楊圓圓，林芳珍，范冬梅，楊 銘*

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300020；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，天津 300020）

肝癌是世界第五大常見惡性腫瘤，在我國位列第二，近年來肝癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢［1］。至今，手術(shù)仍然是肝癌治療的首選，但僅有少數(shù)患者適合手術(shù)切除［2］。對于失去手術(shù)機會和復(fù)發(fā)的肝癌患者，尋找藥物治療的新方法、新途徑仍是研究熱點。近年來腫瘤免疫治療的新策略和新思路得到廣泛的研究和發(fā)展，并為傳統(tǒng)治療注入新的活力。其中又以PD-1/PD-L1通路抑制劑在實體瘤中的治療效果最為顯著，目前已應(yīng)用于黑色素瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤。有文獻總結(jié)了免疫治療藥物發(fā)揮作用的三個要素［3］，即腫瘤的突變負(fù)荷、腫瘤內(nèi)部淋巴細(xì)胞的浸潤情況以及PD-L1 的表達水平。CXCR3/CXCL10 趨化軸是T 細(xì)胞遷移的重要信號通路，CXCL10 可以招募多種免疫細(xì)胞直接殺傷腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用，提高患者總生存率。腫瘤部位CXCL10 的表達缺陷可能是造成腫瘤免疫逃逸的作用機制之一［4-6］?；谝陨涎芯浚P者推測CXCL10 能夠促進PD-1 抗體的抗腫瘤作用。本研究以腺病毒為載體使腫瘤細(xì)胞表達PD-1 抗體及趨化因子CXCL10，探討其對HepG2 細(xì)胞的生長抑制作用及其機制，以期為腫瘤的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 BALB/c 裸鼠15 只（5～6 周齡，體重15～20 g，雌性），購自北京維通利華實驗技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于實驗血液學(xué)國家重點實驗室SPF 級實驗動物房，實驗動物許可證號為：SYXK（津）2020-0003。動物實驗方案遵循實驗動物倫理的相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 電泳儀（型號：200/2.0 型，BIORAD 公司），全自動凝膠成像系統(tǒng)（型號：Tanon1600，上海天能），恒溫金屬?。ㄐ吞枺篋KT200-2A，杭州米歐儀器有限公司），恒溫CO2培養(yǎng)箱（Thermal Scientific），倒置顯微鏡（型號：CKX41，日本OLYMPUS），熒光/化學(xué)發(fā)光成像分析儀（型號：ImageQuant LAS-4010，GE 公司），Synergy H4 多功能酶標(biāo)儀（型號：Synergy H4，Bio Tek公司），流式細(xì)胞分析儀（型號：FACSCantoII，BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2、人胚腎細(xì)胞系293A 由本實驗室保存。使用含10%FBS 及2 mM L-谷氨酰胺的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及病毒包裝 包裝腺病毒所使用的穿梭質(zhì)粒為pAd-AFP-anti-PD-1-CXCL10，合成anti-PD-1 單鏈抗體及CXCL10 堿基序列。將穿梭質(zhì)粒與pAdEasy-1 骨架質(zhì)粒正確重組后，根據(jù)Adeasy 腺病毒包裝手冊說明于293A 細(xì)胞中包裝腺病毒。轉(zhuǎn)染10～14 d 后出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，反復(fù)凍融病毒上清三次收集為第一代病毒。繼續(xù)傳兩代收集第三代病毒，于-80 ℃保存。

1.2.3 Western blot 檢測目的蛋白表達 取對數(shù)生長期的HepG2 及MCF-7 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105/ml，接種于六孔板，待細(xì)胞沉于孔板底部后，按100 MOI 的感染復(fù)數(shù)分別加入腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10或?qū)φ詹《続d-track，48 h 后采用Western Blot 方法檢測蛋白表達。

1.2.4 ELISA 檢測分泌蛋白的表達 根據(jù)CXCL10 ELISA 檢測試劑盒（eBioscience）檢測病毒感染后細(xì)胞上清，具體操作如下：取50 μl Standards 或樣品加入酶標(biāo)板中（每個樣品設(shè)置復(fù)孔）。于所有復(fù)孔中分別加入50 μl 酶標(biāo)抗體，室溫封閉孵育30 min。260 μl Wash Solution 洗板4 次。每孔加入100 L TMB 底物液，室溫孵育10～15 min。每孔中加入50 μl 終止液以終止酶反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定450 nm 處吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中CXCL10 的濃度。

1.2.5 檢測活化T 細(xì)胞CD8 陽性群體中CXCR3 陽性率 取外周血單個核細(xì)胞（PBMC），調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml，加入終濃度為0.5 μg/ml 的anti-CD3 及anti-CD28 抗體。于0、3、6 和9 d 收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測CD8 陽性細(xì)胞CXCR3 表達水平。

1.2.6 檢測共培養(yǎng)后HepG2 細(xì)胞PD-L1 陽性率 取對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，待細(xì)胞沉于板底部，以不同比例（2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1）加入活化后的T 細(xì)胞，72 h 后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測HepG2 細(xì)胞表面PD-L1 表達水平。

1.2.7 Transwell 檢測CXCL10 對T 細(xì)胞的趨化作用 取感染病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 后的HepG2 培養(yǎng)上清600 μl，并使用CXCL10 因子作為陽性對照（終濃度為10 ng/ml）。將Transwell 小室放入孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)平衡1 h。期間，收集anti-CD3、anti-CD28抗體激活后的T 細(xì)胞1×106個置于上室。3 h 后，吸取300 μl 下室細(xì)胞，加入50 μl 計數(shù)Beads（123 count eBioscience），充分混勻后流式檢測Beads 所占比例，并計算下室細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 對BALB/c 裸鼠HepG2 移植瘤生長抑制作用 選用BALB/c 裸鼠（雌性，5～6 周齡，體重16～18 g）建立人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞系移植瘤模型。接種前1 d，以300 cGy/只的劑量進行γ 射線照射。收集對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞，于小鼠右前肢根部背側(cè)皮下接種，每只接種200 μl HepG2細(xì)胞懸液（5×106/只）。待腫瘤生長至100～200 mm3時進行實驗。每周兩次瘤內(nèi)注射濃縮后的腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10，并經(jīng)尾靜脈注射活化后的T細(xì)胞（5×106/只）。隔日記錄腫瘤長寬，并計算體積。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒表達載體的構(gòu)建及蛋白的表達 如圖1 A所示，構(gòu)建腺病毒表達載體，經(jīng)測序驗證其正確性。Western blot 結(jié)果顯示，感染腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10（DOUBLE）后，HepG2 中anti-PD-1，CXCL10均能正確表達。而MCF-7 細(xì)胞由于缺乏AFP 啟動子活性不能表達目的蛋白（圖1 B）。目的條帶與相應(yīng)內(nèi)參灰度值之比見圖1 C。ELISA 結(jié)果表明HepG2 培養(yǎng)上清中分泌的CXCL10 濃度約為（1.35±0.33）ng/ml（圖1 D）。

2.2 CXCR3/CXCL10、PD-1/PD-L 通路在效靶細(xì)胞相互作用過程中激活 經(jīng)anti-CD3、anti-CD8 抗體活化后CD 8 陽性T 細(xì)胞CXCR3 表達逐漸上調(diào)（圖2 A），CXCL10 可通過與其受體結(jié)合募集活化T 細(xì)胞。HepG2與活化后T 細(xì)胞相互作用可使其PD-L1 表達上調(diào)，并且PD-L1 陽性比例隨效靶比例增加而進一步升高，20∶1 時可達71.1%（圖2 B）。過往的研究中已經(jīng)證實T細(xì)胞激活后其PD-1 表達水平上調(diào)［7］，故PD-1/PD-L1通路可在效靶細(xì)胞相互作用過程中激活。

圖1 腺病毒表達載體的構(gòu)建及蛋白的表達

圖2 CXCR3/CXCL10、PD-1/PD-L 通路在效靶細(xì)胞相互作用過程中激活

2.3 CXCL10 對活化T 細(xì)胞趨化作用 本研究采用Transwell 的方法在體外檢測活化后的T 細(xì)胞的趨化性，使用流式細(xì)胞術(shù)對遷移到下室的細(xì)胞進行計數(shù)。結(jié)果顯示，Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 組與陽性對照組（加入CXCL10 因子）不存在明顯差異，而對T 細(xì)胞趨化效果明顯強于對照組（Adtrack 感染組）（圖3）。說明由感染病毒后的HepG2 細(xì)胞分泌的CXCL10 可有效募集活化T 細(xì)胞。

圖3 CXCL10 可趨化活化T 細(xì)胞

2.4 腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 對BALB/c裸鼠HepG2 皮下移植瘤生長的抑制作用 濃縮腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10，50 μl/只瘤內(nèi)給藥治療，并以PBS 作為對照組，同時經(jīng)尾靜脈給予活化的T細(xì)胞。HepG2 細(xì)胞移植瘤裸鼠接受治療后，每3 d 測量一次腫瘤體積，動態(tài)觀察腫瘤的生長狀況。結(jié)果顯示，盡管與PBS 組相比不具有顯著差異，腺病毒Ad-AFPanti-PD-1-CXCL10 可一定程度減慢HepG2 腫瘤的生長，抑制率約為28.66 %，欠佳的治療效果可能與病毒用量及注射的T 細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。見圖4。

圖4 腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 對HepG2 皮下移植瘤的治療作用

3 討論

本研究聯(lián)合PD-1 抗體與趨化因子治療肝細(xì)胞癌，探討了相關(guān)理論基礎(chǔ)，證明了聯(lián)合用藥機制上的可行性，并對體內(nèi)抑瘤效果進行了初步評價。結(jié)果表明，以腺病毒為載體，受甲胎蛋白基因（alpha-fetoprotein，AFP）啟動子操控的目的蛋白可在肝癌細(xì)胞HepG2 中特異表達，而不表達于MCF-7 乳腺癌細(xì)胞。HepG2 分泌的CXCL10 可以有效趨化激活的T 細(xì)胞。初步體內(nèi)試驗表明該實驗方案可以延緩腫瘤的生長速度。

PD-1/PD-L1 抗體是免疫治療的新手段，但有相當(dāng)部分患者對其不響應(yīng)。目前開發(fā)多種形式的聯(lián)合治療方案，提高PD-1 抗體的治療效果是研究熱點。PD-1/PD-L1 抗體是以調(diào)動T 細(xì)胞活性為基礎(chǔ)的抗腫瘤方法，研究表明腫瘤部位淋巴細(xì)胞的浸潤，是影響其治療效果的重要因素。筆者推測使腫瘤局部高表達恰當(dāng)?shù)内吇蜃邮窃黾恿馨图?xì)胞浸潤的有效方式［6］。CXCL10/CXCR3 是CD8 陽性T 細(xì)胞遷移的信號軸，可募集激活狀態(tài)的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞。本研究中，筆者于體外證明了T 細(xì)胞激活后CXCR3 表達上調(diào)，并可被感染腺病毒的HepG2 分泌的CXCL10 有效募集。

在基因轉(zhuǎn)移載體的選擇上，腺病毒載體是目前在腫瘤治療的臨床試驗中應(yīng)用最多的載體，因其具有：宿主范圍廣，無致癌性，易于純化和濃縮，載體容量大等優(yōu)點。迄今，已知人腺病毒至少擁有近50 種血清型，大多數(shù)腺病毒載體都是基于血清型2 和血清型5。重組人Ad5 型腺病毒是我國唯一上市的病毒療法，已批準(zhǔn)用于腫瘤的輔助治療，將其作為新冠病毒疫苗的臨床試驗也在開展當(dāng)中。因此，在腫瘤的基因治療中，目前應(yīng)用較多的腺病毒載體仍是首選。

在體內(nèi)實驗中，可分泌PD-1 抗體及CXCL10 趨化因子的腺病毒并未產(chǎn)生預(yù)期的抑瘤效果。筆者推測有兩方面原因，一是瘤內(nèi)注射的給藥方式限制了病毒的使用量，經(jīng)多次預(yù)實驗表明50 μl 為瘤內(nèi)注射劑量的上限，病毒劑量的不足可直接導(dǎo)致治療蛋白的分泌量不足。二是本實驗采用免疫缺陷鼠，并單獨給予活化的T 細(xì)胞，推測T 細(xì)胞能夠在趨化因子的作用下向腫瘤組織聚集，同時PD-1 抗體能夠阻斷免疫抑制信號，增強T 細(xì)胞的殺傷作用。但單獨給予的異種來源T 細(xì)胞與經(jīng)過抗原提呈細(xì)胞活化的T 細(xì)胞有本質(zhì)區(qū)別，不具備識別腫瘤抗原的能力，因而僅具有非特異殺傷作用。在后續(xù)實驗中筆者將采用人源化小鼠來解決腫瘤細(xì)胞異種移植帶來的免疫微環(huán)境缺失的問題。總之，本研究以腺病毒為載體，聯(lián)合PD-1 抗體和趨化因子，為腫瘤免疫治療提供了新的思路。