孫彩虹，李瑞明，田 野，黃愛(ài)嵐，劉 楊，何 毅*

（1.中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇 211198；2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院現(xiàn)代中藥開(kāi)發(fā)中心，天津 300410；3.天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300410；4.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院化學(xué)藥品開(kāi)發(fā)中心，天津 300410）

功能性消化不良（FD）是指具有上腹痛、上腹脹、早飽等不適癥狀的非器質(zhì)性疾病，是常見(jiàn)的功能性胃腸疾?。?］，本病全球范圍內(nèi)患病率高達(dá)10%～30%［2］。連夏消痞顆粒由經(jīng)典驗(yàn)方半夏瀉心湯化裁而來(lái)，其具有和胃降逆、開(kāi)結(jié)消痞的功效。臨床研究結(jié)果表明，連夏消痞顆粒對(duì)FD 具有顯著的治療作用。本課題組前期研究鑒定出100 個(gè)化學(xué)成分，主要為黃酮苷、生物堿類、香豆素類化合物（未報(bào)道數(shù)據(jù)）。但連夏消痞顆粒治療FD 的相應(yīng)的機(jī)制尚未明確，需要進(jìn)一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念由Andrew L Hopkins 于2007年首次提出，是基于多藥物-多靶標(biāo)-多疾病形成的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析藥物與疾病的治療作用［3］。分子對(duì)接（molecular docking）是基于受體結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)及篩選方法尋找小分子（配體）與生物大分子（受體）之間最佳結(jié)合構(gòu)象［4］。本研究在前期物質(zhì)基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)上，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接對(duì)連夏消痞顆粒治療FD的潛在通路、靶點(diǎn)和活性成分進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期為連夏消痞顆粒治療FD 的作用機(jī)制研究提供理論參考。

1 方法

1.1 活性化合物篩選及其靶點(diǎn)的檢索 結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)采用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得已鑒定全方化學(xué)成分詳細(xì)信息，利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)全方化學(xué)成分進(jìn)行活性篩選（口服利用度≥30%，類藥性≥0.18），并結(jié)合STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)活性化合物靶點(diǎn)進(jìn)行檢索去重，最后利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因名統(tǒng)一。

1.2 FD 相關(guān)作用靶點(diǎn)的檢索 通過(guò)在OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCard 數(shù)據(jù)庫(kù)和DigSee 等數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“functional dyspepsia”、“abdominal pain”、“Postprandial Discomfort Syndrome”、“epigastric pain syndrome”等關(guān)鍵詞搜索FD 相關(guān)作用靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)并結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行篩選，最終獲得FD 相關(guān)作用靶點(diǎn)。

1.3 活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將獲得的活性化合物作用靶點(diǎn)和FD 作用靶點(diǎn)取交集得到活性化合物與疾病共同作用靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建藥味-活性化合物-共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)圖中采用不同顏色代表不同節(jié)點(diǎn)類型，具有相互作用的節(jié)點(diǎn)以邊相連。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將上述共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為homosapiens，設(shè)置minimum required interaction score 為medium confidence（0.400），導(dǎo)出PPI 網(wǎng)絡(luò)TSV 格式文件。將該TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。

1.5 靶點(diǎn)GO 富集 將上述化合物和疾病共有作用核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)，利用其functional annotation功能，輸入official gene symbol，設(shè)定background 為人源，進(jìn)行GO 富集分析。

1.6 KEGG 富集通路分析 將上述化合物和疾病共有作用核心靶點(diǎn)導(dǎo)入KOBAS 3.0 數(shù)據(jù)庫(kù)，利用其Gene-list Enrichment 功能，輸入gene symbol，設(shè)定background 為人源，進(jìn)行KEGG 通路富集分析，并構(gòu)建活性化合物-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 分子對(duì)接 將上述得到的核心靶點(diǎn)與小分子化合物進(jìn)行分子對(duì)接。在ZINC 數(shù)據(jù)庫(kù)下載mol2 格式文件，在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載蛋白分子晶體結(jié)構(gòu)。采用DOCK 6.0 進(jìn)行分子對(duì)接。首先準(zhǔn)備受體文件，包括刪除配體、去除溶劑、加氫和加電荷等，將受體保存為mol2 格式，之后受體去氫另存為pdb 文件。準(zhǔn)備配體文件，給配體加氫和合適的電荷。選擇晶體結(jié)構(gòu)中配體所在的位置作為結(jié)合位點(diǎn)，距離該位點(diǎn)一定半徑內(nèi)的球集為活性口袋。在活性口袋外生成盒子，除指定文件路徑外，其余參數(shù)采用默認(rèn)值。

分子對(duì)接時(shí)采用grid score 評(píng)價(jià)小分子化合物與蛋白靶點(diǎn)的親和力大小，得到對(duì)接打分值以及小分子的結(jié)合構(gòu)象及兩者間的相互作用情況。用Pymol 軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物及其作用靶點(diǎn)信息 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索與篩選，得到活性化合物27 個(gè)，其中黃連有6 個(gè)活性化合物，包括小檗堿、黃連堿、巴馬汀等，黃芩有14 個(gè)活性化合物，包括黃芩素、漢黃芩素等。各藥味化合物詳細(xì)信息見(jiàn)表1。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)和STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到各個(gè)活性化合物的作用靶點(diǎn)統(tǒng)計(jì)信息見(jiàn)表2，去重后共得到作用靶點(diǎn)193 個(gè)。

2.2 藥味-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析 取交集得到82 個(gè)共有靶點(diǎn)，如圖1 所示。將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，隨后用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建藥味-活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果如圖2 所示。該網(wǎng)絡(luò)圖中共有114 個(gè)節(jié)點(diǎn)（nodes），277 條邊（edges）。表3 列出了部分節(jié)點(diǎn)及介度（betweenness centrality）與緊密度（closeness centrality）［5，6］的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。

該網(wǎng)絡(luò)中菱形節(jié)點(diǎn)代表藥味節(jié)點(diǎn)，有7 個(gè)；矩形節(jié)點(diǎn)代表活性化合物節(jié)點(diǎn)，有25 個(gè)，因5，8，2′-三羥基-7-甲氧基黃酮和枸橘苷未搜索到其作用靶點(diǎn)，故未顯示；橢圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，有82 個(gè)。其中，連夏消痞顆粒方中的黃連和黃芩的度值最高。

該網(wǎng)絡(luò)中degree 值高的靶點(diǎn)有PTGS2、PTGS1、NOS2、SCN5A、PIK3CG、RXRA、CASP3、ADRB2、KCNH2、NOS3 等，其中PTGS2 與23 個(gè)化合物有相互作用，PTGS1與18 個(gè)化合物有相互作用；黃芩中的漢黃芩素（MOL000173）與26 個(gè)靶點(diǎn)蛋白形成相互作用。這符合中藥復(fù)方多成分-多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。

表1 連夏消痞顆?；钚曰衔镄畔?/p>

表2 連夏消痞顆?；钚曰衔飳?duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息

圖1 連夏消痞顆粒治療FD 靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 藥味-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表3 藥味-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果如圖3 所示，共有81 個(gè)節(jié)點(diǎn)（CA2 未與其他蛋白相互作用，本圖并未顯示）和949 條邊，平均每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值為23.43。根據(jù)大于度值的二倍中位數(shù)（42）對(duì)蛋白靶標(biāo)進(jìn)行篩選得到AKT1、IL6、MAPK3、VEGFA、FOS、TNF、CASP3、TP53、JUN、PTGS2 核心靶點(diǎn)，核心靶點(diǎn)詳細(xì)信息如表4。

圖3 連夏消痞顆粒與FD 交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)

表4 PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)信息

2.4 核心靶點(diǎn)GO 功能富集 利用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)的functional annotation 功能對(duì)上述核心靶點(diǎn)進(jìn)行了GO 富集分析，得到生物過(guò)程（Biological Process）、分子功 能（Molecular Function） 和 細(xì) 胞 組 成（Cellular Components）共106 條GO 條目（P＜0.05）。其中生物過(guò)程相關(guān)條目88 條，包括一氧化氮生物合成過(guò)程、ERK1和ERK2 級(jí)聯(lián)，對(duì)糖皮質(zhì)激素脂多糖、抗生素等的反應(yīng)，炎癥反應(yīng)，凋亡過(guò)程、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控等生物功能。分子功能相關(guān)條目13 條，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA 結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚體活性、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。細(xì)胞組成相關(guān)條目5 條，包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞核質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、蛋白質(zhì)復(fù)合物及轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等。生物過(guò)程與分子功能各選取前10條、細(xì)胞組成選取前5 條作圖如圖4 所示。

圖4 連夏消痞顆粒治療FD 核心靶點(diǎn)生物過(guò)程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組成（CC）富集分析

2.5 核心靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析 利用KOBAS 3.0 在線工具對(duì)Pathway 富集分析中得到167 條信號(hào)通路（P＜0.05），選取前20 條繪制如圖5，包括TNF、IL-17、MAPK、Toll 樣受體、T 細(xì)胞受體、VEGF、PI3K-Akt、HIF-1 等信號(hào)通路。此外，還涉及到病毒感染通路和傳染性疾病通路?？煞治龀鲞B夏消痞顆?？赡芡ㄟ^(guò)TNF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路治療FD。

2.6 活性化學(xué)成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 為進(jìn)一步直觀研究連夏消痞顆粒治療FD 是通過(guò)哪些信號(hào)通路起作用，選取排名前五的信號(hào)通路構(gòu)建活性化合物-核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖6 所示。根據(jù)節(jié)點(diǎn)大小可以看出PTGS2、AKT1、IL6、MAPK3、TNF、CASP3 等靶點(diǎn)與化合物和通路均有較強(qiáng)的相互作用關(guān)系，與“2.3”項(xiàng)下所得出的結(jié)果一致。小檗堿、巴馬汀、黃芩素、漢黃芩素、β-谷甾醇及部分其他化合物是該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

圖5 連夏消痞顆粒治療FD 核心靶點(diǎn)的KEGG 通路分析

2.7 分子對(duì)接 將小分子與核心靶點(diǎn)對(duì)接，根據(jù)靶點(diǎn)與原配體的結(jié)合位點(diǎn)確定對(duì)接位置。打分值為負(fù)值，說(shuō)明小分子與蛋白存在相互作用；打分值越低，說(shuō)明兩者相互作用力越強(qiáng)。IL-6 受體抑制劑大多為單抗，原癌基因蛋白c-Fos（FOS）解析的晶體結(jié)構(gòu)中無(wú)配體結(jié)合，故將不對(duì)其深入分析；分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，無(wú)法與各個(gè)靶點(diǎn)對(duì)接，故表中未顯示。最終確定基因AKT1、MAPK3、VEGFA、TNF、CASP3、TP53、JUN、PTGS2 編碼的PDB ID 分別為4GV1、4QTB、6GQO、2AZ5、3KJF、5G4N、5AEP、3MQE。小分子與靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果如表5 所示?？煽闯龃蚍种稻鶠樨?fù)值，說(shuō)明活性物質(zhì)均可對(duì)接到活性口袋中。柚皮素、木蝴蝶素A 與其中7 個(gè)靶點(diǎn)有較好的結(jié)合力；黃芩素、漢黃芩素與其中6 個(gè)靶點(diǎn)可以結(jié)合；小檗堿與PTGS2、TNF、VEGFA3個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合能力強(qiáng)。

圖6 活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

表5 關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性化合物打分值

前期物質(zhì)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿和黃芩苷是連夏消痞顆粒的主要成分，黃芩苷在體內(nèi)可代謝為黃芩素。圖7、圖8 分別展示了小檗堿和黃芩素與VEGFA（綜合打分值最低）結(jié)合情況，可直觀觀察小分子與氨基酸殘基相互作用。

由圖7 可看出小檗堿占據(jù)了VEGFA 的活性空腔，與 GLY922、GLU917、LYS868 形成范德華力，與LEU1035、PHE918、VAL899 等氨基酸殘基形成π 鍵作用。黃芩素與其中6 個(gè)靶點(diǎn)均能較好結(jié)合，主要作用力為氫鍵、范德華力及π 鍵作用。由圖8 可看出，黃芩素很好的占據(jù)了VEGFA 的活性空腔，可與其中的CYS919 等殘基形成氫鍵作用，與GLY922、ALA1050、GLU885 等殘基形成范德華力，與LEU1035、PHE918 等殘基形成π 鍵作用，有較強(qiáng)的相互作用。

圖7 小檗堿與VEGFA 最優(yōu)結(jié)合模式

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)連夏消痞顆?；钚猿煞趾Y選、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)活性化合物27 個(gè)，潛在靶點(diǎn)193 個(gè)，與FD 共有靶點(diǎn)82 個(gè)，篩選出核心靶點(diǎn)10 個(gè)，分子對(duì)接結(jié)果表明小檗堿、黃芩素、柚皮素、木蝴蝶素A、漢黃芩素可能與PTGS2、TNF、MAPK3、JUN 等靶點(diǎn)相互作用來(lái)治療FD，GO 富集分析條目130 條，KEGG 信號(hào)通路167 條，說(shuō)明連夏消痞顆粒治療FD 具有多成分-多靶點(diǎn)-多通路的特點(diǎn)。

圖8 黃芩素與VEGFA 最優(yōu)結(jié)合模式

GO 富集中生物過(guò)程主要涉及到炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、代謝過(guò)程、藥物反應(yīng)、體液免疫應(yīng)答等方面。KEGG 富集結(jié)果顯示其作用通路可能是TNF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，連夏消痞顆粒的活性成分主要通過(guò)作用于AKT1、IL6、MAPK3、VEGFA、FOS、TNF、CASP3、TP53、JUN、PTGS2 等靶點(diǎn)發(fā)揮治療FD的作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明連夏消痞顆粒治療FD可能的主要活性成分共8 個(gè)，分別為β-谷甾醇、漢黃芩素、柚皮素、黃芩素、木蝴蝶素A、木蘭花堿、小檗堿、巴馬汀。

分子對(duì)接結(jié)果顯示小檗堿與VEGFA、PTGS2、TNF有較好的結(jié)合活性，小檗堿可能通過(guò)作用于以上3 個(gè)靶點(diǎn)調(diào)節(jié)TNF 信號(hào)通路與IL-17 信號(hào)通路來(lái)治療FD，有研究表明小檗堿在胃腸道疾病（潰瘍性結(jié)腸炎）中通過(guò)抗炎發(fā)揮治療作用，對(duì)炎性因子的表達(dá)有直接抑制作用［7］，并且對(duì)情緒障礙也有一定的調(diào)節(jié)作用［8］。此外，黃芩素與VEGFA、MAPK3、PTGS2、TNF、JUN、TP53 等靶點(diǎn)結(jié)合力強(qiáng)，分子對(duì)接結(jié)果表明黃芩素可能通過(guò)作用于以上靶點(diǎn)調(diào)節(jié)TNF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路與Toll 樣受體信號(hào)通路發(fā)揮治療FD 作用。前期研究基礎(chǔ)表明黃芩苷在連夏消痞顆粒中大量存在。有研究報(bào)道黃芩素在體內(nèi)和體外均能發(fā)揮抗炎作用，可能是通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路的多步抑制來(lái)發(fā)揮作用［9，10］。精神心理因素是導(dǎo)致FD 的機(jī)制之一，研究表明黃芩素可在不依賴5-羥色胺系統(tǒng)的情況下起到抗焦慮及鎮(zhèn)靜作用［11］，還有研究表明黃芩素可以減輕幽門(mén)螺旋桿菌感染［12］。此外，連夏消痞顆粒以黃芩苷和鹽酸小檗堿雙指標(biāo)成分含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)［13，14］，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，可對(duì)小檗堿和黃芩素通過(guò)作用于MAPK3、PTGS2、TNF、JUN 等靶點(diǎn)調(diào)節(jié)TNF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路與Toll 樣受體信號(hào)通路方面進(jìn)行深入研究。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)對(duì)連夏消痞顆粒的主要活性成分及其治療FD 的作用機(jī)制進(jìn)行了初步的篩選和分析，為后續(xù)深入研究連夏消痞顆粒發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供了方向，也為連夏消痞顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升中指標(biāo)成分的選擇提供了一定的理論依據(jù)。