范 明，彭麗桃，閆 等，范 剛，楊書(shū)珍，李 杰

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070）

由指狀青霉（Penicillium digitatum）侵染導(dǎo)致的柑橘綠霉病是引起采后柑橘腐敗變質(zhì)的重要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有90%的腐爛柑橘果實(shí)是由于被指狀青霉侵染所致，經(jīng)濟(jì)損失巨大[1]。目前，化學(xué)殺菌劑處理仍是控制柑橘采后貯運(yùn)病害的重要手段，但化學(xué)殺菌劑的長(zhǎng)期大量使用使得病原真菌的抗藥性日益增強(qiáng)，殺菌劑的使用周期顯著縮短[2-4]。因此，研究與開(kāi)發(fā)具有新型藥物作用靶點(diǎn)的殺菌劑對(duì)柑橘采后安全生產(chǎn)具有十分重要的意義。

酸堿平衡是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、保證細(xì)胞正常代謝與功能的前提[5]。為了適應(yīng)更多極端的生長(zhǎng)和侵染環(huán)境，真菌細(xì)胞較其他真核生物具有更強(qiáng)大的pH值調(diào)控和H+轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[6]。其中V型ATP酶質(zhì)子泵（vacuolar H+-ATPase，V-ATPase）和P型質(zhì)子泵（plasma membrane H+-ATPase，P-ATPase）在保持細(xì)胞內(nèi)的pH值動(dòng)態(tài)平衡和建立細(xì)胞膜內(nèi)外的質(zhì)子梯度中起著關(guān)鍵作用[7-9]。在球孢白僵菌的研究中發(fā)現(xiàn)V-ATPase功能的缺失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH值和鈣離子的失衡，從而影響了真菌細(xì)胞骨架的維持[6]。對(duì)白色念珠菌的研究表明[10]，編碼V-ATPase亞基的基因缺失會(huì)導(dǎo)致菌株毒力降低。Billack等[11]研究也發(fā)現(xiàn)P-ATPase在白色念珠菌致病力上具有重要作用。因此，V-ATPase和P-ATPase在真菌細(xì)胞生命活動(dòng)和對(duì)寄主的侵染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

VmaH（vacuolar ATP synthase subunit H）基因所編碼的蛋白是V-ATPase的一個(gè)關(guān)鍵亞基，它不但調(diào)控復(fù)合體V1和V0的組裝，而且還通過(guò)調(diào)控ATP（水解ATP）活性而調(diào)控H+跨膜運(yùn)輸[12]。Rizzo等[13]研究表明VmaH基因表達(dá)水平的差異會(huì)影響V-ATPase的組裝。VmaH基因的缺失會(huì)導(dǎo)致害蟲(chóng)的死亡和真菌侵染毒力的下降[14-15]。PMA1（plasma membrane ATPase 1）是編碼P-ATPase的主要基因，位于細(xì)胞質(zhì)膜上，主要是產(chǎn)生電化學(xué)梯度，把細(xì)胞內(nèi)的H+泵出膜外，驅(qū)動(dòng)一定數(shù)量的次級(jí)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，促進(jìn)離子和代謝物的吸收；同時(shí)P-ATPase有助于保持細(xì)胞內(nèi)pH值的調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞內(nèi)pH值的相對(duì)穩(wěn)定，從而保證各種生命活動(dòng)的正常運(yùn)行[16]。Morsomme等[17]研究表明，PMA缺陷型真菌突變體的許多生理活動(dòng)不能正常進(jìn)行，生長(zhǎng)幾乎停止。但目前有關(guān)VmaH和PMA的研究主要集中在植物[18-19]、酵母菌[6,14]和其他少量真菌上，對(duì)于植物病原真菌尤其是柑橘綠霉病菌中VmaH和PMA基因的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究在利用生物信息學(xué)分析VmaH和PMA基因的基礎(chǔ)上，采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術(shù)分析VmaH和PMA在柑橘綠霉病菌中的表達(dá)規(guī)律，進(jìn)一步探討VmaH和PMA作為抑制柑橘綠霉病的藥物作用靶點(diǎn)的可行性，以期為研發(fā)適合柑橘采后病害控制的新型、安全、高效的柑橘采后殺菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

指狀青霉菌株（菌株編號(hào)：DSM62840），購(gòu)自德國(guó)微生物菌種保藏中心。

馬鈴薯蔗糖瓊脂（potato saccharose agar，PSA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，加入1 L蒸餾水，煮沸后取濾液加入蔗糖10 g，瓊脂20 g。馬鈴薯蔗糖肉湯（potato saccharose broth，PSB）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，加入1 L蒸餾水，煮沸后取濾液加入蔗糖10 g。

柱式真菌總RNA抽提純化試劑盒、柱式植物總RNA抽提純化試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；松屬素、香芹酚、辛烯醛阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

qTOWER2.2實(shí)時(shí)定量PCR儀 德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司；Gel Doc XR+凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；SPX-150BIII生化培養(yǎng)箱 北京鑫潤(rùn)科諾儀器儀表有限公司；SHZ-82A氣浴恒溫振蕩箱 金壇市宏華儀器廠；YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1VmaH和PMA基因生物信息學(xué)分析

在NCBI網(wǎng)站上下載指狀青霉VmaH（GenBank：AKCT01000068.1）和PMA（GenBank：JH993691.1）氨基酸和蛋白序列。利用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。利用Pfam在線預(yù)測(cè)軟件（http://pfam.janelia.org/search）對(duì)指狀青霉VmaH和PMA結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)多序列比對(duì)采用DNAMAN 8.0程序。系統(tǒng)進(jìn)化分析利用MEGA程序（版本號(hào)5.02）中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

參照NCBI上已發(fā)布的指狀青霉VmaH和PMA基因的mRNA保守區(qū)序列設(shè)計(jì)real-time PCR引物，所涉及引物均由天一輝遠(yuǎn)有限公司合成（表1）。

表 1 PCR擴(kuò)增所用引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR amplification

1.3.3VmaH和PMA基因表達(dá)規(guī)律分析

1.3.3.1 菌齡對(duì)指狀青霉生長(zhǎng)過(guò)程中VmaH和PMA基因表達(dá)的影響

取在PSA培養(yǎng)基上26 ℃培養(yǎng)3 d的指狀青霉孢子，制成1×106CFU/mL孢子菌懸液，取200 μL涂布于含玻璃紙的PSA培養(yǎng)基上，于26 ℃培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)2、3、4、5、6、7、8 d和14 d的菌絲，液氮速凍后-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 指狀青霉侵染臍橙過(guò)程中VmaH和PMA的基因表達(dá)

新鮮臍橙在0.2%（體積分?jǐn)?shù)）次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，用蒸餾水沖洗2 次并晾干。使用接種針在果實(shí)腰部造傷，深度約3 mm。將長(zhǎng)勢(shì)一致的指狀青霉菌絲餅反貼至果實(shí)傷口處。將果實(shí)放置于26 ℃環(huán)境下，分別于第5、6、7、8、9、15天收集病健部組織，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.3 酸堿處理對(duì)指狀青霉菌絲抑制率和VmaH、PMA基因表達(dá)的影響

取在PSA培養(yǎng)基上26 ℃培養(yǎng)3 d的指狀青霉孢子，制成1×106CFU/mL孢子菌懸液，取200 μL于PSB培養(yǎng)基中，于 26 ℃恒溫?fù)u床中120 r/min培養(yǎng)2 d，紗布過(guò)濾，無(wú)菌水沖洗3 次。稱取1.60 g濕菌絲，移至pH值分別為2、4、6、8、10、12的PSB培養(yǎng)基中脅迫24 h。用1 mol/L NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)PSB培養(yǎng)基pH值至2、4、6、8、10、12，以pH 6 PSB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲作空白對(duì)照。處理過(guò)程結(jié)束后，用于RNA提取的樣品收集菌絲液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于測(cè)定菌絲抑制率的樣品冷凍干燥48 h后稱量干質(zhì)量，并按下式計(jì)算各處理組的菌絲抑制率：

1.3.3.4 葡萄糖饑餓和回補(bǔ)對(duì)指狀青霉VmaH和PMA基因表達(dá)的影響

取在PSA培養(yǎng)基上26 ℃培養(yǎng)3 d的指狀青霉孢子，制成1×106CFU/mL孢子菌懸液，取200 μL于PSB培養(yǎng)基中，于26 ℃恒溫?fù)u床中120 r/min培養(yǎng)2 d，紗布過(guò)濾，無(wú)菌水沖洗3 次。取8.00 g濕菌絲于500 mL錐形瓶中，加入300 mL 50 mmol/L KCl溶液，4 ℃饑餓24 h，收集菌絲液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ○囸I24 h的菌體過(guò)濾，無(wú)菌水沖洗3 次，取1.00 g濕菌絲重懸于20 mL 10 g/100 mL葡萄糖溶液中，處理10、20、30、40、50 min及60 min。處理過(guò)程結(jié)束后，收集菌絲液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.5 不同殺菌物質(zhì)和氧化還原劑對(duì)指狀青霉菌絲抑制率和VmaH、PMA基因表達(dá)的影響

取在PSA培養(yǎng)基上26 ℃培養(yǎng)3 d的指狀青霉孢子，制成1×106CFU/mL孢子菌懸液，取200 μL于PSB培養(yǎng)基中，于26 ℃恒溫?fù)u床中120 r/min培養(yǎng)2 d，紗布過(guò)濾，無(wú)菌水沖洗3 次。稱取1.60 g濕菌絲，分別加入50 mL PSB培養(yǎng)基、50 mL含200 μL乙醇的PSB培養(yǎng)基、50 mL含37.5 μL乙醇的PSB培養(yǎng)基、50 mL含20 μL DMSO的PSB培養(yǎng)基和50 mL含不同濃度松屬素、聯(lián)苯芐唑、香芹酚、辛烯醛、H2O2、Na2SO3的PSB培養(yǎng)基中脅迫處理24 h，處理過(guò)程結(jié)束后，用于RNA提取的樣品液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于測(cè)定菌絲抑制率的樣品冷凍干燥48 h后稱量干質(zhì)量，計(jì)算各處理組的菌絲抑制率。其中50 mL PSB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲作為空白對(duì)照（CK1），50 mL含200 μL乙醇、37.5 μL乙醇、20 μL DMSO的PSB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲作為溶劑對(duì)照組（CK2）。松屬素、香芹酚、辛烯醛用乙醇分別配成20%松屬素、105μL/L香芹酚、辛烯醛的母液，聯(lián)苯芐唑用DMSO配成0.032 g/mL母液。

以指狀青霉肌動(dòng)蛋白基因（β-actin）作為內(nèi)參基因，檢測(cè)在不同條件下VmaH和PMA在轉(zhuǎn)錄水平上的相對(duì)表達(dá)量。

提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后通過(guò)real-time PCR檢測(cè)VmaH和PMA的表達(dá)水平。real-time PCR體系為：SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，不同樣本的cDNA 1 μL，10 μmoL/L上下游引物（β-actin引物：actin-F/R；VmaH引物：Q-VmaH-F/R，PMA引物：Q-PMA-F/R，序列見(jiàn)表1）1 μL，雙蒸水補(bǔ)足體積至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)收集熒光信號(hào)。每個(gè)樣品3 次重復(fù)，采用2-??Ct公式進(jìn)行計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2007軟件進(jìn)行平均值、標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算和圖形繪制，所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)所得，采用SPSS 22軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用最小顯著差數(shù)法檢驗(yàn)差異顯著性（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 VmaH和PMA結(jié)構(gòu)域、同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖 1 指狀青霉與其他物種VmaH的多序列比對(duì)Fig. 1 Multiple sequence alignment of VmaH from P. digitatum and other species

通過(guò)Pfam在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)指狀青霉VmaH和PMA的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)VmaH具有2 個(gè)非常保守的結(jié)構(gòu)域，分別為N端的結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域，N端的結(jié)構(gòu)域位于第7～356個(gè)氨基酸之間，C端結(jié)構(gòu)域位于第357～475個(gè)氨基酸之間；PMA具有3 個(gè)非常保守的結(jié)構(gòu)域，分別為位于N端的結(jié)構(gòu)域、E1-E2 ATPase結(jié)構(gòu)域和水解酶結(jié)構(gòu)域，N端的結(jié)構(gòu)域位于第84～141個(gè)氨基酸之間，E1-E2 ATPase結(jié)構(gòu)域位于第182～406個(gè)氨基酸之間，水解酶結(jié)構(gòu)域位于第422～689個(gè)氨基酸之間。有研究表明，酵母中VmaH的N末端域是激活A(yù)TP水解所必需的，而C末端域是適當(dāng)?shù)哪芰狂詈纤匦璧腫20]。PMA中N末端在膜內(nèi)側(cè)構(gòu)成H+入口，水解酶結(jié)構(gòu)域控制ATP的水解，E1-E2 ATPase結(jié)構(gòu)域通過(guò)構(gòu)象循環(huán)變化實(shí)現(xiàn)離子運(yùn)輸，E1對(duì)輸出的離子有很高親和力，E2對(duì)輸入的離子有很高親和力[21]。

圖 2 指狀青霉與其他物種PMA的多序列比對(duì)Fig. 2 Multiple sequence alignment of PMA from P. digitatum and other species

將氨基酸序列進(jìn)行BLASTp比對(duì)分析，用DNAMAN 8.0軟件對(duì)指狀青霉VmaH和PMA與其他物種的VmaH和PMA進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果如圖1、2所示，對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，指狀青霉VmaH與擴(kuò)展青霉、曲霉、大觀貝氏菌、酵母菌的VmaH同源性較高，其相似度達(dá)到79%以上，指狀青霉PMA（JH993691.1）與擴(kuò)展青霉、曲霉、黃萎病菌等真菌PMA1的相似度達(dá)到80%以上，表明VmaH和PMA在真菌物種中較為保守。

用MEGA 5.0軟件采用鄰位相接法（Neighbor Joining）構(gòu)建指狀青霉VmaH和PMA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3、4）。結(jié)果表明，指狀青霉VmaH與青霉屬、大觀貝氏菌序列具有最高的同源性，與曲霉屬的VmaH蛋白高度同源；指狀青霉PMA與日本曲霉、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）序列具有最高的同源性，與青霉屬、木霉屬、小麥酵母等的PMA蛋白高度同源。表明VmaH和PMA基因的氨基酸序列在真菌中具有較高的保守性，親緣關(guān)系較近。

圖 3 指狀青霉與其他物種VmaH的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of VmaH from P. digitatum and other species

圖 4 指狀青霉與其他物種PMA的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree of PMA from P. digitatum and other species

2.2 指狀青霉生長(zhǎng)和侵染過(guò)程中VmaH和PMA基因表達(dá)

如圖5所示，與PMA相比，VmaH相對(duì)表達(dá)量在指狀青霉菌絲生長(zhǎng)和侵染臍橙果實(shí)的整個(gè)過(guò)程中變化較為平緩，僅在生長(zhǎng)和侵染后期表達(dá)量有一定程度的升高。而PMA在菌絲生長(zhǎng)和侵染臍橙前期穩(wěn)定表達(dá)，中期開(kāi)始表達(dá)量顯著下調(diào)。推測(cè)在指狀青霉生長(zhǎng)和侵染臍橙前期，VmaH和PMA共同維持指狀青霉生長(zhǎng)所需的胞內(nèi)外pH值，而在中后期主要是由VmaH維持指狀青霉生長(zhǎng)所需的酸性平衡。

圖 5 VmaH和PMA在指狀青霉生長(zhǎng)（A）和侵染（B）過(guò)程中定量表達(dá)分析Fig. 5 Quantitative expression analysis of VmaH and PMA during the growth (A) and infection (B) of P. digitatum

2.3 不同酸堿處理對(duì)指狀青霉菌絲生長(zhǎng)和VmaH、PMA表達(dá)的影響

圖 6 VmaH和PMA在不同pH值下定量表達(dá)和抑菌率分析Fig. 6 Quantitative expression and antibacterial rate analysis of VmaH and PMA under different pH conditions

如圖6所示，弱酸和弱堿條件下PMA在調(diào)節(jié)胞內(nèi)外pH值上發(fā)揮著主要作用；而在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下VmaH和PMA的功能均受到抑制，尤其在極堿條件下VmaH和PMA調(diào)控胞內(nèi)外pH值的能力減弱，菌絲無(wú)法正常生長(zhǎng)。

2.4 葡萄糖饑餓以及回補(bǔ)條件對(duì)指狀青霉VmaH和PMA表達(dá)的影響

如圖7所示，葡萄糖饑餓會(huì)使VmaH和PMA基因的表達(dá)量顯著下調(diào)，葡萄糖回補(bǔ)可以恢復(fù)VmaH和PMA基因的表達(dá)，且VmaH在回補(bǔ)狀態(tài)下基因表達(dá)量顯著高于PMA基因的表達(dá)量。

圖 7 VmaH和PMA在葡萄糖饑餓和回補(bǔ)中定量表達(dá)分析Fig. 7 Quantitative expression analysis of VSH and PMA under glucose starvation and supplementation

2.5 氧化還原劑對(duì)指狀青霉菌絲抑制率和VmaH、PMA表達(dá)的影響

圖 8 VmaH和PMA在H2O2和Na2SO3脅迫下定量表達(dá)和抑菌率分析Fig. 8 Quantitative expression and antibacterial rate analysis of VmaH and PMA under the stress of H2O2 and Na2SO3

如圖8所示，H2O2和Na2SO3處理顯著降低了指狀青霉VmaH和PMA的表達(dá)量，且與VmaH相比，PMA對(duì)H2O2和Na2SO3處理更敏感?？梢钥闯觯S著VmaH和PMA的表達(dá)的顯著下調(diào)，菌絲體的生長(zhǎng)受到明顯抑制。

2.6 殺菌劑處理對(duì)指狀青霉菌絲抑制率和VmaH、PMA基因表達(dá)的影響

如圖9所示，經(jīng)黃酮類化合物松屬素處理后，指狀青霉菌絲生長(zhǎng)均被顯著抑制，PMA表達(dá)量在各個(gè)用量下均顯著下調(diào)，而VmaH在高濃度時(shí)才會(huì)顯著下調(diào)。經(jīng)細(xì)胞膜抑制劑聯(lián)苯芐唑處理后，指狀青霉菌絲生長(zhǎng)量和PMA表達(dá)量均被顯著抑制，且抑制程度隨其質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，而對(duì)VmaH的表達(dá)量影響不顯著。經(jīng)植物香精油香芹酚和辛烯醛處理后，VmaH和PMA相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)，且下調(diào)程度隨其用量增加而增強(qiáng)。VmaH經(jīng)低用量辛烯醛處理后相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了48%，而經(jīng)低用量香芹酚處理后相對(duì)表達(dá)量?jī)H下調(diào)了13%，表明相較于香芹酚，VmaH對(duì)辛烯醛響應(yīng)更敏感。在高用量辛烯醛和香芹酚處理下，VmaH相對(duì)表達(dá)量分別下調(diào)了53%、49%，PMA相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)了98%，表明相比于VmaH，PMA對(duì)香芹酚和辛烯醛處理更為敏感。

圖 9 VmaH和PMA在不同類型殺菌劑脅迫下定量表達(dá)和抑菌率分析Fig. 9 Quantitative expression and antibacterial rate analysis of VSH and PMA under the stress of different types of fungicides

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)指狀青霉中的VmaH具有2 個(gè)非常保守的結(jié)構(gòu)域，分別為N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域，與酵母VmaH[20]有相同的結(jié)構(gòu)域；PMA具有3 個(gè)非常保守的結(jié)構(gòu)域，分別為位于N端的結(jié)構(gòu)域、E1-E2 ATPase結(jié)構(gòu)域和水解酶結(jié)構(gòu)域，與大多數(shù)真菌[21]PMA結(jié)構(gòu)域相同。表明指狀青霉中的VmaH和PMA與其他真菌中的VmaH和PMA發(fā)揮著同樣的功能。同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)指狀青霉中的VmaH和PMA基因所編碼的蛋白和青霉屬、曲霉屬、酵母等其他種屬具有相同結(jié)構(gòu)域和高度同源性，而與其他植物細(xì)胞和哺乳類動(dòng)物細(xì)胞同源性較低，尤其是PMA編碼的蛋白是真菌特有蛋白，與哺乳動(dòng)物無(wú)同源性，表明VmaH和PMA適合作為藥物作用靶點(diǎn)。因此，從生物信息學(xué)方面，VmaH和PMA所編碼的蛋白可以作為真菌特異性藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)一步對(duì)其功能特性進(jìn)行深入研究。

研究發(fā)現(xiàn)，VmaH功能缺失后會(huì)導(dǎo)致球孢白僵菌侵染毒力下降[6]、釀酒酵母生長(zhǎng)狀態(tài)受到影響[14]、東方粘蟲(chóng)中毒或死亡[12]、東亞飛蝗個(gè)體出現(xiàn)死亡和顯著的蛻皮缺陷表型[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[6]，VmaH主要通過(guò)影響液泡pH值，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外pH值環(huán)境，以致改變其侵染能力。此外，Petrov[22]的研究同樣發(fā)現(xiàn)PMA缺失和PMA定點(diǎn)突變的釀酒酵母突變體泵H+和ATP水解功能均受到抑制，從而導(dǎo)致釀酒酵母生長(zhǎng)狀態(tài)受到影響。本研究也發(fā)現(xiàn)VmaH和PMA在指狀青霉菌絲生長(zhǎng)和侵染橙子前期均維持較高表達(dá)水平；而在中后期僅VmaH維持較高表達(dá)水平，PMA顯著下調(diào)。表明VmaH和PMA在指狀青霉生長(zhǎng)和侵染寄主的前期發(fā)揮著重要作用，尤其VmaH在指狀青霉生長(zhǎng)和侵染后期發(fā)揮著重要作用。酸堿平衡與真菌的生長(zhǎng)和侵染能力密切相關(guān)，VmaH和PMA在調(diào)控真菌細(xì)胞內(nèi)外pH值平衡上具有重要作用。因此，從指狀青霉生長(zhǎng)和侵染方面，VmaH和PMA可作為指狀青霉藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)一步研究。

在外界環(huán)境脅迫下，不同基因編碼的蛋白在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過(guò)程中發(fā)揮著不同作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究在酸堿、葡萄糖以及各種殺菌物質(zhì)的環(huán)境脅迫下VmaH和PMA在指狀青霉中的表達(dá)情況，分析VmaH和PMA作為指狀青霉酸代謝、碳代謝、氧化還原等方面藥物靶點(diǎn)的可能性。胞外pH值和葡萄糖會(huì)影響V-ATPase和P-ATPase的活性[23]，進(jìn)而影響真菌酸堿平衡。研究表明，酵母菌P-ATPase的表達(dá)對(duì)酸脅迫敏感，在pH值為2.5時(shí)，PMA1的mRNA水平和酶活性顯著下降[24]，而弱酸條件可增加真菌P-ATPase的活性[25]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在弱酸弱堿環(huán)境中，指狀青霉生長(zhǎng)所需的胞內(nèi)外pH值主要是由PMA發(fā)揮作用，而在極酸極堿條件下VmaH和PMA的活性均受到損傷，從而導(dǎo)致指狀青霉無(wú)法正常生長(zhǎng)，表明其在指狀青霉的酸堿平衡中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Kane[26]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能介導(dǎo)V-ATPase的拆卸和重新組裝，進(jìn)而影響V-ATPase的活性。在含葡萄糖的培養(yǎng)基中，V-ATPase有55%～70%的V0區(qū)段與V1組裝在一起，但在葡萄糖饑餓后，只有15%～20%的V0區(qū)段與V1結(jié)合，經(jīng)葡萄糖回補(bǔ)后，組裝水平再次為55%～70%。另有研究表明，在葡萄糖饑餓條件下可能導(dǎo)致PMA1和其他ATP驅(qū)動(dòng)的過(guò)程直接失活[27]，而向酵母細(xì)胞中添加葡萄糖可激活P-ATPase介導(dǎo)的質(zhì)子外排[28]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，葡萄糖饑餓顯著降低了VmaH和PMA基因表達(dá)水平，葡萄糖回補(bǔ)可以恢復(fù)兩個(gè)基因的表達(dá)水平，尤其是VmaH相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，表明VmaH和PMA在指狀青霉糖代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。因此，VmaH和PMA可作為酸代謝、碳代謝方面可能性藥物靶點(diǎn)進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在氧化還原劑以及各種殺菌物質(zhì)脅迫條件下，PMA在各種藥物脅迫下均受到抑制，而VmaH僅在部分藥物脅迫下才會(huì)受到抑制，表明VmaH和PMA是響應(yīng)不同種類藥物的重要作用靶點(diǎn)，可以影響氧化還原等方面，對(duì)生命活動(dòng)至關(guān)重要，是重要的藥物作用靶點(diǎn)，值得深入探討。丁俐文等[29]研究也發(fā)現(xiàn)V-ATPase可作為粘蟲(chóng)的藥物作用靶點(diǎn)，通過(guò)苦皮藤素V產(chǎn)生殺蟲(chóng)效果。過(guò)表達(dá)Put VHA-c的轉(zhuǎn)基因酵母具有更高的耐鹽性，表明V-ATPase在逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[30]。在銅脅迫下釀酒酵母的質(zhì)膜組織受到破壞從而使P-ATPase的活性降低[31]。Billack等[11]的研究同樣發(fā)現(xiàn)PMA可作為白色念珠菌的藥物作用靶點(diǎn)，通過(guò)抑制劑如依布硒對(duì)真菌生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制作用。因此，從VmaH和PMA對(duì)不同藥物的響應(yīng)方面，VmaH和PMA有作為指狀青霉藥物作用靶點(diǎn)的可能性。

綜上所述，VmaH和PMA所編碼的蛋白真菌特異性強(qiáng)，參與了指狀青霉生長(zhǎng)和侵染寄主的過(guò)程，在指狀青霉的酸代謝、糖代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，對(duì)于不同的脅迫環(huán)境響應(yīng)差異顯著，其中PMA對(duì)外界環(huán)境脅迫反應(yīng)更為明顯，VmaH在脅迫條件下對(duì)細(xì)胞pH值平衡發(fā)揮的作用更顯著。因此，VmaH和PMA作為潛在的抗指狀青霉藥物靶點(diǎn)，值得進(jìn)行深入研究和探討。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)為接下來(lái)通過(guò)基因過(guò)表達(dá)、沉默、敲除等手段進(jìn)一步研究VmaH和PMA作為指狀青霉藥物靶點(diǎn)的可能性提供了理論支持。