江文濤，彭立影，馬加軍，張 超，趙春花

（廣州金水動物保健品有限公司，廣州 510545）

蝦青素（Astaxanthin，3, 3’-二羥基-4, 4’-二酮-β,β’-胡蘿卜素）是一種具有抗氧化、抗癌、增強(qiáng)免疫力等功能的類胡蘿卜素[1]，在食品、養(yǎng)殖行業(yè)及化妝品、醫(yī)療保健領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[2]。目前，蝦青素主要采用化學(xué)合成法、動植物提取法和微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，生物源蝦青素具有利用率高、活性高等優(yōu)點[3]。

紅法夫酵母發(fā)酵法生產(chǎn)蝦青素具有生長速度快、發(fā)酵周期短等優(yōu)點，但也存在蝦青素代謝產(chǎn)量低的缺陷[4-7]，國內(nèi)有較多科研人員致力于提高紅法夫酵母菌蝦青素產(chǎn)量的研究，一般通過優(yōu)化培養(yǎng)基的配方、誘變選育高產(chǎn)菌株等方式提高蝦青素的產(chǎn)量。本試驗以紅法夫酵母菌Yea.pr-17為研究對象，以常規(guī)的酵母發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照，優(yōu)化出更適宜紅法夫酵母產(chǎn)蝦青素的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，以期提高蝦青素產(chǎn)量，為蝦青素規(guī)模化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株

紅法夫酵母Yea.Pr-17，自主篩選保存。

1.2 培養(yǎng)基

種子活化培養(yǎng)基：采用YM培養(yǎng)基，500 mL三角瓶中裝入YM培養(yǎng)基100 mL，115 ℃滅菌30 min，備用。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：采用YM培養(yǎng)基，500 mL三角瓶中裝入YM培養(yǎng)基100 mL，115 ℃滅菌30 min，備用。

固體劃線培養(yǎng)基：采用YM固體培養(yǎng)基，瓊脂量為1.6%。

1.3 儀器

紫外可見光光度計（型號為752G），上海奇立科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；微量臺式高速離心機(jī)（型號為TG16-W），湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號為HH-4），常州澳華儀器有限公司產(chǎn)品；pH計（型號為PHS-3C），上海悅豐儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

2 方 法

2.1 培養(yǎng)

2.1.1 種子培養(yǎng)

取紅法夫酵母菌種劃線于固體劃線培養(yǎng)基，置于（20±1）℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)2 d。挑取活化的單菌落2～3 環(huán)接種于裝有100 mL 種子活化培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，（20±1）℃、180 r·min-1培養(yǎng)2 d。

2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)

將活化好的菌種按照5.0%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于（20±1）℃搖床200 r·min-1振蕩培養(yǎng)6 d，測定蝦青素產(chǎn)量。

2.2 指標(biāo)測定

菌液濃度測定采用紫外可見光分光光度法；pH值用PHS-3C型pH計測定；蝦青素含量按照《飼料添加劑10%蝦青素》（GB/T 23745—2009）中的方法進(jìn)行測定；殘?zhí)遣捎肈NS法測定。

2.3 試驗內(nèi)容

2.3.1 培養(yǎng)基的選擇

根據(jù)酵母菌的營養(yǎng)特性設(shè)計14 組培養(yǎng)基，見表1，將活化好的菌種按照5.0%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于（20±1）℃搖床180 r·min-1振蕩培養(yǎng)6 d，測定蝦青素產(chǎn)量。

表1 培養(yǎng)基配方

2.3.2 接種量對紅法夫酵母發(fā)酵產(chǎn)蝦青素的影響

以優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，按1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%接種量接種紅法夫酵母，于（20±1）℃搖床180 r·min-1振蕩培養(yǎng)6 d，測定其菌液OD660值和蝦青素含量。

2.3.3 發(fā)酵時間對紅法夫酵母發(fā)酵產(chǎn)蝦青素的影響

以優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，于（20±1）℃搖床180 r·min-1振蕩培養(yǎng) 7 d，測定其菌液 OD660值和蝦青素含量。

2.3.4 補(bǔ)充不同碳源對紅法夫酵母發(fā)酵產(chǎn)蝦青素的影響

以優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在48 h 時分別補(bǔ)料10.0 g·L-1的葡萄糖、蔗糖和乳糖，（20±1）℃搖床180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，測定其菌液OD660值和蝦青素含量。

2.3.5 補(bǔ)充不同氮源對紅法夫酵母發(fā)酵產(chǎn)蝦青素的影響

以優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在48 h 時分別補(bǔ)料1.0 g·L-1的蛋白胨、酵母浸粉和硫酸銨，于（20±1）℃搖床180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，測定其菌液OD660值和蝦青素含量。

2.3.6 不同促進(jìn)劑對紅法夫酵母發(fā)酵產(chǎn)蝦青素的影響

以優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在48 h 時分別添加5.0 g·L-1的番茄紅、淀粉及碳酸鈣等促進(jìn)劑，于（20±1）℃搖床180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，測定其菌液OD660值和蝦青素含量。

2.3.7 補(bǔ)料方式對紅法夫酵母發(fā)酵產(chǎn)蝦青素的影響

以優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)定4種葡萄糖補(bǔ)料方式，A 組：培養(yǎng) 24 h、38 h、48 h、62 h 分別流加500 g·L-1葡萄糖3 mL、2 mL、2 mL、2 mL；B組：培養(yǎng)24 h、38 h、48 h、62 h分別流加500 g·L-1葡萄糖2 mL、2 mL、2 mL、2 mL；C組：培養(yǎng)24 h、38 h、48 h、62 h 分別流加500 g·L-1葡萄糖 1 mL、1 mL、2 mL、2 mL；以未添加葡萄糖為空白組。按4%接種量接種紅法夫酵母，于（20±1）℃搖床180 r·min-1n振蕩培養(yǎng)，于24 h、48 h、60 h、84 h、108 h、132 h、204 h、240 h 測定其菌液OD660值和蝦青素含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 培養(yǎng)基的選擇

14 種不同培養(yǎng)基對紅法夫酵母產(chǎn)蝦青素的影響結(jié)果見圖1。

由圖1可知，培養(yǎng)基2、3和7組蝦青素產(chǎn)量均高于42.0 mg·L-1。其中培養(yǎng)基3配方成本低，且蝦青素產(chǎn)量最高。因此，選擇培養(yǎng)基3為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗。

圖1 不同培養(yǎng)基對紅法夫酵母蝦青素產(chǎn)量的影響

3.2 接種量對紅法夫酵母發(fā)酵的影響

接種量對紅法夫酵母生長及蝦青素產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 接種量對紅法夫酵母生長的影響

圖3 接種量對蝦青素產(chǎn)量的影響

由圖2 可知，發(fā)酵前3 d 紅法夫酵母生物量皆顯著增加，菌體大量增殖，3～4 d 趨于穩(wěn)定，菌株繁殖速率減緩。由圖3 可知，前2 d 蝦青素產(chǎn)量較少，3～5 d蝦青素大量累積。最終接種量為4.0%時蝦青素產(chǎn)量最大達(dá)48.85 mg·L-1。

3.3 發(fā)酵時間對紅法夫酵母發(fā)酵的影響

發(fā)酵時間對紅法夫酵母生長及蝦青素產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對紅法夫酵母生長及蝦青素產(chǎn)量的影響

由圖4 可知，發(fā)酵前期0～2 d 時菌體迅速增加，第3 天后菌體不再明顯增長；還原糖在第2 天時降低至3.0 g·L-1，在第3 天時基本被利用完。蝦青素含量隨著發(fā)酵的時間延長隨之增加。在第2天時蝦青素迅速增加，3～6 d 處于累積時間，第6 天時蝦青素含量趨于穩(wěn)定。

3.4 補(bǔ)充不同碳源對紅法夫酵母發(fā)酵的影響

補(bǔ)充不同碳源對紅法夫酵母生長及蝦青素產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖5和圖6。

圖5 補(bǔ)充碳源對紅法夫酵母生長的影響

由圖5 和圖6 可知，在發(fā)酵48 h 時，補(bǔ)充10.0 g·L-1的葡萄糖、蔗糖及乳糖，對紅法夫酵母生長及產(chǎn)蝦青素具有不同的影響。48 h前，三組紅法夫酵母的生物量急劇增加；60 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。葡萄糖組紅法夫酵母生物量較高，生長較好；乳糖組較差。132 h 時，葡萄糖組別紅法夫酵母蝦青素產(chǎn)量高于蔗糖組及乳糖組12%；132 h 后，三組蝦青素產(chǎn)量差異不明顯。從菌體的生長及蝦青素的產(chǎn)量考慮，補(bǔ)料時以葡萄糖為碳源，可促進(jìn)紅法夫酵母的生長及蝦青素的合成。

圖6 補(bǔ)充碳源對紅法夫酵母蝦青素產(chǎn)量的影響

3.5 補(bǔ)充不同氮源對紅法夫酵母發(fā)酵的影響

由補(bǔ)充不同氮源對紅法夫酵母生長及蝦青素產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖7和圖8。

圖7 補(bǔ)充氮源對紅法夫酵母生長的影響

圖8 補(bǔ)充氮源對紅法夫酵母蝦青素產(chǎn)量的影響

由圖7和圖8可知，在發(fā)酵48 h后添加1.0 g·L-1的酵母粉、蛋白胨及硫酸銨，對紅法夫酵母生物量及蝦青素的合成影響顯著。酵母粉及蛋白胨皆為有機(jī)氮源，更有利于細(xì)胞的生長及蝦青素的合成。84～132 h時，蛋白胨組蝦青素含量高于酵母粉及硫酸銨組；204 h 時，相比蛋白胨組和硫酸銨組，酵母粉組紅法夫酵母的蝦青素產(chǎn)量提高39%～65%。

3.6 不同促進(jìn)劑對紅法夫酵母發(fā)酵的影響

不同促進(jìn)劑對紅法夫酵母生長及蝦青素產(chǎn)量影響結(jié)果見圖9和圖10。

圖10 不同促進(jìn)劑對紅法夫酵母蝦青素產(chǎn)量的影響

由圖9 和圖10 可知，淀粉和番茄紅的添加對紅法夫酵母的生長沒有促進(jìn)作用，碳酸鈣的添加對紅法夫酵母的生長具有促進(jìn)作用。發(fā)酵132 h前，碳酸鈣的添加可顯著提高紅法夫酵母蝦青素產(chǎn)量，發(fā)酵204 h 時，其蝦青素含量與空白組接近。鈣離子能夠激活丙酮酸脫氫酶，且鈣離子可促使細(xì)胞線粒體內(nèi)ATP 的合成，為微生物的生長提供能量，從而促進(jìn)代謝產(chǎn)物的積累?？梢姡妓徕}的添加可加快蝦青素的合成。發(fā)酵204 h 時，淀粉及番茄紅組蝦青素產(chǎn)量顯著高于其他組別，與空白組對比分別提高了35%、20%?？紤]淀粉在發(fā)酵后期可刺激紅法夫酵母產(chǎn)蝦青素，而番茄紅是蝦青素合成的前體物質(zhì)，添加番茄紅可在發(fā)酵后期促進(jìn)蝦青素的合成。可考慮通過補(bǔ)料加入前體物質(zhì)，既能滿足產(chǎn)物合成的需要，又可避免前體物質(zhì)大量積累抑制菌體的生長，從而提高蝦青素的合成。

3.7 補(bǔ)料方式對紅法夫酵母發(fā)酵的影響

補(bǔ)料方式對紅法夫酵母生長及蝦青素產(chǎn)量影響結(jié)果見圖11和圖12。

圖11 葡萄糖補(bǔ)料方式對紅法夫酵母生長的影響

圖12 葡萄糖補(bǔ)料方式對紅法夫酵母蝦青素產(chǎn)量的影響

由圖11 和圖12 可知，隨著葡萄糖補(bǔ)料量的增加，酵母的生物量及蝦青素的含量在繼續(xù)增加；發(fā)酵132 h后，空白組蝦青素含量趨于穩(wěn)定，而補(bǔ)充葡萄糖的組別蝦青素含量還在顯著增加；204 h時A 組蝦青素含量可達(dá)到112 mg·L-1，比空白組高出120%?？梢姡咸烟堑拈g歇流加對紅法夫酵生長及蝦青素的合成具有促進(jìn)作用。

4 結(jié) 論

以紅法夫酵母Yea.Pr-17為研究對象，通過優(yōu)選基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，最終確定了葡萄糖30.0 g·L-1，酵母浸粉5.0 g·L-1，磷酸二氫鉀3.0 g·L-1，硫酸鎂3.0 g·L-1，磷酸氫二鈉 1.0 g·L-1為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。在發(fā)酵48 h 時，添加10.0 g·L-1葡萄糖碳源、1.0 g·L-1酵母粉氮源、5.0 g·L-1番茄紅及5.0 g·L-1淀粉對紅法夫酵母產(chǎn)蝦青素具有促進(jìn)作用。在無外加營養(yǎng)物質(zhì)的條件下，發(fā)酵6 d、接種量為4%可獲得較高的蝦青素產(chǎn)量。葡萄糖的間歇流加對紅法夫酵生長及蝦青素的合成具有促進(jìn)作用，比空白組提高了120%。

5 討 論

試驗過程設(shè)計有許多考慮不全面的因素，如在培養(yǎng)基優(yōu)化方面考慮問題不夠全面，后續(xù)還可在氮源、生長因子、培養(yǎng)條件等因素上綜合考慮，進(jìn)一步優(yōu)化出更加適宜紅法夫酵母菌Yea.Pr-17生長的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件，在此基礎(chǔ)上，菌株所產(chǎn)的蝦青素還有希望得到進(jìn)一步的增加。其次，在蝦青素的提取方法以及新產(chǎn)品開發(fā)和應(yīng)用上仍有較大的研究空間，后續(xù)試驗研究可以從以上方面進(jìn)行。