劉忠博，耿 升，蔣兆景，楊 偉，劉本國

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

Pickering乳液是以固體顆粒替代傳統(tǒng)乳液中表面活性物質(zhì)，利用顆粒在油滴表面的吸附實現(xiàn)體系穩(wěn)定的一種乳液[1]。與由傳統(tǒng)的表面活性劑穩(wěn)定的乳液相比，它不僅有經(jīng)典乳液的基本性質(zhì)，還具有較好的穩(wěn)定性，更高的安全性和更廣的應(yīng)用范圍，因而受到越來越多的關(guān)注。近幾十年來，以無機粒子或有機高分子為顆粒乳化劑制備Pickering乳液的研究較多，但這些顆粒存在著生物相容性低、可降解性差等缺點，使其在食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用受到一定限制，因而食品級天然固體顆粒乳化劑逐漸成為研究熱點[2-3]。目前，相關(guān)的研究主要集中于纖維素[4]、淀粉[5]、蛋白質(zhì)[6]等。環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）是環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用于直鏈淀粉產(chǎn)生的一系列具有錐形中空環(huán)狀結(jié)構(gòu)的低聚糖（如α-CD、β-CD和γ-CD）[7-8]。CD具有內(nèi)腔疏水而外壁親水的獨特結(jié)構(gòu)，使得其可通過范德華力、氫鍵及疏水作用包合疏水性分子形成主客體型超分子復(fù)合物[9-10]。有報道指出CD可用于Pickering乳液構(gòu)建。Choi等[11]構(gòu)建了β-CD穩(wěn)定的魚油基O/W型Pickering乳液，發(fā)現(xiàn)油/水界面處形成的β-CD/魚油超分子包合物對乳液穩(wěn)定有重要作用。Shimada等[12]比較了α-、β-和γ-CD乳化大豆油的能力，發(fā)現(xiàn)β-CD表現(xiàn)突出，其在添加量為0.25%時就能穩(wěn)定乳液。Inoue等[13]考察了油相中烷烴鏈長對CD乳化能力的影響，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定效果如下：十六烷＞十二烷＞辛烷。當(dāng)前食品級天然固體顆粒乳化劑研究仍集中在蛋白、多糖等天然生物大分子上，對基于CD的Pickering乳液研究仍然較少，且現(xiàn)有研究大多集中在特定CD乳液的結(jié)構(gòu)表征上，而未系統(tǒng)考察CD結(jié)構(gòu)對乳液性質(zhì)的影響，相關(guān)研究也缺乏理論計算支持，有鑒于此，本研究擬以各型CD為乳化劑，構(gòu)建食品級Pickering乳液體系，考察CD結(jié)構(gòu)，CD質(zhì)量濃度、油相類型、油水比等因素對O/W型Pickering乳液形成的影響，并重點比較α-、β-及γ-CD穩(wěn)定的中鏈脂肪酸甘油三酯（medium-chain triglyceride，MCT）基Pickering乳液的微觀結(jié)構(gòu)、微流變性質(zhì)及穩(wěn)定性，結(jié)合分子對接方法，模擬CD/MCT包合物的形成，以期揭示造成三者乳化能力差異的原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-CD、β-CD、γ-CD、甲基-β-CD（M-β-CD）、2,6-二-O-甲基-β-CD（diM-β-CD）、(2-羥丙基)-β-CD（HP-β-CD）、MCT 上海源葉生物科技有限公司；尼羅藍(lán)、尼羅紅 美國Sigma-Aldrich公司；玉米油山東魯花集團(tuán)；葵花籽油、菜籽油、花生油、大豆油益海嘉里集團(tuán)；乙醇、丙二醇等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultra-Turrax T18高速剪切機 德國IKA公司；DCAT 21表面/界面張力儀 德國DataPhysics公司； Rheolaser LAB 6光學(xué)微流變儀 法國Formulaction公司；BH200P偏光顯微鏡 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；LSM780激光共聚焦顯微鏡 德國Carl Zeiss公司；ME104E/02型電子天平、PL1001-L型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 油相類型對Pickering乳液的影響考察

將200 mg CD（α-、β-、γ-，M-β-、diM-β-、HP-β-CD），加入8 mL去離子水中，所得溶液在室溫15 000 r/min高速剪切下，分別與2 mL食用油（大豆油、花生油、玉米油、葵花油、MCT）混合，剪切3 min，制備Pickering乳液，靜置1 d后進(jìn)行觀察。

1.3.2 油水比對Pickering乳液的影響考察

將200 mg CD（α-、β-、γ-CD）分別加入9、8、7、6、5 mL去離子水中，所得溶液在室溫15 000 r/min高速剪切下，分別與1、2、3、4、5 mL MCT混合，剪切3 min，制備Pickering乳液，靜置1 d后進(jìn)行觀察。

1.3.3 CD質(zhì)量濃度對Pickering乳液的影響考察

將50、100、150、200、250 mg CD（α-、β-、γ-CD），加入5 mL去離子水中，所得溶液在室溫15 000 r/min高速剪切下，分別與5 mL MCT混合，剪切3 min，制備Pickering乳液，靜置1 d和30 d后進(jìn)行觀察。

1.3.4 界面張力測定

使用吊片法測定α-、β-、γ-CD溶液在MCT中的界面張力[14]。鉑金片用去離子水清洗后，用酒精燈灼燒至微紅，冷卻后放入界面張力儀待用。根據(jù)測定程序，將20 mL的MCT倒入儀器升降臺中測定，再將30 mg/mL的CD溶液20 mL倒入升降臺測定，最后將20 mL的MCT添加到20 mL 30 mg/mL的CD溶液中進(jìn)行油水界面張力的測量，空白為去離子水，測定溫度為25 ℃。

1.3.5 乳液貯藏穩(wěn)定性測定

參照Shao Ping等[15]的方法考察乳液貯藏穩(wěn)定性。乳液剪切后立即將其轉(zhuǎn)入20 mL玻璃瓶中。瓶子用塑料蓋密封防止水分揮發(fā)。將乳液樣品在25 ℃靜置儲存。穩(wěn)定性以乳化指數(shù)（emulsifying index，ES）和乳液穩(wěn)定指數(shù)（stability index，SI）表示：

式中：He為觀察到的乳化層體積（即非澄清部分）；Ht為體系總體積，即油相、添加顆粒和連續(xù)相的總和。ES1d和ES30d分別為第1、30天的乳液的ES值。

1.3.6 乳液形貌觀察

吸取Pickering乳液20 μL至載玻片上，壓片后，用配有數(shù)碼相機的光學(xué)顯微鏡觀察乳液的形貌，并運用ImageJ軟件測定乳液的粒徑分布[16]。

1.3.7 激光共聚焦顯微觀察

參照Yusoff等[17]的方法，使用尼羅藍(lán)（0.1%）和尼羅紅（0.01%）溶液分別對CD和MCT染色24 h，再混合剪切制備Pickering乳液，吸取Pickering乳液20 μL至載玻片上，使用激光共聚焦顯微鏡200 倍下觀察，在488 nm和633 nm波長下分別激發(fā)尼羅紅和尼羅藍(lán)染料，以1 024×1 024像素的分辨率拍攝，并使用圖像分析軟件ZEN 3.0進(jìn)行處理。

1.3.8 乳液微流變測定

使用Rheolaser Master光學(xué)微流變儀對CD（α-、β-CD）質(zhì)量濃度為5、15、25 mg/mL的乳液進(jìn)行微流變分析。將靜置24 h的乳液樣品20 mL裝入到25 mL測試瓶中，置于Rheolaser腔室中，在25 ℃通過CCD探測器監(jiān)測6 h，由Rheosoft Master 1.4.0.0軟件同步測定并記錄乳液的彈性指數(shù)（elasticity index，EI）和宏觀黏度指數(shù)（macroscopic viscosity index，MVI）[18]。

1.3.9 分子對接方法

在Hyperchem 8.0軟件中構(gòu)造MCT分子，MCT的3 條脂肪鏈分別為辛酸、癸酸和辛酸，先用分子力學(xué)MM+法和半經(jīng)驗的量子化學(xué)AM1法對MCT結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)優(yōu)化，然后運用Guassian 09軟件的B3LYP/6-31G(d)法進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化[19]。α-、β-、γ-CD的結(jié)構(gòu)分別來自PDB數(shù)據(jù)庫的3L2M、4YEF和1D3C文件。CD和MCT的分子對接采用AUTODOCK4.2軟件進(jìn)行[20-21]，設(shè)定autogrid box參數(shù)為60 ?×60 ?×60 ?，grid spacing為0.375 ?，計算方法為Lamarckian genetic algorithm，其他參數(shù)默認(rèn)設(shè)置，對接20 次[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 油相類型對乳液的影響

油相可影響Pickering乳液的類型，非極性油相使顆粒更親水，易傾向于形成O/W型Pickering乳液；極性油相使顆粒更親油，易形成W/O型Pickering乳液[23]。本研究考察了以大豆油、花生油、玉米油、葵花油、MCT為油相時，CD乳液的形成情況（圖1）。當(dāng)CD質(zhì)量濃度為20 mg/mL，油水體積比2∶8時，α-、β-CD形成的乳化層較高，γ-CD和β-CD衍生物（M-β-CD、diM-β-CD、HP-β-CD）幾乎沒有乳化層。且當(dāng)油相為MCT時，α-CD與β-CD乳化層高度接近，而在其他油相中α-CD的乳化層高度明顯高于β-CD；表明CD的結(jié)構(gòu)及油相類型對乳液的形成有顯著影響，α-CD的乳化穩(wěn)定性更好。Yu等[24]采用α-、β-和γ-CD為乳化劑穩(wěn)定油相，在0 d和22 d對乳液結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，也發(fā)現(xiàn)α-和β-CD具有穩(wěn)定乳液的能力，而γ-CD乳化穩(wěn)定性不佳。

圖 1 CD種類和油相類型對Pickering乳液的影響Fig. 1 Effects of cyclodextrin type and oil phase type on appearance of Pickering emulsion

2.2 油水比對乳液的影響

MCT天然存在于棕櫚仁油、椰子油等食品和母乳中，是膳食脂肪的來源之一，主要成分是辛、癸酸甘油酯。MCT由飽和脂肪酸構(gòu)成，凝固點低、黏度小、氧化穩(wěn)定性好，且在高溫和低溫下特別穩(wěn)定，被廣泛用于食品脂溶性活性成分的遞送體系構(gòu)建[25]。鑒于α-和β-CD對MCT具有相近的乳化穩(wěn)定性，因而其被挑選用于后續(xù)實驗。在2.1節(jié)基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步考察CD空腔體積對乳化穩(wěn)定性的影響，選擇α-、β-、γ-CD為乳化劑。如圖2所示，當(dāng)CD質(zhì)量濃度為20 mg/mL，油相為MCT時，α-、β-和γ-CD的乳化穩(wěn)定性均隨油水比的增加而增強，適當(dāng)增加油水比，可提高乳化穩(wěn)定性，這與Chevalier等[26]的結(jié)果一致，但過高的油水比可能會造成破乳現(xiàn)象[15]。

圖 2 油水比對Pickering乳液的影響Fig. 2 Effect of oil-to-water ratio on appearance of Pickering emulsion

2.3 CD質(zhì)量濃度對乳液的影響

圖 3 CD質(zhì)量濃度對Pickering乳液的影響Fig. 3 Effect of amount of CD added on appearance of Pickering emulsion

如圖3所示，在油相為MCT，油水比5∶5的乳液中，α-CD的乳化穩(wěn)定性隨其質(zhì)量濃度的增加而顯著提高，在質(zhì)量濃度15 mg/mL（α-15）時，α-CD乳化層高度基本不再增加，其乳化層高度和25 mg/mL（α-25）時乳化層高度接近。β-CD在質(zhì)量濃度為5 mg/mL（β-5）時無法形成穩(wěn)定乳液，但隨質(zhì)量濃度的增加，β-CD形成的乳化層高度迅速提高，在15 mg/mL（β-15）時則能形成均一穩(wěn)定乳液。在低質(zhì)量濃度下α-CD的乳化穩(wěn)定性顯著高于β-CD，而在高質(zhì)量濃度下β-CD的乳化穩(wěn)定性更好，且二者形成的乳液30 d，仍可保持穩(wěn)定。而γ-CD的乳化穩(wěn)定性隨質(zhì)量濃度的增加沒有顯著變化，形成的乳化層與α-、β-CD相比，較稀薄、不夠均一，30 d后會出現(xiàn)分層現(xiàn)象。CD的乳化穩(wěn)定性隨質(zhì)量濃度的增加而增強，這歸因于體系中CD的增加可降低界面張力，并增強界面的厚度與強度[27-28]。但CD結(jié)構(gòu)對乳液形成和穩(wěn)定有顯著差異，需進(jìn)一步研究。

2.4 界面張力

固體顆粒通過在油滴表面駐留穩(wěn)定乳液，該機理不同于傳統(tǒng)表面活性劑，其是基于水和油對固體顆粒表面的部分潤濕作用。界面張力可反映乳化劑的乳化能力，是衡量顆粒乳化能力的重要手段。本研究測定了CD對MCT/水界面張力的影響，以進(jìn)一步比較它們的乳化穩(wěn)定性。如圖4所示，與空白相比（25.23 mN/m），CD能降低油水界面的界面張力，α-CD（8.96 mN/m）和β-CD（9.81 mN/m）降低效果明顯，且結(jié)果接近，而γ-CD（24.53 mN/m）效果不佳，表明α-和β-CD顆粒具有更好的表面活性，形成Pickering乳液的能力更強，這與前面的實驗現(xiàn)象一致。

圖 4 CD對油/水界面張力的影響Fig. 4 Effect of CDs on O/W interfacial tension

2.5 乳液微觀結(jié)構(gòu)

圖5為油相為MCT，油水比為5∶5時，α-和β-CD質(zhì)量濃度（5～25 mg/mL）對乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響。當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，α-CD可形成穩(wěn)定的Pickering乳液，粒徑為（44.16±1.39）μm，而此時β-CD不能形成穩(wěn)定的Pickering乳液。表明α-CD在油/水界面處與MCT結(jié)合緊密，界面駐留能力強，在較低質(zhì)量濃度就可形成穩(wěn)定乳液，而β-CD與MCT結(jié)合弱，界面駐留能力不強，需更高質(zhì)量濃度穩(wěn)定乳液。

圖 5 CD穩(wěn)定的Pickering乳液的光學(xué)顯微圖Fig. 5 Optical micrograph images of Pickering emulsions stabilized by CDs

在15 mg/mL時，α-CD形成的Pickering乳液粒徑為（26.58±1.67）μm，而β-CD形成的Pickering乳液粒徑為（8.94±0.82）μm，α-CD形成穩(wěn)定的Pickering乳液粒徑較大；在25 mg/mL時，α-CD形成穩(wěn)定的Pickering乳液粒徑為（13.28±0.73）μm，而β-CD形成穩(wěn)定的Pickering乳液粒徑為（5.50±0.47）μm，α-CD形成穩(wěn)定的Pickering乳液粒徑仍較大。這是可能由于β-CD水溶性遠(yuǎn)低于α-CD[29]，其沉淀在水相中更易聚集，可更好地阻止了油滴合并，因而由其形成的Pickering乳液的油滴粒徑更小。圖6為質(zhì)量濃度為15 mg/mL時，α、β-CD所穩(wěn)定乳液的激光共聚焦顯微圖，MCT用尼羅紅染色標(biāo)記為藍(lán)色，CD用尼羅藍(lán)染色標(biāo)記為紅色。由圖6可知，乳液液滴為圓形，被紅色環(huán)所包裹，表明α、β-CD顆粒包裹MCT構(gòu)成的油滴，構(gòu)成了O/W型Pickering乳液。

圖 6 CD穩(wěn)定的Pickering乳液的激光掃描共聚焦顯微圖Fig. 6 Laser-scanning confocal micrograph images of Pickering emulsions stabilized by CDs

2.6 乳液貯藏穩(wěn)定性

當(dāng)油相為MCT，油水比為5∶5時，α-CD和β-CD質(zhì)量濃度（5～25 mg/mL）對反映乳液貯藏穩(wěn)定性的ES和SI的影響如圖7和表1所示。CD質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，α-CD可形成Pickering乳液，而β-CD則不行。當(dāng)質(zhì)量濃度為15 mg/mL和25 mg/mL時，α-CD和β-CD均可形成乳液，且β-CD的ES高于α-CD，這與2.5節(jié)中β-CD乳液粒徑小于α-CD的現(xiàn)象一致。當(dāng)貯藏30 d后，α-CD的ES均顯著降低，而β-CD的ES保持穩(wěn)定。隨著CD質(zhì)量濃度的增加，二者的SI都顯著提高，即由高質(zhì)量濃度CD形成的乳液穩(wěn)定性更好。這是由于隨著CD質(zhì)量濃度的增加，其在油水界面的駐留量增大，在油相和水相間形成物理屏障，阻止液滴之間相互靠攏、聚集，從而提高乳液穩(wěn)定性[30]。而且顆粒濃度的增大會提高Pickering乳液黏度，阻礙液滴間的碰撞和凝聚，從而增強乳液的穩(wěn)定性[31]。

圖 7 不同質(zhì)量濃度Pickering乳液貯藏1 d（A）和30 d（B）的穩(wěn)定性Fig. 7 Stability of Pickering emulsions at different mass concentrations after 1 d (A) and 30 d (B) of storage

表 1 CD穩(wěn)定的Pickering乳液的貯藏穩(wěn)定性比較Table 1 Comparison of storage stability of Pickering emulsions stabilized by CDs

2.7 乳液微流變分析

光學(xué)微流變是一種基于擴(kuò)散波光譜的流變測定方法，它通過向乳液發(fā)射一束相干激光，利用激光跟蹤粒子的布朗運動，從激光信號變化測定樣品的黏彈性參數(shù)[32]。與機械流變相比，微流變法是在零剪切情況下進(jìn)行測量，可監(jiān)測乳液的布朗運動，并從微觀的角度對其進(jìn)行了解釋。本研究運用光學(xué)微流變法考察了CD質(zhì)量濃度對EI和MVI的影響（圖8）。EI可描述體系彈性強弱，而MVI是樣品在零剪切狀態(tài)下的黏度，能反映體系的質(zhì)構(gòu)、流動性、長期穩(wěn)定性等[33]。如圖8所示，α-和β-CD乳液的EI均隨CD質(zhì)量濃度的增加而增大，α-5大于β-5、β-15略微大于α-15、β-25大于α-25。表明在低質(zhì)量濃度下α-CD乳液的彈性大于β-CD的彈性，在高質(zhì)量濃度下β-CD乳液的EI更強。在黏性分析中，α-和β-CD的MVI值均隨CD質(zhì)量濃度的增加而升高，α-5大于β-5，α-15略微大于β-15、β-25大于α-25。這表明在低CD質(zhì)量濃度下α-CD乳液的黏性大于β-CD的黏性，在高CD質(zhì)量濃度下β-CD乳液的黏性更強。在彈性分析中α-CD和β-CD乳液的彈性值EI均隨時間的變化比較穩(wěn)定，而在黏性測定中二者的MVI值隨時間都有一定的波動，且β-CD的MVI值波動顯著高于α-CD，這可能是由于α-CD在油水界面具有更強的駐留性，而β-CD在油水界面的駐留性不強，其在油水界面吸附同時，還在溶液中沉淀聚集，二者隨時間相互轉(zhuǎn)換，造成黏性隨時間出現(xiàn)較大波動。

圖 8 CD穩(wěn)定的Pickering乳液的微流變結(jié)果Fig. 8 Microrheological results of Pickering emulsions stabilized by CDs

2.8 分子對接

CD穩(wěn)定Pickering乳液被歸因于連續(xù)相中CD與甘油三酯在油/水界面自組裝形成具有類似表面活性劑作用的兩親性超分子，降低油/水界面張力，并在界面形成穩(wěn)定的膜結(jié)構(gòu)。本研究中，α-、β-和γ-CD具有相近分子大小，在條件合適時，均可形成O/W型的Pickering乳液，但低質(zhì)量濃度時，α-CD表現(xiàn)最好，而β-CD和γ-CD次之，表明CD空腔的尺寸對其與MCT結(jié)合有顯著影響，并最終導(dǎo)致了三者乳化穩(wěn)定性的差異。為更好解析實驗結(jié)果，本研究引入分子對接方法，系統(tǒng)比較三者與MCT分子形成包合物的難易。如圖9所示，MCT均可進(jìn)入各CD空腔內(nèi)，其脂肪鏈均指向CD外側(cè)，形成兩親性超分子。但表征包合物形成難易的結(jié)合能（EBinding）卻存在顯著差異，α-CD與MCT形成復(fù)合物的能力最強（EBinding＝-8.32 kcal/mol），β-CD次之（EBinding＝-7.14 kcal/mol），γ-CD最低（EBinding＝-7.07 kcal/mol），這較好解釋了乳化實驗中觀察到的現(xiàn)象。

圖 9 CD與MCT的分子對接結(jié)果Fig. 9 Molecular docking results between CDs and MCT

3 結(jié) 論

本研究以CD為乳化劑，考察CD結(jié)構(gòu)、質(zhì)量濃度、油相類型、油水比等因素對O/W型Pickering乳液形成和穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明α-和β-CD有較好的乳化性，其乳化穩(wěn)定性隨油水比和質(zhì)量濃度的增加而增大，油相類型對乳化穩(wěn)定性也有顯著影響。α-和β-CD均能顯著降低油/水界面張力，且效果接近。但在乳液微觀結(jié)構(gòu)和貯藏穩(wěn)定性實驗中，α-CD在低質(zhì)量濃度（5 mg/mL）時其乳液穩(wěn)定性最好，而β-CD則在高質(zhì)量濃度（15、25 mg/mL）時其乳液液滴粒徑更小、更均一，且乳液穩(wěn)定性表現(xiàn)更佳。結(jié)合微流變和分子對接分析，認(rèn)為這歸因于α-CD與MCT分子間結(jié)合作用強，易于形成兩親性超分子，因而其在低濃度時的乳化穩(wěn)定性優(yōu)于β-CD。β-CD雖然在油水界面的駐留性略遜于α-CD，但在高濃度時其不僅可在油/水界面發(fā)揮乳化作用，還可通過水相中的沉淀聚集，阻礙油滴間的碰撞和凝聚，提高乳液穩(wěn)定性。