廖 青 萬世明 王旭東 高澤霞 ,

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070;2.長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心, 武漢 430070; 3.湖北省名優(yōu)魚育種與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心, 武漢 430070)

肌間骨(Intermuscular Bone, IB), 俗稱肌間刺、魚刺, 是由魚類肌膈結(jié)締組織連續(xù)同源骨化而來的膜骨[1], 根據(jù)自身直接或間接附著的位置可分為椎體小骨、髓弓小骨和脈弓小骨三種類型[2,3]。肌間骨僅存在于低等真骨魚類中, 在系統(tǒng)演化過程中表現(xiàn)出數(shù)目由少到多, 由多到少再到無的特征[3—5]。魚類肌間骨相關(guān)研究早在20世紀(jì)60年代便已開展[6],但多數(shù)研究集中在肌間骨發(fā)育及形態(tài)方面。近年來, 研究人員逐步開展了肌間骨發(fā)生發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制方面的研究。Wan等[7]通過構(gòu)建團(tuán)頭魴肌間骨mRNA與miRNA組學(xué)數(shù)據(jù)庫, 揭示了大量肌間骨發(fā)育的潛在調(diào)控基因[8,9]及其數(shù)目相關(guān)的SNP分子標(biāo)記。陳宇龍等[10]發(fā)現(xiàn)tnmd基因?qū)￠g骨的形成具有一定調(diào)控作用, Nie等[11]研究發(fā)現(xiàn)肌間骨的骨化類型為膜內(nèi)骨化, Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)家族基因?qū)￠g骨的發(fā)育具有潛在調(diào)控作用。但總體來講, 基因與肌間骨發(fā)生發(fā)育的關(guān)聯(lián)性研究還非常缺乏。

膠原蛋白(Collagen)家族成員眾多, 功能多樣。其中, Ⅰ型膠原蛋白(Collagen type Ⅰ, COLⅠ)是骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分, 由col1a1和col1a2基因編碼。Ⅱ型膠原多分布于骨骼和關(guān)節(jié)等組織, 由col2a1基因編碼。哺乳動(dòng)物中相關(guān)研究表明Ⅰ型和Ⅱ型膠原參與骨骼的礦化和生長(zhǎng)過程[13—16]。在魚類中, 膠原蛋白基因在骨骼發(fā)育中的表達(dá)調(diào)控作用也已被報(bào)道, 如col1a1在骨骼畸形的金頭鯛(Sparus aurata)中表達(dá)下調(diào)[17],col10a1的表達(dá)在青鳉(Oryzias latipes)中標(biāo)志著成骨細(xì)胞的早期階段[18]等;Gistelinck等[19]以斑馬魚為模型研究了大量Ⅰ型膠原突變體的骨骼表型, 包括愈傷組織形成和肋骨彎曲等。但截至目前, 膠原蛋白在肌間骨發(fā)生發(fā)育過程中的表達(dá)調(diào)控作用還未知。

團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)隸屬于鯉形目(Cypriniformes), 鯉科(Cyprinidae), 鲌亞科(Culterinae), 魴屬(Megalobrama), 是我國特有的重要草食性經(jīng)濟(jì)魚類之一[20]。團(tuán)頭魴包含軸上肌中的髓弓小骨和尾部軸下肌中的脈弓小骨兩種肌間骨, 其成年個(gè)體的肌間骨形態(tài)較為復(fù)雜。孵出后20d左右, 團(tuán)頭魴幼魚出現(xiàn)第一根肌間骨; 孵出后40d左右肌間骨基本完全出現(xiàn); 之后隨著魚體的生長(zhǎng), 肌間骨的形態(tài)不斷分化復(fù)雜[21]。尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)生長(zhǎng)速度快, 肉質(zhì)鮮美, 是世界上僅次于鯉的主要養(yǎng)殖魚類, 也是我國主要養(yǎng)殖魚類之一[22]。羅非魚背部和尾部肌肉中均無肌間骨的存在[23], 即羅非魚無髓弓小骨和脈弓小骨。因此, 這兩種魚類可作為探究魚類肌間骨發(fā)生發(fā)育分子機(jī)制的比較模型。為探究膠原蛋白基因表達(dá)模式與魚類肌間骨發(fā)育的相關(guān)性, 本研究以有肌間骨的團(tuán)頭魴和無肌間骨的尼羅羅非魚為研究對(duì)象, 探究有刺魚和無刺魚Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化特征, 并進(jìn)一步分析了Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因在個(gè)體不同發(fā)育階段以及不同部位肌肉組織中的表達(dá)模式, 為發(fā)掘硬骨魚類肌間骨形成的潛在分子調(diào)控提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用團(tuán)頭魴1齡樣本和出膜幼苗均來自湖北百容良種有限公司; 尼羅羅非魚1齡樣本購自海南水產(chǎn)品市場(chǎng), 出膜幼苗由廣東海大集團(tuán)友情提供。為測(cè)定Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平, 隨機(jī)抽取3尾1齡團(tuán)頭魴[平均體重(143.23±53.77) g], 3尾1齡尼羅羅非魚[平均體重(775.23±26.88) g], 用MS-222麻醉后解剖, 每個(gè)標(biāo)本采集背上肌、尾上肌和尾下肌組織樣品(包含肌間骨)。對(duì)于5—60 dph(Days post hatching, dph)的團(tuán)頭魴和尼羅羅非魚幼魚, 使用MS-222麻醉后, 采集尾部肌肉,采樣周期為5d。所有組織在采樣后立即用液氮冷凍, 然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存待用。

1.2 Total RNA提取及cDNA合成

用Trizol法(TaKaRa, 大連)從-80℃凍存的肌肉樣品中提取Total RNA, 并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性。使用 NanoDrop ND-2000核酸蛋白儀(Thermo, 美國)測(cè)定RNA濃度及質(zhì)量。參照HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix(Vazyme Biotech Co.,Ltd., Nanjing, China)試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后, 于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因的克隆

Ensembl上下載斑馬魚col1a1a(ENSDART0000 0009393.6)、col1a1b(ENSDART00000015092.9)、col1a2(ENSDART00000042990.4)和col2a1b(ENSDART00000047844)的cDNA序列, 與課題組之前已獲得的團(tuán)頭魴尾部肌肉轉(zhuǎn)錄組序列[24]進(jìn)行blast比對(duì), 獲得團(tuán)頭魴col1a1a(MN580510)、col1a1b(MN 580511)和col1a2(MN580512)的完整CDS序列和col2a1b基因的部分CDS序列。利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì), 送北京擎科生物科技有限公司武漢分公司合成(表1), 以轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用1%瓊脂糖檢測(cè)產(chǎn)物質(zhì)量后, 將條帶單一的PCR產(chǎn)物送往武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序獲得的目的基因片段與已知片段比對(duì)拼接, 獲得團(tuán)頭魴col2a1b(MN580514)的完整CDS序列。尼羅羅非魚col1a1(ENSONIT00000008 027.1)、col1a2(ENSONIT00000013579.1)和col2a1b(ENSONIT00000006473.1)的CDS序列直接從Ensembl數(shù)據(jù)庫下載獲得。

表1 團(tuán)頭魴col2a1b基因克隆相關(guān)引物信息Tab.1 Primers used for col2a1b gene clone

1.4 Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因的同源性分析

使用NCBI ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線預(yù)測(cè)基因開放閱讀框, 使用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)分析Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白的理化性質(zhì)。用DNAMAN軟件比較尼羅羅非魚和團(tuán)頭魴col1a1(a/b)、col1a2、col2a1b基因的相似度。使用NCBI BLAST查找并下載與目的基因同源性較高的序列, 使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因定量表達(dá)分析

參照已獲得的Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白基因的序列信息, 以β-actin為內(nèi)參基因, 設(shè)計(jì)定量引物(表2), 送武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。以團(tuán)頭魴和尼羅羅非魚不同發(fā)育時(shí)期樣品和1齡魚不同組織樣品cDNA為模板, 參照試劑盒Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix (Low Rox Plus)(翊圣, 上海)說明進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算。使用SPSS軟件及Duncan’s Multiple Range Test來比較基因在幼魚不同發(fā)育時(shí)期及不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平。

表2 基因qRT-PCR相關(guān)引物信息Tab.2 Primes used for qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 基因克隆及基因理化性質(zhì)分析

基于序列同源性, 使用斑馬魚和草魚基因序列克隆拼接了團(tuán)頭魴Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白序列, 并在線驗(yàn)證開放閱讀框的完整性。最終獲得團(tuán)頭魴Ⅰ型膠原蛋白col1a1a、col1a1b、col1a2及Ⅱ型膠原蛋白col2a1b的核心序列。其CDS序列長(zhǎng)度依次為4347、4353、4059和3741 bp, 分別編碼1448、1450、1352和1246個(gè)氨基酸。使用ProtParam 軟件對(duì)基因進(jìn)行理化性質(zhì)分析(表3)。

2.2 基因同源性分析

使用DNAMAN對(duì)人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)、雞(Gallus gallus)、豬(Sus scrofa)、羊(Ovis aries)、團(tuán)頭魴(M.amblycephala)及其他魚類的Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白基因的氨基酸序列進(jìn)行比較,并使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示,團(tuán)頭魴與斑馬魚4個(gè)基因的氨基酸相似度分別達(dá)到了94.23%(col1a1a)、90.46%(col1a1b)、93.32%(col1a2)和84.77%(col2a1b), 序列同源性較高(圖1)。團(tuán)頭魴和尼羅羅非魚基因的氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示:團(tuán)頭魴col1a1a、col1a1b和尼羅羅非魚col1a1三個(gè)基因的氨基酸相似度為83.39%, 團(tuán)頭魴col1a1a較尼羅羅非魚col1a1的序列插入了157個(gè)氨基酸, 團(tuán)頭魴col1a1b較尼羅羅非魚col1a1的序列插入了159個(gè)氨基酸; 團(tuán)頭魴與尼羅羅非魚的col1a2的氨基酸序列相似度為67.38%, 團(tuán)頭魴較尼羅羅非魚的col1a2序列插入了272個(gè)氨基酸; 團(tuán)頭魴與尼羅羅非魚col2a1b的序列相似度為74.8%, 團(tuán)頭魴較尼羅羅非魚存在245個(gè)氨基酸的缺失(圖1)。Ⅰ型和Ⅱ型膠原的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示魚類與哺乳類和家禽類的遺傳距離比較遠(yuǎn), 形成2個(gè)大分支。在魚類大分支中, 針對(duì)有無髓弓小骨和脈弓小骨, 4個(gè)基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析都顯示團(tuán)頭魴、草魚和斑馬魚等有刺魚聚在一支, 而尼羅羅非魚、半滑舌鰨和青鳉等無刺魚聚在一支(圖2)。

2.3 基因在不同組織的差異表達(dá)分析

以1齡團(tuán)頭魴和1齡尼羅羅非魚為材料, 采用qRT-PCR方法分析col1a1(a/b)、col1a2和col2a1b在軀體不同部位肌肉組織中的表達(dá)情況, 結(jié)果顯示:Ⅰ型膠原蛋白(col1a1和col1a2)在團(tuán)頭魴背部、尾部上方及尾部下方中的表達(dá)量依次下降, 在羅非魚中則呈先上升后下降趨勢(shì)(圖3A和3B)。團(tuán)頭魴col1a1a的表達(dá)水平顯著高于col1a1b,col1a1a在團(tuán)頭魴背部、尾部上方及尾部下方肌肉中的表達(dá)量依次顯著降低(P＜0.01),col1a1b的表達(dá)則無顯著性差異(P＞0.05)。羅非魚col1a1在尾上側(cè)肌肉中的表達(dá)量高于背側(cè)肌肉中的表達(dá)量, 但二者無顯著性差異(P＞0.05)。團(tuán)頭魴與羅非魚col1a2基因的表達(dá)模式與col1a1類似, 兩種魚類col1a2在背上肌肉與尾上側(cè)肌肉中的表達(dá)量高低相反, 而在尾部上方與尾部下方肌肉中的表達(dá)量均顯著性(P＜0.01)下降。此外, 表達(dá)分析結(jié)果表明col2a1b在團(tuán)頭魴背部、尾部上方及尾部下方肌肉中的表達(dá)量依次降低, 在羅非魚相應(yīng)部位的表達(dá)量則依次升高(圖3C)。團(tuán)頭魴尾部上方與尾部下方肌肉中col2a1b的表達(dá)無顯著差異(P＞0.05), 背部肌肉中的高表達(dá)量與尾部肌肉中的低表達(dá)量有極顯著差異(P＜0.01); 而羅非魚col2a1b在三個(gè)部位的肌肉中的表達(dá)依次顯著升高(P＜0.05)。此外, 結(jié)果還表明Ⅰ型膠原蛋白基因在團(tuán)頭魴(col1a1a和col1a1b)各部位肌肉組織中的表達(dá)量波動(dòng)幅度都高于羅非魚(col1a1, 圖3A)。

2.4 膠原蛋白基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)分析

本研究采用qRT-PCR方法分析了目標(biāo)基因在團(tuán)頭魴和尼羅羅非魚5—60 dph的表達(dá)變化。如圖4所示, 團(tuán)頭魴col1a1a從5—15 dph的表達(dá)呈上升趨勢(shì), 在20—40 dph表達(dá)量降至極低且無顯著差異(P＞0.05), 而在50 dph左右表達(dá)量又出現(xiàn)極顯著(P＜0.01)上升, 60 dph時(shí)表達(dá)量降低但仍在較高水平;col1a1b基因在各階段的表達(dá)水平相對(duì)較低且較為穩(wěn)定, 各階段之間無顯著差異(P＞0.05),col1a1b在15、50及60 dph的表達(dá)量顯著低于col1a1a(P＜0.01)。尼羅羅非魚col1a1的表達(dá)呈先上升后下降再回升的趨勢(shì), 從15 dph左右開始極顯著(P＜0.01)上升, 在30 dph左右達(dá)到峰值, 40 dph左右表達(dá)量開始逐漸降低, 60 dph時(shí)表達(dá)水平又開始回升。在尼羅羅非魚10—60 dph的發(fā)育過程中, 連續(xù)的每2個(gè)階段間均有極顯著差異(P＜0.01)。團(tuán)頭魴col1a1a基因在15、50和60 dph的表達(dá)都比羅非魚col1a1基因在對(duì)應(yīng)時(shí)期的表達(dá)更為活躍。團(tuán)頭魴的col1a1a在15、50及60 dph表達(dá)豐度極高, 表達(dá)量為相鄰階段的數(shù)十倍, 與其余各階段均有極顯著差異(P＜0.01);尼羅羅非魚的col1a1在15和60 dph左右表達(dá)上升,變化幅度較小, 但與相鄰階段依然有極顯著差異(P＜0.01)。

表3 團(tuán)頭魴Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白基因的理化性質(zhì)Tab.3 Physicochemical properties of type Ⅰ and type Ⅱ collagen genes in M.amblycephala

圖1 團(tuán)頭魴與尼羅羅非魚Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因氨基酸序列比較Fig.1 Comparison of amino acids of type Ⅰ and type Ⅱ collagen genes in M.amblycephala and O.niloticus

圖2 Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of type Ⅰ and type Ⅱ collagen genes

團(tuán)頭魴和尼羅羅非魚不同生長(zhǎng)階段的col1a2在尾部肌肉中的表達(dá)模式非常相似, 整體呈先上升后下降, 再回升的趨勢(shì)(圖5)。團(tuán)頭魴col1a2的表達(dá)在5—30 dph呈逐漸上升趨勢(shì), 到30 dph左右極顯著(P＜0.01)上升到達(dá)峰值, 30—60 dph的表達(dá)為先下降后上升再下降的過程, 相鄰階段間的變化均有極顯著(P＜0.01)差異。尼羅羅非魚在5—30 dph呈上升趨勢(shì), 從15 dph開始極顯著(P＜0.01)上升, 到25 dph左右表達(dá)水平達(dá)到最高, 25與30 dph的表達(dá)無顯著差異(P＞0.05); 30—60 dph的表達(dá)為先下降后上升的過程, 相鄰階段間的變化均有極顯著(P＜0.01)差異。此外,col1a2基因在團(tuán)頭魴多個(gè)階段的表達(dá)都比羅非魚對(duì)應(yīng)階段更加活躍。

如圖6所示, 團(tuán)頭魴在尾部肌肉不同發(fā)育階段的表達(dá)呈現(xiàn)了2次上升和下降的過程, 相鄰兩階段間均有極顯著差異(P＜0.01); 尼羅羅非魚的表達(dá)僅呈現(xiàn)一次先上升后下降的過程, 在5—15 dph的表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。團(tuán)頭魴col2a1b表達(dá)水平的2個(gè)峰值出現(xiàn)在15和50 dph左右, 尼羅羅非魚col2a1b表達(dá)水平的峰值出現(xiàn)在30—40 dph左右,30與40 dph的表達(dá)水平無顯著性差異(P＞0.05), 但與25和50 dph有極顯著差異(P＜0.01)。

圖3 col1a1(A)、col1a2(B)和col2a1b(C)在團(tuán)頭魴和羅非魚不同肌肉組織中的表達(dá)Fig.3 Expression of col1a1 (A), col1a2 (B) and col2a1b (C) in the different tissues of M.amblycephala (M.a) and O.niloticus (O.n)

圖4 col1a1在團(tuán)頭魴和羅非魚不同發(fā)育階段中的表達(dá)Fig.4 Expression of col1a1 at different developmental stages of M.amblycephala (M.a) and O.niloticus (O.n)

3 討論

本研究對(duì)魚類Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因表達(dá)模式與魚類肌間骨發(fā)生發(fā)育的調(diào)控相關(guān)性進(jìn)行了探究。在克隆獲得團(tuán)頭魴col1a1a、col1a1b、col1a和col2a1b基因CDS序列基礎(chǔ)上, 比較分析了膠原蛋白基因在團(tuán)頭魴與尼羅羅非魚不同部位肌肉組織和不同發(fā)育時(shí)期(5—60 dph)尾部肌肉中的表達(dá)模式, 為探究Ⅰ、Ⅱ膠原蛋白基因在魚類肌間骨發(fā)育過程中的潛在調(diào)控作用提供了一定的理論基礎(chǔ)。本研究系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,col1a1、col1a2和col2a1在有刺魚和無刺魚都各自聚為一支, 提示這些基因與魚類肌間骨表型形成潛在相關(guān)。研究還表明魚類的col1a1b與col1a1a在進(jìn)化樹中明顯分為2支, 魚類的col1a1b與人、鼠和雞等高級(jí)脊椎動(dòng)物的col1a1更為靠近, 推測(cè)魚類的col1a1在基因復(fù)制過程中發(fā)生了功能的分化[25], 魚類col1a1b與高等脊椎動(dòng)物同源性更高。

膠原蛋白能夠引導(dǎo)鈣鹽沉積, 參與骨骼礦化[14],并通過其受體系統(tǒng)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[15]。膠原蛋白基因在團(tuán)頭魴和尼羅羅非魚不同組織中的表達(dá)分析結(jié)果顯示, Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因在團(tuán)頭魴背上肌肉中的表達(dá)量高于尾部, 而在羅非魚中尾部肌肉的表達(dá)量高于背部。團(tuán)頭魴Ⅰ型膠原蛋白從背部到尾部肌肉的表達(dá)呈逐步下降趨勢(shì), 而肌間骨的生長(zhǎng)是從尾端向頭端發(fā)育[21], 尾端肌間骨的成熟度較高, 團(tuán)頭魴Ⅰ型膠原的表達(dá)與肌間骨的發(fā)育相吻合。與團(tuán)頭魴相比, 羅非魚沒有髓弓小骨和脈弓小骨[23], Ⅰ型膠原蛋白在尾部上方肌肉中表達(dá)量最高, 可能是因?yàn)棰裥湍z原對(duì)肌肉質(zhì)地的重要影響[26]。相較于尼羅羅非魚,col2a1b在團(tuán)頭魴背部肌肉組織中的表達(dá)量最高, 與團(tuán)頭魴Ⅰ型膠原的表達(dá)模式相似, 推測(cè)Ⅱ型膠原與肌間骨的生長(zhǎng)發(fā)育有一定的相關(guān)性[16]。不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)圖譜顯示, 在團(tuán)頭魴中,col1a1a和col2a1b基因在15和50 dph分別達(dá)到高峰, 且以col1a1a的表達(dá)變化最為顯著; 在尼羅羅非魚中,col1a1的表達(dá)量在30和60 dph分別達(dá)到峰值,col2a1b的表達(dá)在30 dph達(dá)到最高峰。據(jù)萬世明等[21]的觀察, 團(tuán)頭魴的肌間骨在20 dph左右開始萌發(fā), 至40 dph左右基本全部出現(xiàn)。在本研究中團(tuán)頭魴Ⅰ型膠原蛋白在15 dph(肌間骨出現(xiàn)前)出現(xiàn)第1次表達(dá)峰值, 可能是因?yàn)楣趋赖V化需要大量的膠原補(bǔ)充[13,14];第2次表達(dá)峰值(50 dph)出現(xiàn)在肌間骨完全出現(xiàn)后的快速生長(zhǎng)期, 這可能是因?yàn)棰裥湍z原能增強(qiáng)成骨細(xì)胞的成骨能力, 并在一定程度上決定骨的韌性和質(zhì)量[13—15], 所以其表達(dá)在肌間骨的成熟和固化過程中再次上調(diào)。在本研究中, 團(tuán)頭魴的col1a1a在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量差異巨大, 峰值極高, 與col1a1b的表達(dá)水平有明顯差異, 與進(jìn)化樹分析結(jié)果相吻合, 提示col1a1在進(jìn)化過程中發(fā)生了功能的分化[25];col1a1a在15和50 dph表達(dá)豐度極高, 提示col1a1與魚類肌間骨發(fā)育存在潛在關(guān)聯(lián)。

圖5 col1a2在團(tuán)頭魴和羅非魚不同發(fā)育階段中的表達(dá)Fig.5 Expression of col1a2 at different developmental stages of M.amblycephala (M.a) and O.niloticus (O.n)

圖6 col2a1b在團(tuán)頭魴和羅非魚不同發(fā)育階段中的表達(dá)Fig.6 Expression of col2a1b at different developmental stages of M.amblycephala (M.a) and O.niloticus (O.n)

本研究通過肌腱和骨發(fā)育相關(guān)的Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白基因的CDS區(qū)克隆和同源性分析, 推測(cè)魚類Ⅰ型和Ⅱ型膠原與魚類肌間骨的表型相關(guān)。結(jié)合尼羅羅非魚和團(tuán)頭魴不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)分析, 明確col1a1基因的表達(dá)與魚類肌間骨發(fā)育有一定的關(guān)系, 為肌腱發(fā)育形成肌間骨提供了一定的理論支持。