周寰宇，江宇航，張關令，徐美余，蔡賽波，張棋麟*，林連兵*

(1.昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650500；2.云南省高校飼用抗生素替代技術工程研究中心，云南 昆明 650500)

抗生素在飼料中長期不規(guī)范使用，導致畜禽體內出現細菌耐藥性等問題，給環(huán)境和人類健康帶來嚴重威脅。2006年歐盟已經全面禁止抗生素在飼料中的應用，我國農業(yè)農村部近期在《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案(2018-2021年)》中也明確指出，將于2020年7月1日起，全面退出抗生素在飼料端的使用，使開發(fā)新型高效的抗菌制劑迫在眉睫。二甲酸鉀(potassium diformate，KDF)是一種有機酸鹽，分子結構簡單，具有完全的生物降解性，作為一種酸化劑，能夠通過抑制耐酸性細菌生長，起到促進生長性能的作用[1]。二甲酸鉀是歐盟于2001年批準的第一個用于替代抗生素促生長的綠色添加劑，且于2005年被我國正式批準使用于飼料中[2]。此外，二甲酸鉀作用宿主的高度專一性使其在殺滅病原菌的同時，對正常菌群不會產生較大干擾。因此，二甲酸鉀在抗生素替代添加劑方面具有良好的應用潛力。腸道菌群在宿主的健康與疾病中扮演了重要的角色，被稱為宿主的第二基因組。目前，隨著高通量測序技術的發(fā)展，檢測腸道菌群應用于各類疾病的研究已成為研究熱點，越來越多的研究證明，腸道菌群的紊亂是部分疾病的誘因[3]。例如，通過對腹瀉仔豬與健康仔豬腸道菌群進行研究，發(fā)現腹瀉仔豬的腸道菌群物種豐度相較于健康仔豬發(fā)生了顯著變化，導致了功能發(fā)生紊亂[4]。特別是目前抗生素濫用現象的愈發(fā)嚴重，動物產生疾病時會大量服用抗生素藥物，這不僅嚴重破壞了動物的腸道菌群平衡，還致使諸多耐藥性細菌產生。研究表明，有機酸和益生菌等潛在的替抗產品對于動物的生長、改善腸道菌群，構建腸道菌群健康等方面具有良好的促進功能[5]。然而，迄今為止，人們對二甲酸鉀如何影響白羽肉雞腸道菌群的認識仍較為有限。白羽肉雞養(yǎng)殖自1979年就已開始啟動，因其生長速度快、肌肉蛋白質含量高等特點，在我國肉雞類供應中占有重要地位。近年來，在“飼料禁抗”的背景下，肉雞產業(yè)因疾病造成經濟損失的風險在加大，替代抗生素的添加劑越來越重要[6]。因此，本研究選擇白羽肉雞作為動物模型，通過在飼糧中添加替代抗生素產品二甲酸鉀與抗生素產品金霉素制劑進行比較，評估二甲酸鉀與金霉素對白羽肉雞生長性能和腸道菌群的影響，從而證實二甲酸鉀的安全性及替代抗生素應用于畜禽養(yǎng)殖的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 3日齡健康白羽肉雞苗、無添加肉雞基礎日糧(見表1)[7]，均由昆明三正生物科技(集團)有限公司生產提供。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平

1.1.2 主要試劑 飼用金霉素、二甲酸鉀制劑，均由昆明三正生物科技(集團)有限公司生產提供，TIANamp Stool DNA Kit(天根生物技術公司，中國)試劑盒，AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒。

1.1.3 主要儀器與設備 全自動高壓蒸汽滅菌器(LDZF-75KB-II，上海申安)；超凈工作臺(FCH，沈陽龍騰電子有限公司)；電子天平(AS-102002A，天津)；超純水器(JIDI-UP basic，MilliPore)；離心機(LX-100，麒麟醫(yī)用)；超低溫冰箱(BC-203HCN，日本三洋電器股份有限公司)；真空采血管、飼料混勻器、鑷子、手術剪等。

1.2 方法

1.2.1 飼料配制與分組 供試添加劑分成6個組方，組方①：無添加肉雞基礎日糧(組名為CHE)；組方②：基礎日糧中按50 mg/mL添加飼用金霉素制劑(組名為CKB)；組方③：基礎日糧中按0.1%(質量分數)添加二甲酸鉀制劑(組名為KDF6)；組方④：基礎日糧中按0.3%(質量分數)添加二甲酸鉀制劑(組名為KDF7)；組方⑤：基礎日糧中按0.5%(質量分數)添加二甲酸鉀制劑(組名為KDF8)；組方⑥：基礎日糧中按0.7%(質量分數)添加二甲酸鉀制劑(組名為KDF9)，試劑濃度均為昆明三正生物科技(集團)有限公司產品指導濃度；所有日糧均按等氮等能原則配置，飼喂日糧分為0～14 d和15～28 d兩個批次，營養(yǎng)標準滿足NRC(1998)。以上飼料組方制劑配制好后保存在陰涼干燥處備用。將378只3日齡健康白羽肉雞，隨機分為6個組，每組63只，分組詳情如表2所示，每組共設3個重復，每個重復21只白羽肉雞。其中CHE為空白對照組，其余為處理組。試驗周期為28 d，以《GB/T 19664-2005》為飼養(yǎng)標準，分籠飼養(yǎng)，常規(guī)免疫，自由采食和飲水。

1.2.2 生長性能測試 試驗期間每日記錄采食量，分別于第1、7、14、21、28天早上8:00空腹稱重，計算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。ADFI(g/d)=總耗料量/試驗天數，ADG(g/d)=總增重/試驗天數，F/G=ADFI/ADG，其中每個分組選取5只健康白羽肉雞進行稱重，每只獨立重復3次稱重，并以促進生長最佳濃度作為后續(xù)試驗濃度。

1.2.3 腸道菌群測序及分析 試驗第28天時，取空白對照和金霉素制劑以及促生長最佳二甲酸鉀組，每組取5只健康白羽肉雞，稱肉雞活重，用乙醚麻醉法處死并解剖。將雞盲腸無菌結扎后保存于-20 ℃冰箱，用于腸道微生物多樣性檢測。根據最優(yōu)試驗結果評估，選取CHE、CKB、FDK7共3組進行腸道微生物多樣性測序分析，每組測3個生物學重復樣品?？侱NA的抽提使用TIANamp Stool DNA Kit試劑盒，嚴格按照其說明書進行。提取得到的總DNA，以通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增各樣品總DNA上的16S rRNA基因的V3～V4區(qū)序列。PCR反應體系及條件參照文獻[8]。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒將目標片段切膠回收。利用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統對PCR產物進行檢測定量，并根據結果將各樣品等量混合，而后HiSeq文庫進行高通量測序，樣品測序和分析由百邁客生物科技有限公司三代測序平臺完成。

1.2.4 測序數據處理與分析 使用FLASH Version 1.2.7軟件，通過overlap對每個樣品的reads進行拼接，得到的拼接序列即原始Tags數據；然后使用Trimmomatic Version 0.33軟件，對拼接得到的原始Tags數據進行過濾，得到高質量的Tags數據；最后使用UCHIME Version 4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數據。得到的有效數據基于百邁客云平臺微生物多樣性分析樣本的alpha多樣性和Beta多樣性。

1.2.5 統計學分析 所測得數據均包含3次生物學重復，結果以平均值±標準差(SD)的方式呈現。所有實驗數據采用Excel 2010進行初步整理分析，應用IBM SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析，Alpha多樣性指數和Beta多樣性指數的組間差異分析選用t檢驗，顯著差異水平P<0.05。采用one-way ANOVA的單因素方差分析和最小顯著差異法(least-significant difference，LSD)測驗不同處理的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 二甲酸鉀對白羽肉雞生長性能的影響

分別按照6個組方飼喂白羽肉雞，在28 d的試驗周期內，記錄并計算出每組的料重比(F/G)來評估每組的生長狀況。飼喂不同劑量二甲酸鉀，發(fā)現隨著濃度的增加料重比出現先下降后上升的趨勢，在添加0.3%(KDF9)時白羽肉雞的料重比最高，而添加0.7%(KDF7)料重比最低，但均與空白組(CHE)相比存在顯著差異(P<0.05)(圖1)。結果表明，不同劑量的二甲酸鉀與金霉素添加劑量對白羽肉雞生長性能均有提升效果，KDF7的影響效果最好。

圖1 同處理之間的生長性能比較

2.2 測序數據

將促進生長的最佳二甲酸鉀濃度和金霉素以及空白對照，3組實驗的9個白羽肉雞腸道菌群樣本進行構建文庫測序。共得到713 630條原始序列，質量控制后，得到710 426高質量序列，質控有效率達99.55%，堿基平均長度為417 bp。單獨樣品的測序結果如表2所示。同時，有效率為84.05%。

表2 不同白羽雞腸道菌群樣品16S rDNA測序基本信息

2.3 腸道菌群多樣性結果分析

在獲得OTU豐度矩陣后，對三組白羽肉雞腸道菌群進行Alpha與Beta多樣性分析，使用Chao1和Ace指數衡量物種豐度，使用Shannon和Simpson指數用于衡量物種多樣性(表3)。分析CKB、KDF組與空白組CHE之間的ACE、Chao1、Shannon、Simpson等alpha多樣性指數，發(fā)現CKB組和KDF組的Shannon指數均低于空白組，同時KDF組的Shannon指數低于CKB組，均存在顯著差異(P<0.05)；CKB組和KDF組的Simpson指數均高于空白組，KDF組的Simpson指數與空白組相比存在顯著差異(P<0.05)，而CKB組的Simpson指數與空白組相比無顯著差異(P>0.05)；CKB組和KDF組的Chao1指數與空白組對比無顯著差異(P>0.05)。

表3 多樣性指數統計

在相同物種豐度的情況下，Shannon指數值越大，Simpson指數值越小，說明樣品的物種多樣性越高，Chao1值越大表示物種越多，Good′s Coverage用于計算覆蓋率，值越大表示覆蓋越好。說明金霉素和二甲酸鉀都可以顯著得提高白羽肉雞的腸道菌群物種多樣性，同時二甲酸鉀的在提高腸道菌群物種多樣性作用上比抗生素效果更好；對比KDF與CKB組之間的α多樣性指數發(fā)現，KDF組的Simpson、ACE、Chao1與CKB組不存在顯著差異(P>0.05)，說明二甲酸鉀與抗生素對于白羽肉雞腸道菌群結構影響效果相似。Coverage指數均大于0.999，說明測序結果已基本覆蓋測序樣本的多樣性。

在本研究中，分別使用Weighted Unifrac算法與Bray-Curtis距離進行PCoA分析及NMDS統計，如圖2A與圖2B所示，PC1占總方差的65.63%，PC2占總方差的34.37%，空白組與金霉素組和二甲酸鉀組樣品距離明顯分開，說明空白組與金霉素組和二甲酸鉀組的樣品菌群結構主成分具有顯著差異。在無度量多維標定法統計(NMDS)中，Stress(壓力)=0.000，小于0.2，說明分組及抽樣方法可靠。

圖2 三組樣本腸道菌群的PCoA(A)和NMDS(B)

2.4 腸道菌群組成及優(yōu)勢菌群相對豐度分析

對白羽肉雞腸道菌群測序數據進行注釋后，得到門、屬等分類單元信息。從表4看出，白羽肉雞日糧中添加二甲酸鉀28 d后，在門水平分類上，二甲酸鉀處理組和空白組比較，厚壁菌門豐度百分比下調了近16%，擬桿菌門豐度百分比上調了近24%，變形菌門豐度百分比下調了近6%，Epsilonbacteraeota豐度百分比下調了1.2%。結果表明，在門水平上，飼喂二甲酸鉀提高了白羽肉雞擬桿菌門的豐度，降低了厚壁菌門、變形菌門和Epsilonbacteraeota的豐度。從表5看出，在屬水平上，KDF7組與CHE組相比，巨單胞菌屬所占豐度百分比下降4%、擬桿菌屬上升30%、瘤胃球菌屬下降3%、糞桿菌屬下降1%，螺桿菌屬下降1%、另枝菌屬上升1%、Ruminococcaceae下降6%、理研菌屬上升1%、Barnesiella下降3%，其他屬下降14%；另外，在屬水平上還存在30%以上的菌未被關注，需進一步分析。

表4 門分類單元下相對豐度前4細菌的變化

表5 屬分類單元下相對豐度前10的變化

3 討 論

二甲酸鉀作為新型飼用酸化劑產品，在降低畜禽胃腸道疾病發(fā)生，改善腸道微生態(tài)環(huán)境方面發(fā)揮了重要作用[2]。本研究在肉雞基礎日糧中添加不同劑量的二甲酸鉀，研究其對白羽肉雞生長性能和腸道菌群的影響，并與金霉素產品進行比較。研究結果顯示，抗生素(CKB)及替抗產品(KDF)與空白組(CHE)相比，對白羽肉雞的料重比有著顯著(P<0.05)下降趨勢，這與以往同類產品對畜禽生長性能的影響相似[9]，說明二甲酸鉀能達到金霉素同等效果。同時，研究結果發(fā)現，在白羽肉雞的基礎日糧中添加0.3%二甲酸鉀效果最佳，但隨著濃度的升高效果逐漸降低，這可能是因為二甲酸鉀作為一種有機酸化劑，可以降低腸胃pH，隨著二甲酸鉀濃度增加，會使腸胃pH值過低從而失去平衡，不利于腸胃消化，如在黃羽肉雞飼糧中添加0.6%二甲酸鉀，對于肉雞的生長無顯著影響[10]。再者，對比將二甲酸鉀添加到其他家禽飼料的研究報道，發(fā)現不同動物飼喂二甲酸鉀的最佳濃度存在較大差異。Selle等[11]研究表明，在科寶肉雞飼糧中添加0.6%二甲酸鉀時能夠有效促進肉仔雞生長。Motoki等[12]研究表明，在日本肉雞飼糧中添加1%二甲酸鉀時能夠顯著提高體質量。出現這種情況，可能與二甲酸鉀的質量、不同動物品種的生理及采食需求存在差異有關，此外，雖然不同動物之間對于二甲酸鉀的耐受和最適添加濃度存在差異，但諸多研究[9-13]證實飼喂合理的二甲酸鉀濃度能夠促進畜禽生長，這與本研究在適宜濃度下飼喂白羽肉雞的結果一致，進一步證明二甲酸鉀應用于飼料的替抗?jié)摿鞍踩浴?/p>

腸道微生物是動物機體的重要組成部分，在動物的生理、免疫功能以及對營養(yǎng)物質的吸收上發(fā)揮著重要作用，有機酸能防止病原微生物在動物腸道內定植，減少發(fā)酵過程和有毒代謝物的產生，對腸道微生物菌群發(fā)揮有益作用[14]。通過第三代測序技術對0.3%二甲酸鉀組(KDF7)和金霉素組(CKB)與空白組(CHE)之間處理后的白羽肉雞腸道菌群進行16S rDNA全長序列進行高通量測序，獲得了一批高質量的數據，保證了下游腸道菌群結構分析的可靠性。通過alpha多樣性指數評估飼喂抗生素替代與抗生素后的白羽肉雞腸道菌群豐度與多樣性，發(fā)現飼喂二甲酸鉀與抗生素后，豐度沒有明顯變化，但均提高了腸道菌群物種多樣性，且二甲酸鉀作用效果優(yōu)于抗生素。同時，經NMDS和PCoA分析發(fā)現，各樣品組間明顯分開，且不同處理的生物學重復樣品各自聚在一起，進一步證實了飼喂二甲酸鉀與金霉素組方后，白羽肉雞腸道菌群結構產生了明顯不同的結構特征，說明二甲酸鉀和金霉素對畜禽腸道菌群結構具有一定的影響。

將0.3%二甲酸鉀飼喂白羽肉雞后，其腸道菌群在門分類水平，厚壁菌門、擬桿菌門、Epsilonbacteraeota的相對豐度占據前三；金霉素飼喂白羽肉雞后，其腸道菌群在門分類水平，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門的相對豐度占據前三。以往研究發(fā)現飼喂抗生素制劑能顯著降低變形菌門和Epsilonbacteraeota的相對豐度，顯著提升擬桿菌門的相對豐度[15]，這與本研究飼喂抗生素制劑的變化一致。然而，飼喂二甲酸鉀后，擬桿菌門相對豐度顯著上升，厚壁菌門、變形菌門和Epsilonbacteraeota相對豐度顯著下降，這與其他替代抗生素產品飼喂家禽后趨勢相同[16]。值得注意的是，厚壁菌門比擬桿菌門會更有效地吸收食物中的熱量，從而導致肥胖[17]，因此厚壁菌門相對豐度降低，擬桿菌門相對豐度增加，有助于改善白羽肉雞代謝、減少脂肪沉積；此外，以往研究發(fā)現炎癥性腸病和腹瀉等疾病中，往往伴隨著變形菌門和Epsilonbacteraeota相對豐度上升，擬桿菌門相對豐度降低[4]，可見飼喂0.3%的二甲酸鉀和金霉素，可以減少大腸埃希菌和沙門氏菌等病原菌在腸道定植，提高免疫力，減少白羽肉雞發(fā)病的可能。總體而言，適宜的二甲酸鉀濃度和金霉素制劑可以抑制病原菌繁殖，改善動物的腸道健康狀況，產生更有利的微生物菌群[18]，同時也降低了致病菌的排瀉量，凈化了動物的生長環(huán)境。

在屬分類水平，飼喂0.3%二甲酸鉀與金霉素和空白對照(CHE)相比，均提高了擬桿菌屬相對豐度，其中二甲酸鉀組與空白對照相比存在顯著差異(P<0.05)，同時降低了Barnesiella和螺桿菌屬的相對豐度。以往研究發(fā)現飼糧中添加替代抗生素產品可以提高肉雞擬桿菌屬的相對豐度[19]，這與本研究飼喂二甲酸鉀的變化一致，而且研究表明患有腹瀉的畜禽腸道中擬桿菌屬相對豐度顯著減少[20]，因此擬桿菌屬的相對豐度上升可以增強白羽肉雞機體抵抗力，減少腹瀉等腸道疾病。此外，以往研究發(fā)現飼糧中添加益生菌可以顯著降低肉雞螺桿菌屬和Barnesiella的相對豐度，螺桿菌屬定植腸道會引起的肝炎與腸炎等疾病的發(fā)生，同時Barnesiella寄生于禽類中，也可成為急、慢性病的病原[12]，這類菌的相對豐度的降低，可以增強白羽肉雞機體免疫力，減少肉雞肝炎與腸炎等疾病的發(fā)生。這些證據都表明，適宜濃度的二甲酸鉀作為無抗飼料添加劑飼喂白羽肉雞后，可以改善白羽肉雞的腸道微生態(tài)平衡，對于白羽肉雞腸道健康具有促進作用。

本研究首次利用昆明三正生物科技(集團)有限公司開發(fā)的金霉素和替抗產品(二甲酸鉀)飼喂白羽肉雞，比較其生長性能和腸道菌群的變化。結果證實，二甲酸鉀對于白羽肉雞生長性能和腸道菌群結構的影響與金霉素相似，二甲酸鉀的添加降低了白羽肉雞的料重比，促進肉雞快速生長發(fā)育，同時改善了腸道中微生物菌群的健康情況，表現為益生菌的豐度增加和有害菌豐度的減少。因此，二甲酸鉀可以作為抗生素的替代品，具有很好的應用前景。