劉 嫻，黃張君，李 霞，廖學(xué)品，石 碧

（四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065）

中國(guó)白酒是以糧谷為原料，酒曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)過(guò)固態(tài)、半固態(tài)或糖化發(fā)酵而成的蒸餾酒[1]。決定白酒風(fēng)格和特征的微量成分占2%，目前已有超過(guò)2 000 種微量成分被檢測(cè)出來(lái)，其中包括醛類、酯類、醇類、雜環(huán)類、萜烯類、芳香類、酮類、含氮化合物、酸類、硫類、縮醛類和內(nèi)酯類[2]。

白酒發(fā)展的導(dǎo)向是健康與風(fēng)味，2016年孫寶國(guó)團(tuán)隊(duì)首次提出健康白酒可以通過(guò)“內(nèi)尋外加，自然強(qiáng)化”實(shí)現(xiàn)[3]。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，白酒中多種健康成分已成功實(shí)現(xiàn)了分離鑒定[4-6]。江南大學(xué)已經(jīng)從白酒中檢測(cè)出非揮發(fā)性脂肽類化合物地衣素和多肽，證實(shí)它們具有抗癌、抗病毒、溶纖、抑菌活性以及對(duì)白酒中揮發(fā)性成分具有選擇性抑制作用[7-10]。而膠原多肽由于具有抗氧化、能夠預(yù)防動(dòng)脈硬化、抗衰老易吸收等作用，已被廣泛應(yīng)用于食品和化妝品行業(yè)[11]。白酒體系中適量的醛類揮發(fā)性成分可協(xié)調(diào)白酒的香氣釋放，但醛類物質(zhì)過(guò)量便會(huì)導(dǎo)致白酒入口粗糙、口感不佳甚至產(chǎn)生刺喉的感受[12]，其中，糠醛能夠賦予白酒異香，但濃度過(guò)大時(shí)會(huì)呈現(xiàn)嚴(yán)重的辣味甚至焦苦味[13]。因此，膠原多肽與白酒體系中醛類物質(zhì)的作用機(jī)理研究將為健康白酒的發(fā)展提供理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)以模擬白酒體系為研究對(duì)象，通過(guò)紫外光譜、熒光光譜以及三維熒光光譜研究了膠原多肽與白酒中糠醛、苯甲醛、乙醛、異戊醛的相互作用，并提出了它們之間的反應(yīng)機(jī)制。然后通過(guò)頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術(shù)分析膠原多肽對(duì)濃香型白酒中醛類物質(zhì)含量的影響，揭示膠原多肽對(duì)白酒中揮發(fā)性成分及醛類物質(zhì)的影響規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膠原多肽為實(shí)驗(yàn)室自制，平均分子質(zhì)量3 000 Da；糠醛、異戊醛、乙醛、苯甲醛、正辛酸甲酯（以上均為色譜級(jí)，≥99.0%） 上海阿拉丁試劑有限公司；無(wú)水乙醇（色譜純） 成都天潤(rùn)化工有限公司；濃香型白酒四川某酒業(yè)；純水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

膠原多肽儲(chǔ)備液：將0.4 g膠原多肽加入200.0 mL 52%（V/V）乙醇溶液中，配制成質(zhì)量濃度2.0 g/L的膠原多肽儲(chǔ)備液；醛類物質(zhì)儲(chǔ)備液：將糠醛、苯甲醛、乙醛和異戊醛分別用52%乙醇溶液稀釋成2.0、2.0、10.0、10.0 g/L的儲(chǔ)備液，于4.0 ℃低溫貯藏備用。

1.2 儀器與設(shè)備

Lumina型熒光光度計(jì)、TSQ 9000 GC-MS/MS儀賽默飛世爾科技有限公司；UV-1800BPC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；ZWY-2102C溫控回旋立式雙層振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭 美國(guó)色譜科公司；VF-WAX ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細(xì)管色譜柱美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 紫外光譜分析

參考吳繼紅[9]的方法略有修改，將不同質(zhì)量濃度的糠醛、苯甲醛、乙醛、異戊醛和固定質(zhì)量濃度（10.0 mg/L）的膠原多肽于309 K反應(yīng)1.0 h后，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，紫外光譜的掃描范圍為波長(zhǎng)190～300 nm。

1.3.2 熒光光譜分析

參考饒震紅等[14]的方法略有修改，在若干支50 mL比色管中分別加入5.0 mL膠原多肽儲(chǔ)備液，將不同質(zhì)量濃度的4 種醛類物質(zhì)分別加入上述膠原多肽溶液中，配制得到一系列質(zhì)量濃度梯度的混合溶液。將上述溶液充分混合并在3 種不同溫度（293、301 K和309 K）反應(yīng)1.0 h并進(jìn)行熒光光譜分析。其中，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為276 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為280～450 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5.0 nm。

1.3.3 熒光猝滅機(jī)制的確定

為了研究糠醛、苯甲醛、乙醛和異戊醛對(duì)膠原多肽的猝滅機(jī)制，分別在293、301、309 K反應(yīng)1.0 h后，通過(guò)Stern-Volmer方程[15]計(jì)算猝滅常數(shù)Ksv：

式中：F0和F為未添加猝滅劑和添加猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度；Ksv為猝滅常數(shù)；[Q]為猝滅劑的濃度；Kq為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)；τ0為無(wú)猝滅劑時(shí)大分子的平均熒光壽命（10－8s）。

膠原多肽與醛類物質(zhì)結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可以由雙對(duì)數(shù)方程[16]計(jì)算：

式中：F0和F為未添加猝滅劑和添加猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度；Ka為結(jié)合常數(shù)；[Q]為猝滅劑的濃度；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1.3.4 相互作用力的確定

由Van’t Hoff公式[17]可以計(jì)算出反應(yīng)熵變?chǔ)和焓變?chǔ)：

由式（2）～（4）可計(jì)算出結(jié)合常數(shù)Ka及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，以及相互結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)。

1.3.5 三維熒光光譜分析

分別取5.0 mL膠原多肽儲(chǔ)備液于50 mL比色管中，固定膠原多肽含量，分別加入糠醛、異戊醛、乙醛和苯甲醛儲(chǔ)備液，配制得到醛類物質(zhì)的濃度分別為0.026 0、0.188 5 mmol/L和36.322 4 mmol/L，然后于309 K反應(yīng)1.0 h后取適量的溶液于1.0 cm的石英比色皿內(nèi)，在激發(fā)波長(zhǎng)260～380 nm（增量為1.0 nm）、發(fā)射波長(zhǎng)230～320 nm（增量5.0 nm）的條件下進(jìn)行三維熒光分析，得到三維熒光光譜。

1.3.6 HS-SPME-GC-MS分析

將一定含量的膠原多肽加入250 mL濃香型白酒中，配制得到膠原多肽質(zhì)量濃度分別為0.0、2.0、20.0、200.0 mg/L，25 ℃放置12 h后分析白酒成分。

HS-SPME條件：根據(jù)文獻(xiàn)[9]，將酒樣酒度稀釋成10%，取8 mL稀釋后的酒樣于20 mL頂空瓶中，每個(gè)樣品瓶加入10 μL內(nèi)標(biāo)（正辛酸甲酯，最終質(zhì)量濃度為0.093 8 mg/L），將樣品瓶在35 ℃平衡10 min，并在35 ℃萃取45 min，攪拌速率500 r/min，每個(gè)樣品重復(fù)萃取3 次。

GC條件：進(jìn)樣口溫度270 ℃，載氣為He，分流比為20∶1，升溫程序：初始溫度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min的速率升至100 ℃，再以6 ℃/min的速率升至230 ℃，保持10 min。

MS條件：采用電子電離源，電離能量為70 eV；離子源溫度300 ℃；掃描范圍m/z35～400；溶劑延遲時(shí)間3.50 min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用Microsoft Office Excel 2010對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜分析

紫外-可見(jiàn)吸收光譜能夠簡(jiǎn)單、快速、有效地測(cè)定復(fù)合物的形成。當(dāng)小分子化合物與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用時(shí)，其紫外光譜圖中吸收峰會(huì)產(chǎn)生明顯變化[18]。本研究中，膠原多肽在波長(zhǎng)198 nm處存在最大吸收峰，其與膠原多肽鏈上—C＝O的n—π*躍遷有關(guān)[14]。

圖 1 膠原多肽與不同濃度糠醛（a）、苯甲醛（b）、乙醛（c、d）和異戊醛（e、f）的紫外光譜圖Fig. 1 UV absorption spectra of collagen peptide in the presence of different concentrations of furfural (a), benzaldehyde (b), acetaldehyde (c, d),and isovaleraldehyde (e, f)

如圖1a、b所示，隨著糠醛和苯甲醛濃度的逐漸升高，混合溶液在198 nm波長(zhǎng)處的吸收峰均呈現(xiàn)增強(qiáng)現(xiàn)象。在糠醛-膠原多肽體系中，糠醛在224 nm波長(zhǎng)處的峰隨著糠醛濃度的增加產(chǎn)生紅移現(xiàn)象；而在苯甲醛-膠原多肽體系中，苯甲醛濃度的升高使膠原多肽在198 nm波長(zhǎng)處的吸收峰有明顯紅移的現(xiàn)象。上述結(jié)果表明，糠醛和苯甲醛這兩種醛類物質(zhì)能與膠原多肽產(chǎn)生相互作用[19]。在圖1c、e中，當(dāng)乙醛和異戊醛濃度較低時(shí)，紫外吸收峰未產(chǎn)生明顯變化，說(shuō)明低濃度的乙醛和異戊醛與膠原多肽未發(fā)生相互作用。繼續(xù)增加乙醛和異戊醛濃度，如圖1d、f所示，膠原多肽在198 nm波長(zhǎng)處的吸收峰強(qiáng)度逐漸增大，并且乙醛-膠原多肽體系在280 nm波長(zhǎng)左右和異戊醛-膠原多肽體系在290 nm波長(zhǎng)左右出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，且該吸收峰的強(qiáng)度也隨著乙醛和異戊醛濃度的增加呈明顯增強(qiáng)趨勢(shì)，說(shuō)明當(dāng)乙醛和異戊醛的濃度較高時(shí)，能與膠原多肽發(fā)生反應(yīng)并形成復(fù)合物。可能是膠原多肽的氨基與醛基反應(yīng)生成—C＝N—席夫堿結(jié)構(gòu)，其反應(yīng)機(jī)理如圖2所示，通常生成席夫堿的反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，穩(wěn)定性差，但由于芳香族醛具有一定的疏水性，能夠與膠原多肽以疏水鍵結(jié)合，因此芳香族席夫堿比脂肪族席夫堿更穩(wěn)定[20]。因此，糠醛與苯甲醛更容易與膠原多肽發(fā)生反應(yīng)，而乙醛和異戊醛只有濃度較高時(shí)，才能與膠原多肽形成復(fù)合物，從而在紫外光譜中表現(xiàn)出明顯的差異。白酒中乙醛濃度僅在3.405 2～6.810 4 mmol/L之間，異戊醛濃度范圍鮮有報(bào)道，但應(yīng)該遠(yuǎn)少于白酒中乙醛的濃度[13]，所以在白酒中加入的膠原多肽基本上不會(huì)與乙醛和異戊醛進(jìn)行反應(yīng)。

圖 2 醛-膠原多肽反應(yīng)機(jī)理Fig. 2 Reaction mechanism between aldehydes and collagen peptide

普遍認(rèn)為糠醛是白酒中的苦味物質(zhì)之一[21]，本研究表明白酒中加入膠原多肽可與糠醛結(jié)合，從而降低白酒的苦味。另一方面，膠原多肽中含有多種對(duì)人體有益的活性肽[22]。因此，在白酒中加入膠原多肽不僅可以減少苦味，還具有一定的保健功能。

2.2 熒光光譜分析

2.2.1 熒光猝滅光譜

熒光光譜能夠反應(yīng)小分子化合物和蛋白質(zhì)之間結(jié)合環(huán)境的變化，因此被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)與小分子之間相互作用的研究[23]。膠原多肽中主要由酪氨酸殘基產(chǎn)生熒光。由圖3可知，隨著糠醛、苯甲醛、乙醛和異戊醛4 種醛類物質(zhì)濃度的增加，膠原多肽的熒光產(chǎn)生明顯的猝滅現(xiàn)象，但未出現(xiàn)紅移或藍(lán)移。

圖 3 膠原多肽與不同濃度醛類的熒光光譜Fig. 3 Fluorescence spectra of collagen peptide with different concentrations of aldehyde

熒光猝滅分為靜態(tài)猝滅、動(dòng)態(tài)猝滅及動(dòng)態(tài)靜態(tài)結(jié)合猝滅。這些猝滅機(jī)制可以通過(guò)猝滅常數(shù)隨溫度變化和熒光壽命的變化進(jìn)行區(qū)分。動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑分子與熒光分子的激發(fā)態(tài)分子之間產(chǎn)生相互碰撞而導(dǎo)致的熒光猝滅，溫度越高，猝滅常數(shù)越大，故猝滅常數(shù)與溫度變化呈正比。靜態(tài)猝滅是猝滅劑分子與熒光分子在基態(tài)時(shí)生成不發(fā)熒光的復(fù)合物，其中，猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而降低。動(dòng)態(tài)靜態(tài)結(jié)合猝滅是由于同一熒光基團(tuán)受到碰撞和形成復(fù)合物而導(dǎo)致的，可以根據(jù)猝滅劑濃度的大小和變化趨勢(shì)進(jìn)行判斷[24-25]。

表 1 膠原多肽分別與糠醛、苯甲醛、乙醛和異戊醛相互作用的Stern-Volmer常數(shù)Table 1 Stern-Volmer constants for the interactions of collagen peptide with furfural, benzaldehyde, acetaldehyde and isovaleraldehyde

由表1可知，當(dāng)猝滅劑為糠醛和苯甲醛時(shí)，猝滅常數(shù)隨著溫度增高而降低，且Kq均遠(yuǎn)大于2×1010L/（mol·s），說(shuō)明發(fā)生的是靜態(tài)猝滅，膠原多肽與糠醛和苯甲醛生成了復(fù)合物[26]。當(dāng)猝滅劑為異戊醛和乙醛時(shí)，猝滅常數(shù)隨著溫度升高而升高，且Kq均小于2×1010L/（mol·s），說(shuō)明在此濃度范圍內(nèi)發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅，乙醛和異戊醛與膠原多肽未形成復(fù)合物[27]。

2.2.2 相互結(jié)合的作用力分析

通過(guò)熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，當(dāng)猝滅劑為糠醛和苯甲醛時(shí)，膠原多肽與其結(jié)合形成了復(fù)合物。因此，本研究通過(guò)熱力學(xué)計(jì)算對(duì)它們之間的結(jié)合作用力進(jìn)一步分析。由圖4可見(jiàn)，雙對(duì)數(shù)方程擬合結(jié)果具有良好的線性關(guān)系，可由此得到結(jié)合常數(shù)Ka及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。由表2可見(jiàn)，不同溫度下苯甲醛與膠原多肽以及糠醛與膠原多肽的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1[17]。

大分子化合物和小分子化合物的結(jié)合力主要有4 種，分別為氫鍵、范德華力、疏水作用力、靜電作用力。根據(jù)熱力學(xué)規(guī)律可知，當(dāng)ΔS＜0和ΔH＜0時(shí)，主要是氫鍵和范德華力；當(dāng)ΔS＜0和ΔH＞0時(shí)，主要為靜電作用力；當(dāng)ΔS＞0和ΔH＞0時(shí)，主要為疏水作用力[28]。由表2可見(jiàn)，糠醛-膠原多肽體系和苯甲醛-膠原多肽體系的ΔG＜0，且隨著溫度的升高而降低，說(shuō)明糠醛和苯甲醛與膠原多肽的反應(yīng)都是自發(fā)進(jìn)行的。熵變與焓變均大于0，說(shuō)明它們之間主要以疏水作用力相結(jié)合[29]，這與紫外光譜的分析結(jié)果一致。

圖 4 糠醛與膠原多肽混合體系（a）、苯甲醛與膠原多肽混合體系（b）在不同溫度下的雙對(duì)數(shù)方程Fig. 4 Double logarithmic plots for furfural-collagen peptide (a) and benzaldehyde-collagen peptide (b) at various temperatures

表 2 膠原多肽與糠醛和苯甲醛結(jié)合形成分子復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Binding constants, number of binding sites and thermodynamic parameters of molecular complexes formed by the interactions of collagen peptide with furfural and benzaldehyde

2.3 三維熒光光譜

三維熒光可以更為直觀地描述被測(cè)物質(zhì)的熒光變化信息[30]。圖5為膠原多肽中加入低（0.026 0 mmol/L）、中（0.188 5 mmol/L）和高（36.322 4 mmol/L）3 個(gè)濃度的糠醛、苯甲醛、乙醛和異戊醛前后的熒光變化等高線譜圖，圖中A（λem＝λex）代表瑞利散射峰，Peak 1代表膠原多肽中酪氨酸殘基特征熒光峰[31]。比較圖5a～d，隨著醛的加入Peak 1的熒光強(qiáng)度均有減弱的現(xiàn)象，說(shuō)明它們之間能夠發(fā)生相互作用。當(dāng)糠醛濃度僅為0.026 0 mmol/L時(shí)，即可看到明顯的熒光猝滅；當(dāng)苯甲醛濃度為0.188 5 mmol/L時(shí)，能看到明顯的熒光猝滅；當(dāng)乙醛和異戊醛濃度高達(dá)36.322 4 mmol/L才可看到明顯的熒光猝滅。因此，這4 種醛類物質(zhì)對(duì)膠原多肽相互作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋嚎啡颈郊兹井愇烊疽胰?。三維熒光的分析結(jié)果進(jìn)一步證明，膠原多肽能夠與糠醛和苯甲醛發(fā)生明顯的相互作用，而乙醛和異戊醛只有在高濃度下才可能與膠原多肽發(fā)生相互作用。

圖 5 膠原多肽-醛溶液體系的三維熒光光譜Fig. 5 Three-dimensional fluorescence contour spectra of collagen peptide-aldehydes

2.4 膠原多肽影響白酒中揮發(fā)性成分的HS-SPME-GCMS分析結(jié)果

本研究目的主要是考慮健康酒即配制酒。模擬體系組成單一，能夠準(zhǔn)確的闡明反應(yīng)過(guò)程；而真實(shí)白酒體系太過(guò)復(fù)雜，干擾因素太多，難于準(zhǔn)確揭示膠原多肽與醛的反應(yīng)機(jī)理，而發(fā)酵白酒中這幾種醛是存在的，只是不同的發(fā)酵條件下含量不同而已[1]。因此，本實(shí)驗(yàn)在模擬體系的基礎(chǔ)上，將不同含量的膠原多肽加入濃香型白酒中，采用HS-SPME-GC-MS分析技術(shù)定性和內(nèi)標(biāo)法定量，用真實(shí)體系驗(yàn)證上述模擬體系所得出的結(jié)果。

對(duì)實(shí)際的白酒體系，采用HS-SPME-GC-MS分析共定性出30 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中22 種酯類化合物、3 種醛類化合物、1 種醇類化合物、2 種烷烴類、1 種酸類和1 種酚類化合物。加入膠原多肽后，白酒中揮發(fā)性成分含量均有不同程度的降低。其中醛類化合物含量降低較為明顯，當(dāng)加入的膠原多肽質(zhì)量濃度為200.0 mg/L時(shí)，3-糠醛的質(zhì)量濃度從0.179 9 mg/L降低至0.144 6 mg/L，苯甲醛的質(zhì)量濃度從0.506 8 mg/L降低至0.350 4 mg/L，這表明膠原多肽能夠與醛類物質(zhì)發(fā)生相互作用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立模擬白酒體系，利用紫外光譜、熒光光譜和三維熒光光譜研究膠原多肽對(duì)糠醛、苯甲醛、乙醛和異戊醛的相互作用，并使用HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析膠原多肽對(duì)實(shí)際的清香型白酒揮發(fā)性成分的影響。研究發(fā)現(xiàn)，膠原多肽與糠醛和苯甲醛之間以疏水作用力形成復(fù)合物，且溫度越高，疏水鍵作用越強(qiáng)；膠原多肽與低濃度的乙醛和異戊醛作用力較弱，但在高濃度下可觀察到明顯的相互作用；膠原多肽能夠顯著降低實(shí)際白酒中醛類物質(zhì)含量。上述研究將為健康白酒以及配制酒的發(fā)展提供理論依據(jù)。