楊夢琪，南珊珊，王海亮，?？←?，張文舉，聶存喜

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003）

膳食纖維作為第七大營養(yǎng)素具有突出的保健功能，在人類生活中廣泛應(yīng)用。攝入一定含量的膳食纖維可以有效緩解便秘[1]、降低癌癥風(fēng)險[2]、降低膽固醇[3-4]、預(yù)防糖尿病[5]、調(diào)節(jié)脂肪代謝[6-8]、改善肥胖[9]、調(diào)控腸道健康[10-11]。因此，在動物生產(chǎn)中也可能有巨大的應(yīng)用價值。膳食纖維的生理功能與其理化性質(zhì)有關(guān)。其中，持水性是影響葡萄糖擴(kuò)散的關(guān)鍵因素[12]，對防治糖尿病有重要作用。不同的膳食纖維化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)和加工條件等均會影響其持水性、膨脹性等理化特性，而理化特性可以通過影響消化道內(nèi)容物重量，進(jìn)而影響動物攝食量，縮短腸道轉(zhuǎn)運時間（如纖維素、麥麩和木質(zhì)素）[13-14]，這可能使動物生長性能等發(fā)生改變。有調(diào)查表明[15]，膳食纖維主要通過增加日糧持水力和黏度，增強母豬的飽腹感，調(diào)節(jié)母豬腸道微生物菌群，保持母豬腸道結(jié)構(gòu)完整性?？梢?，膳食纖維的組成及其理化性質(zhì)能影響動物腸道健康，進(jìn)而影響其生長發(fā)育。膳食纖維根據(jù)其溶解性分為不可溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維，其中可溶性膳食纖維更容易被腸道消化吸收。研究表明，發(fā)酵法能有效提高飼料中的蛋白質(zhì)含量[16]，而微生物發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶和半纖維素酶[17]能有效降解植物中的多糖，菌株Neurospora crassa SD10[18]發(fā)酵麩皮產(chǎn)生的木聚糖酶能水解非淀粉多糖中的β-1,4糖苷鍵，從而提高纖維素的利用率。而利用發(fā)酵棉籽粕制備膳食纖維的研究較少。而棉花作為新疆的優(yōu)勢資源，利用棉籽粕制備膳食纖維可以使其被有效利用，且棉籽粕經(jīng)過發(fā)酵后有毒棉酚含量降低，其中的功能活性物質(zhì)含量增加[19]，本試驗以發(fā)酵棉籽粕為原料制備膳食纖維，并對其進(jìn)行工藝優(yōu)化，確定最佳提取工藝。為進(jìn)一步評定日糧添加發(fā)酵棉籽粕膳食纖維對畜禽生長性能、腸道發(fā)育等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棉籽粕、玉米、麩皮，均購自新疆泰昆飼料科技有限公司；熱帶假絲酵母ZD-3（Candida tropicalis ZD-3），由石河子大學(xué)動物營養(yǎng)實驗室提供；YPD 培養(yǎng)基，購自北京索萊寶科技有限公司；α-淀粉酶（酶活為50 U·mL-1），購自上海源葉生物科技有限公司，酶活力定義為：在溫度25 ℃、pH值6.9條件下，1 min內(nèi)液化1 mg可溶性淀粉所需要的酶量，即為1 個酶活力單位）；中性蛋白酶（酶活：100 U·mg-1，購自上海源葉生物科技有限公司，酶活力定義為：1 g 固體酶粉（或1 mL 液體酶），在40 ℃、pH 值7.5條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位）；植物油、氫氧化鈉、鹽酸、75%乙醇、95%乙醇、丙酮，均為市售。

1.2 試驗儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱（型號為GZX-9070MBE），上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品；粉碎機(jī)（型號為FZ102），上海楚定分析儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平（型號為BS224），上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋（型號為MLS3750），上海賽默生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺（型號為SWCJ-22），上海滬凈醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（型號為HPX-9162MBE），上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號為RE-52），上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；水浴鍋（型號為HH-1），常州朗越儀器制造有限公司產(chǎn)品；pH 檢測計（型號為PH818），廣東深圳市吉格機(jī)電設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗設(shè)計

本試驗首先采用單因素試驗設(shè)計，再根據(jù)單因素試驗得到的結(jié)果，用四因素三水平正交試驗進(jìn)一步優(yōu)化酶解條件。以可溶性膳食纖維（SDF）提取率作為確定最優(yōu)工藝條件的依據(jù)。提取率最高的組合即為發(fā)酵棉籽粕膳食纖維提取的最佳工藝組合。

1.4 發(fā)酵棉籽粕的制備

發(fā)酵底物按照棉籽粕∶玉米∶麩皮=90∶5∶5 的比例混合均勻，底物與水的比例為1∶0.4。發(fā)酵棉籽粕制備的具體過程參考魏蓮清等[20]的方法。

1.5 可溶性膳食纖維制備的工藝流程

取500 g 發(fā)酵棉籽粕，加入一定量0.6 mol·L-1的NaOH 溶液浸提3 h 取沉淀。沉淀經(jīng)清洗烘干粉碎。取一定量堿處理后的發(fā)酵棉籽粕沉淀，加入純化水?；靹蚝蠹尤胍欢喀?淀粉酶，一定條件下進(jìn)行酶解，95 ℃水浴加熱10 min 滅酶。冷卻至室溫后，加入中性蛋白酶，繼續(xù)在相同條件下酶解。將酶解后的樣品溶液冷卻至室溫，在8 000 r·min-1條件下離心10 min得到上清液和沉淀。上清液用4倍體積95%乙醇醇沉10 h、抽濾/離心，之后用75%乙醇和丙酮洗滌3次，烘干，最終得到SDF。

1.6 單因素試驗

經(jīng)過預(yù)試驗，選取影響可溶性膳食纖維提取率的主要因素：復(fù)合酶含量、料液比、酶解溫度/℃、酶解時間/h，進(jìn)行單因素試驗的條件優(yōu)化。各因素變化閾值見表1。

表1 單因素試驗各因素變化閾值

以SDF提取率為指標(biāo)進(jìn)行篩選，計算公式如下：

1.6.1 復(fù)合酶含量變化的單因素試驗

在料液比為1∶10、酶解溫度為45 ℃、酶解時間為2 h 的條件下，考察復(fù)合酶（α-淀粉酶和中性蛋白酶）含量為0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%時對SDF提取率的影響。

1.6.2 料液比變化的單因素試驗

在復(fù)合酶（α-淀粉酶和中性蛋白酶）含量為0.6%、酶解溫度為45 ℃、酶解時間為2 h 的條件下，考察料液比為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40時對SDF提取率的影響。

1.6.3 酶解溫度變化的單因素試驗

在復(fù)合酶（α-淀粉酶和中性蛋白酶）含量為0.6%、料液比為1∶10，酶解時間為2 h 的條件下，考察酶解溫度為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃時對SDF提取率的影響。

1.6.4 酶解時間變化的單因素試驗

在復(fù)合酶（α-淀粉酶和中性蛋白酶）含量為0.6%、料液比為1∶10，酶解溫度為45 ℃的條件下，考察酶解時間為0.5 h、10 h、1.5 h、2 h、2.5 h時對SDF提取率的影響。

1.7 正交試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取上述4個因素的適宜條件范圍，以SDF提取率為評價指標(biāo)進(jìn)行四因素三水平的正交試驗優(yōu)化，其中酶解溫度為 40～50 ℃、料液比為1∶5～1∶15、酶解時間1.5～2.5 h、復(fù)合酶含量為0.5%～0.7%。試驗因素水平設(shè)計見表2。

表2 正交試驗因素和水平設(shè)計

1.8 統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果用Excel 軟件進(jìn)行初步統(tǒng)計，數(shù)據(jù)重復(fù)3 次取平均值，用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差（ANOVA）分析求得標(biāo)準(zhǔn)差。使用Origin Pro 9.1 進(jìn)行繪圖，數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同工藝參數(shù)對SDF提取率的影響

2.1.1 復(fù)合酶含量對SDF提取率的影響

復(fù)合酶含量是影響SDF 提取率的主要因素。見圖1，當(dāng)復(fù)合酶含量為0.5%時，隨著酶含量增加SDF 提取率提高，在0.6%時達(dá)到峰值，SDF 提取率為26.13%。隨著復(fù)合酶含量繼續(xù)增加，SDF 提取率降低。當(dāng)復(fù)合酶含量為0.8%時，SDF 含量降低了約4%，隨后呈緩慢降低趨勢，說明在0.6%的酶添加量之后，復(fù)合酶含量增加并不能無限提高SDF 提取率，可以判斷0.6%為復(fù)合酶最佳添加含量。

圖1 復(fù)合酶含量對SDF提取率的影響

2.1.2 料液比對SDF提取率的影響

料液比對SDF提取率影響也較大，提取率的最大值和最小值相差在6%左右。見圖2，當(dāng)料液比小于1∶10 時，發(fā)酵棉籽粕SDF 提取率與料液比呈正相關(guān)，而料液比大于1∶10，SDF提取率呈下降趨勢。其原因可能與酶作用程度相關(guān)，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀谝欢ǔ潭葧r，酶解速率下降。在其他因素不變的前提下，料液比為1∶10 時，SDF 提取率最高，為16.91%。

圖2 料液比對SDF提取率的影響

2.1.3 酶解溫度對SDF提取率的影響

從圖3中可以看出酶解溫度顯著影響SDF提取率。在45～50 ℃范圍內(nèi)SDF提取率變化不大，其中在45 ℃時SDF 提取率最高。之后隨著溫度升高到60 ℃時，SDF 提取率降至19.64%。因此最佳反應(yīng)溫度為45 ℃，SDF提取率達(dá)25.73%。

圖3 酶解溫度對SDF提取率的影響

2.1.4 酶解時間對SDF提取率的影響

從圖4中可以看出，酶解時間對SDF提取率影響較大。反應(yīng)時間為0.5 h的提取率最低，到2 h時呈上升趨勢，其中SDF 提取率相差10%。2 h 后SDF 提取率呈下降趨勢。在反應(yīng)時間為2 h 時，SDF提取率最高，為21.36%。

圖4 酶解時間對SDF提取率的影響

2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)定了四因素三水平正交試驗，采用正交表L9（34），正交試驗極差及方差分析結(jié)果見表3。

由表3 中可以看出B 因素（料液比）的R值最大，為2.10，說明料液比單因素對SDF提取率影響最大，其次分別是酶解溫度（A）、酶解時間（C）、復(fù)合酶含量（D）。該結(jié)果與單因素試驗結(jié)果基本符合。最后得出四個因素對試驗的結(jié)果影響的主次順序為：B＞A＞C＞D，即料液比＞酶解溫度＞酶解時間＞復(fù)合酶含量。通過直觀分析法，按照各因素最優(yōu)水平，最優(yōu)組合為A2B2C3D1，即最佳工藝條件是：酶解溫度45 ℃，料液比1∶10，酶解時間2.5 h，復(fù)合酶含量0.5%，其SDF 提取率為26.53%，說明其優(yōu)化條件可靠。

表3 正交試驗結(jié)果

3 討 論

3.1 不同工藝參數(shù)對SDF提取率的影響

3.1.1 復(fù)合酶含量對SDF提取率的影響

當(dāng)復(fù)合酶含量為0.5%時，隨著復(fù)合酶含量增加SDF提取率提高，在0.6%時達(dá)到峰值，SDF提取率為26.13%。隨著復(fù)合酶含量繼續(xù)增加，SDF 提取率降低。說明在6%酶添加量之后，復(fù)合酶含量增加并不能無限提高SDF提取率，這可能與酶的競爭性抑制和酶與底物比例有關(guān)[21]。當(dāng)酶含量小于0.6%時，反應(yīng)體系酶濃度不足，水解程度不完全，但隨著復(fù)合酶含量增加，淀粉酶和蛋白酶將大分子物質(zhì)水解成單糖、多肽等小分子物質(zhì)，當(dāng)酶濃度過高時，膳食纖維結(jié)構(gòu)如α-糖苷鍵破壞，淀粉長鏈斷裂，反應(yīng)平衡被打破，導(dǎo)致提取率降低[22]。因此，酶用量達(dá)原料的0.6%時，即可達(dá)到理想的提取效果。

3.1.2 料液比對SDF提取率的影響

當(dāng)料液比小于1∶10 時，發(fā)酵棉籽粕SDF 提取率與料液比呈正相關(guān)，而料液比大于1∶10時，SDF的提取率呈下降趨勢。這與酶和底物的作用程度相關(guān)，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀谝欢ǔ潭葧r，酶解速率下降。李琦等[23]在提取韭菜根不溶性膳食纖維（IDF）時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IDF在堿液中擴(kuò)散達(dá)到平衡后，得率不再上升，隨液料比繼續(xù)增加，反而可能破壞溶出的IDF結(jié)構(gòu)。王永剛等[24]在提取紅棗膳食纖維（IDF）的單因素試驗中，當(dāng)料液比為1∶9 時酶與底物充分結(jié)合，得到最大提取率為8.42%。在本試驗中，在其他因素不變的前提下，料液比為1∶10 時，SDF 提取率最高，為16.91%。

3.1.3 酶解溫度對SDF提取率的影響

從圖3 中可以看出，在45～50 ℃范圍內(nèi)，SDF提取率變化不大，其中在45 ℃時SDF 提取率最大。之后隨著溫度的升高SDF提取率逐漸降低。說明溫度影響酶的穩(wěn)定性，且45 ℃之后，酶活性降低，其原因可能與蛋白質(zhì)變性有關(guān)。李黎等[25]在提取棗渣膳食纖維的研究中，當(dāng)酶解溫度為60 ℃時棗渣IDF得率最大，隨后下降。可能的原因是隨著溫度到一定范圍內(nèi)，蛋白分子運動劇烈，破壞了酶的二級和三級結(jié)構(gòu)鍵使酶失活。因此高溫水解使SDF得率下降，所以最佳反應(yīng)溫度為45 ℃，SDF提取率達(dá)25.73%。

3.1.4 酶解時間對SDF提取率的影響

從圖4中可以看出，酶解時間對SDF提取率影響較大。當(dāng)反應(yīng)時間為0.5 h時提取率最低，到2 h時一直呈上升趨勢，其中SDF提取率相差10%。2 h后SDF 提取率呈下降趨勢。在反應(yīng)時間為2 h 時，SDF提取率最高，為21.36%。陳嫣等[26]在提取香芋皮SDF過程中采用微波輔助法，反應(yīng)時間在12 min時提取率最高，隨后趨于平穩(wěn)，可能由于香芋皮中SDF 含量有限。在本試驗中，酶解2 h 后提取率開始下降，可能是由于底物含量達(dá)到上限，繼續(xù)酶解使產(chǎn)物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致醇沉后的沉淀變少。

3.2 正交試驗優(yōu)化對SDF提取率的影響

單因素試驗結(jié)果表明，當(dāng)酶含量為0.6%、料液比為1∶10、酶解溫度為45 ℃、酶解時間2 h 時，發(fā)酵棉籽粕中提取的SDF含量最高。而正交試驗表明：酶解溫度為45 ℃、料液比為1∶10、酶解時間為2.5 h、復(fù)合酶含量0.5%為最佳組合，提取率達(dá)26.53%，比單因素試驗中最高提取率多0.4%。劉學(xué)成[27]采用超聲波輔助酶法提取金針菇膳食纖維（DF），各因素對DF得率的影響大小依次為即超聲波功率＞蛋白酶用量＞液料比＞α-淀粉酶用量。慈竹竹葉膳食纖維[28]提取的最優(yōu)工藝為NaOH 溶液質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)10%，提取時間為17 h，溫度為42 ℃，料液比為1∶15，提取率為34.58%。

4 結(jié) 論

本試驗條件下，發(fā)酵棉籽粕可溶性膳食纖維的最佳提取工藝參數(shù)為：酶解溫度45 ℃、料液比1∶10、酶解時間2.5 h、復(fù)合酶含量0.5%，SDF 含量為26.53%。