、無二次污染等優(yōu)勢被認(rèn)為是最有前景的修復(fù)技術(shù)。但該技術(shù)存在修復(fù)植物生長緩慢，低生物量等問題。如Hammer等[9]通過田間試驗發(fā)現(xiàn)，利用Thlaspicaerulescens修復(fù)土壤Cd2+需10 a時間。McGrath等[10]通過田間試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于修復(fù)植物A.halleri的生物量較低，對Cd2+的吸收能力不強(qiáng)，導(dǎo)致其修復(fù)Cd2+污染效率低下。而植物修復(fù)土壤重金屬污染的關(guān)鍵在于提高富集植物的生物量[11]。故如何促進(jìn)超富集重金屬植物的生長及生物量的增長是目前植物修復(fù)重金屬污染的重點。

本試驗在重金屬污染嚴(yán)重的地區(qū)采集植物樣本，從樣本中篩選得到1株耐鉛性較強(qiáng)的內(nèi)生菌GZ01，經(jīng)鑒定為鏈球菌屬(Streptococcus)。該菌最高可耐受700 mg·L-1Pb2+，且具有溶磷效果，產(chǎn)IAA、鐵載體和ACC脫氨酶等促生物質(zhì)。各單因素試驗結(jié)果表明，菌株GZ01的各項促生特性受時間、Pb2+濃度和初始接種量等因素的影響。在初始接種量為3%、Pb2+濃度為500 mg·L-1條件下，培養(yǎng)5 d，該菌分泌IAA效果最好。在初始接種量為10%，培養(yǎng)6 d，該菌溶磷效果最好。在初始接種量為10%、Pb2+濃度為200 mg·L-1的條件下，培養(yǎng)6 d，該菌產(chǎn)鐵載體效果最好。劉麗輝等[12]研究表明，南方野生稻內(nèi)生細(xì)菌JH50產(chǎn)IAA能力為29.97 mg·L-1。王維[13]的研究表明，內(nèi)生菌分泌IAA隨時間變化先增加后驟然降低。田方等[14]從煙草根際分離出的G-229-21T可產(chǎn)鐵載體活性最高為82.30%，而本試驗中菌株GZ01的鐵載體活性最高可達(dá)到88.41%，比G-229-21T高6.11%，說明內(nèi)生菌GZ01具有很強(qiáng)的促生優(yōu)勢。

在模擬重金屬污染的條件下，菌株GZ01能降低宿主植物體內(nèi)Pb2+濃度，對大豆植株的生長及生物量的積累起促進(jìn)作用。促生效果影響試驗結(jié)果表明，菌株GZ01即使在高Pb2+濃度環(huán)境中，仍具有較強(qiáng)的產(chǎn)IAA和鐵載體的能力。說明該菌可能通過分泌IAA，產(chǎn)鐵載體等方式，調(diào)節(jié)植物生命活動，降低Pb2+對宿主植物的毒害。Babu等[15]從樟子松的根中分離得到了GSB-1菌株(Bacillusthuringiensis)。該菌株可產(chǎn)ACC脫氨酶、IAA和鐵載體等，并且增加了冷杉幼苗的生物量、葉綠素含量，提升了對含重金屬尾礦土壤的植物修復(fù)效果。萬勇[16]將鎘超富集植物龍葵內(nèi)生菌DE5(Variovoraxparadoxu)接種于青葙，發(fā)現(xiàn)與未接種的空白對照組相比，青葙根部生物量增加了125.0%，對鎘的富集能力增強(qiáng)了81%。本文的結(jié)論與Babu等觀點一致，在添加Pb2+濃度為800 mg·kg-1的條件下，染菌組植株的莖葉干重和根干重分別比對照組提高83.33%和78.57%，表明菌株GZ01即使在高濃度的重金屬污染環(huán)境下，仍可大幅度提高宿主植物的生物量，為彌補(bǔ)植物修復(fù)的不足提供新的參考。

綜上所述，耐重金屬內(nèi)生菌GZ01具有產(chǎn)IAA、鐵載體、溶磷等多項促生能力，在重金屬污染的環(huán)境中能促進(jìn)宿主植物生長及生物量的增加，提高植物修復(fù)重金屬污染效率，可將其作為工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)，聯(lián)合植物共同修復(fù)重金屬污染。耐重金屬內(nèi)生菌GZ01在植物體內(nèi)的生命活動規(guī)律，以及在重金屬存在條件下與植物的協(xié)同作用機(jī)理及原位修復(fù)應(yīng)用的實際效果有待進(jìn)一步研究。