顧 琴, 姬秋彥, 梁疆莉, 高 娜, 李婧妍, 蔡路奎, 史 荔, 孫明波, 馬 艷

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所聯合實驗室，云南 昆明 650118)

白喉(diphtheria)是一種急性上呼吸道傳染病，由革蘭陽性白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheria)引起[1], 主要侵犯咽部形成灰白色假膜, 能產生強烈的外毒素, 通過血液循環(huán)將毒素擴散, 引起多種器官病變[2]。白喉一直是嚴重危害廣大少年兒童身體健康的主要傳染病之一[3], 起病急、進展快, 嚴重者可出現急性喉梗阻、神經麻痹、中毒性心肌炎、中毒性腎病等并發(fā)癥而危及生命[4]。接種疫苗是預防白喉最有效、最經濟的防控手段。白喉疫苗在研制及生產過程中，原始菌種需經多次傳代，建立種子庫，工作種子批菌種也需多次傳代制備成疫苗。在此過程中，菌種可能會發(fā)生變異，從而引起生物學性狀的改變。因此，研究菌種的遺傳穩(wěn)定性對于疫苗抗原的穩(wěn)定性及疫苗的免疫效果有重要影響[5]。之前大多采用一代測序技術對菌種進行核酸序列測序分析基因突變，但一代測序成本高、通量低、無法大規(guī)模進行，因此出現了第二代測序技術(next generation sequencing, NGS)，NGS具有高通量、高速度、高分辨率和低成本等特點[6-7]。前期使用NGS對百日咳疫苗用菌株進行了遺傳穩(wěn)定性研究，取得較好的結果[8]。在此基礎上，本研究采用NGS監(jiān)測白喉棒狀桿菌在傳代建庫及生產過程中白喉毒素結構基因的突變情況，并采用蛋白免疫印跡技術確證相關蛋白，為疫苗的質量研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheria)PW8株CMCC38007購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬丁培養(yǎng)基、菌種培養(yǎng)基(2.59% N.Z amine)、產毒培養(yǎng)基(3.33% N.Z amine)，均由中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所溶液組提供。

1.1.3 試劑與儀器 E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit(貨號E139650)購自美國Omega公司；白喉抗毒素國家參考品(批號0048，一抗)購自中國食品藥品檢定研究院；辣根酶標記兔抗馬IgG(貨號PAB9272，二抗)購自Abnova公司。10 L細菌發(fā)酵罐(C10-3，德國賽多利斯公司)；GelDoc XR Biorad凝膠成像系統(tǒng)(XRS，Bio-RAD公司)；SDS電泳儀(P25T，Bio-RAD公司)；半干轉膜儀(TURBO，Bio-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌種的傳代和制備 將白喉棒狀桿菌PW8株原始菌種接種至馬丁培養(yǎng)基連續(xù)傳3代，制備主代種子庫(P3)；主代種子在馬丁培養(yǎng)基連續(xù)傳4代，制備工作種子庫(P7)；工作種子接種于菌種培養(yǎng)基連續(xù)傳4代，制備疫苗代次(P12)；疫苗代次再在產毒培養(yǎng)基上連續(xù)傳3代的第3代V3代次(P15)。以上各代次分別留樣待檢測。

1.2.2 二代測序分析白喉毒素基因穩(wěn)定性 ①細菌基因組DNA的提取：采用E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit分別提取白喉棒狀桿菌PW8株主代種子、工作種子、疫苗代次和V3代次的白喉毒素基因組DNA。②DNA測序：將提取的DNA樣品送上海源序公司構建DNA文庫，并進行白喉棒狀桿菌毒素基因二代測序。③序列分析：以Q30的值表示測序質量，質量值越高代表堿基被測錯的概率越小，測序可靠性越高。再將測序結果與GenBank中登錄的相應序列(基因庫登錄號為DT：CP003216.1)進行比對，并分析主要抗原序列的堿基突變情況及突變率，特別是與結構和免疫原性相關的重要位點的突變率。

1.2.3 菌株抗原結構確證分析 ①DT結構預測：二代測序后的堿基序列通過DNAMAN軟件翻譯成蛋白質，再利用Phyre 2 軟件預測出白喉毒素結構，該預測結構與文獻發(fā)表的白喉毒素結構模型進行比對。②蛋白免疫印跡檢測：將2018001、2018002、2018003共三批白喉純化液經電泳后轉至PVDF膜上，再與白喉抗毒素國家參考品(1∶400)室溫反應1.5 h，PBS-T洗4次；再與辣根酶標記的兔抗馬IgG(1∶30 000)室溫反應1 h，PBS-T洗4次，加1 mL BeyoECL Plus顯色液后于Dynamica凝膠成像系統(tǒng)顯色。

2 結果與分析

2.1 主要堿基位點突變率分析

2.1.1 各代次測序可靠性分析 白喉棒狀桿菌主代代次和工作代次平均測序長度為150 bp，疫苗代次和V3代次平均測序長度為300 bp；總堿基數均值為7 647×106；Q30值為88.28%～93.96%，見表1。表明本次二代測序結果可靠性較高。

表1 白喉棒狀桿菌各代次菌株二代測序數據結果

2.1.2 抗原基因主要位點的突變率分析 白喉棒狀桿菌主要抗原全基因序列主代代次最高突變率為A580C 0.46%、A868C 0.46%，這2個位點均位于3個結構區(qū)域中的T區(qū)(α-螺旋區(qū))，屬于白喉毒素B肽鏈，不是主要抗原區(qū)域，這2個位點其他代次突變率分別為工作代次A580T 0.47%、A868C 0.39%，疫苗代次A580G 0.43%、A868C 0.32%，V3代次A580C 0.45%、A868C 0.18%；工作代次最高突變率為A580T 0.47%，位于3個結構區(qū)域中的T區(qū)(α-螺旋區(qū))，屬于白喉毒素B肽鏈，不是主要抗原區(qū)域，該位點其他代次突變率分別為主代代次A580C 0.46%、疫苗代次A580G 0.43%、V3代次A580C 0.45%；疫苗代次最高突變率為T507G 0.64%，位于3個結構區(qū)域中的C區(qū)(催化區(qū))，屬于白喉毒素A肽鏈，是主要抗原區(qū)域，但突變率較低，該位點其他代次突變率分別為主代代次T507G 0.16%、工作代次T507G 0.37%、V3代次T507G 0.49%；V3代次最高突變率為T507G 0.49%，位于3個結構區(qū)域中的C區(qū)(催化區(qū))，屬于白喉毒素A肽鏈，是主要抗原區(qū)域，但突變率較低，該位點其他代次突變率分別為主代代次T507G 0.16%、工作代次T507G 0.37%、疫苗代次T507G 0.64%，以上最高突變位點突變率均小于1%，見圖1。能影響白喉毒素進入細胞和催化活性的36個堿基位點中，442堿基位點的各代次均比其他位點偏高(0.41%)，其他位點均小于0.45%，見圖2。

圖1 白喉棒狀桿菌各代次主要抗原堿基位點突變率

圖2 白喉棒狀桿菌各代次36個堿基位點突變率

2.2 抗原蛋白結構確證分析

2.2.1 結構預測確證分析 預測結構(圖3A)與文獻發(fā)表的白喉毒素結構模型(圖3B)[9]比對分析后發(fā)現，兩個結構模型均呈現出3個功能區(qū)：①C區(qū)(催化區(qū))：堿基位點為1～510 bp，以α+β-折疊為特征，屬于A肽鏈，有毒性，可使細胞內延伸因子-2(EF-2)失活；②R區(qū)(受體區(qū))：堿基位點為1 141～1 605 bp，β-膠管狀受體區(qū)，位于B肽鏈C末端；③T區(qū)(α-螺旋區(qū))：堿基位點為511～1 140 bp，中心α-螺旋區(qū)，位于B亞單位，酸性條件下介導插入紙質雙分子層，幫助A亞基的C區(qū)進入細胞質基質。對比后顯示：預測模型與文獻發(fā)表結構模型一致，初步說明白喉毒素蛋白結構正確。

圖3 白喉毒素測序預測結構與文獻發(fā)表結構比較

2.2.2 蛋白免疫印跡(WB)試驗結構確證分析 三批白喉毒素純化液蛋白WB試驗中，均在約58 kD處出現印跡條帶，蛋白大小與預期一致，且無雜條帶印跡，結果見圖4。根據一抗是針對白喉毒素的抗體，說明此條帶是白喉毒素蛋白，且純度較高。

圖4 白喉毒素蛋白免疫印跡

3 討 論

本研究對建立的白喉棒狀桿菌的主代種子(P3)、工作種子(P7)和疫苗代次(P12)及疫苗代次繼續(xù)傳3代的第3代V3代次(P15)，共4個代次菌體的白喉毒素抗原序列進行二代測序，檢測該菌株在傳代過程中主要抗原基因的突變情況，分析菌種的遺傳穩(wěn)定性。

白喉毒素包含3個結構區(qū)：C區(qū)(催化區(qū))堿基位點為1～510 bp，屬于A肽鏈，以α+β-折疊為特征；T區(qū)(α-螺旋區(qū))堿基位點為511～1 140 bp，位于B肽鏈；R區(qū)(受體區(qū))堿基位點為1 141～1 605 bp均位于B肽鏈。B肽鏈C端與細胞表面受體結合，促使白喉毒素(diphtheria toxin，DT)內吞，急速酸化，低pH引起DT結構的改變，并導致空泡型ATP酶質子泵運行，改變結構后的DT在B亞單位的輔助下，插入細胞膜，形成跨膜離子通道，使A亞單位進入細胞質，在細胞質中DT-A在核內體胞漿中進行重折疊，還原二硫鍵，之后被釋放到細胞質中。在細胞質中DT-A催化ADP-核糖由輔酶(NAD)向延伸因子2的轉化，由此使蛋白質的合成失活和阻塞，最終使細胞死亡[10]。主要抗原全基因序列主代代次、工作代次最高突變率在白喉毒素B肽鏈的T區(qū)，不是主要抗原區(qū)域，疫苗代次、V3代次最高突變率在白喉毒素A肽鏈的C區(qū)，是主要抗原區(qū)域，但突變率較低，均小于1%。目前被廣泛研究的能影響白喉毒素進入細胞和催化活性的氨基酸位點為21(His)、50(Try)、54(Tyr)、65(Tyr)、143(Glu)、148(Glu)、150(Try)、308(Pro)、349(Glu)、352(Asp)、365(Ile)、508(Ser)[11-16]，相對應的堿基位點為61、62、63,148、149、150,160、161、162,193、194、195,427、428、429,442、443、444,448、449、450,922、923、924,1 045、1 046、1 047,1 054、1 055、1 056,1 093、1 094、1 095,1 522、1 523、1 524。這36個堿基發(fā)生改變會使相應的氨基酸也發(fā)生改變，從而使白喉A肽鏈的催化活性失活或阻斷跨膜過程。其中922、923、924，1 522、1 523、1 524位點堿基與突變株型別相關。因此二代測序結果中，針對這12個氨基酸相對應的36個堿基進行了比對分析后發(fā)現，442堿基位點的各代次均比其他位點偏高(0.41%)，可能由于堿基偏好性引起，其他位點均小于0.45%。大量事實表明, 細菌在億萬年的進化過程中, 基因組通常是保持相對穩(wěn)定的，以此來實現種系的繁衍, 但同時也需要一定的變異性來適應環(huán)境的變化，即自然突變，自然突變率很低，且無規(guī)律性[17-18]。也有研究表明，疫苗菌毒株在合理的生產工藝過程中，一般無基因突變，若不合理的生產工藝，則會造成極高突變率出現[19]。研究中該36個堿基位點及抗原全基因組中，突變率均保持較低水平，且同一個位點不同代次的堿基突變呈不規(guī)律性，突變率沒有出現隨菌株傳代代次增加突變率逐漸增高趨勢，均呈不規(guī)律性，說明傳代過程中該36個堿基位點及抗原全基因組遺傳較為穩(wěn)定，也說明了該菌株的低突變率是與菌種本身特性有關。

預測蛋白結構與文獻結構比對后顯示，預測蛋白二級結構與文獻發(fā)表結構一致，初步說明白喉毒素蛋白結構正確。蛋白免疫印跡試驗能夠特異性結合相應的抗體，說明本品白喉毒素蛋白的結構正確。

本研究二代測序結果顯示，不同代次的白喉棒狀桿菌主要抗原基因突變率較低，特別是主要抗原位點中與催化活性相關的堿基突變率較低，這與之前一代測序結果一致[20]；預測結構模型與文獻發(fā)表結構模型一致，蛋白免疫印跡試驗也顯示蛋白結構正確。說明建立的白喉棒狀桿菌PW8株的主要抗原基因序列在傳代過程中，主代、工作代、疫苗代及疫苗后3代的突變率均保持較低的突變水平，遺傳較穩(wěn)定，相對應的蛋白結構正確，為后續(xù)進行疫苗研制提供參考。