夏 穎， 劉甜甜， 滕忠坤， 王建茗， 陳 濤， 姜 巖△

（1蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州 215123；2蘇州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇蘇州 215123）

我國(guó)每年有近120 萬(wàn)出生缺陷的新生兒，大部分的先天性心臟病病因仍無法確定，但目前認(rèn)為遺傳與環(huán)境互作為重要因素［1］。心臟發(fā)生是基因網(wǎng)絡(luò)精確互作和調(diào)控的產(chǎn)物，影響著細(xì)胞的分化，遷移，增殖和凋亡等方面生理狀態(tài)［2］。心臟作為胚胎發(fā)育過程中最先形成的器官，其發(fā)育受到繁雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò) 調(diào)控，其中Wnt（wingless-type MMTV integration site）及芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）信號(hào)通路的調(diào)節(jié)尤為重要［3-4］。抑制Wnt信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致人多能干細(xì)胞分化早期心臟發(fā)育的阻斷［5］。在AhR基因敲除模型中，小鼠顯示出心血管發(fā)育異常，同樣用AhR 外源性配體激活也會(huì)引起心血管發(fā)育毒性［6-7］。不僅如此，研究表明，2 種信號(hào)通路之間的相互作用也會(huì)對(duì)心臟發(fā)育造成影響。本文就Wnt 和AhR 信號(hào)通路單獨(dú)及兩者相互作用對(duì)心臟發(fā)育的影響進(jìn)行綜述。

1 Wnt及其生理功能簡(jiǎn)介

Wnt 蛋白是與細(xì)胞表面G 蛋白偶聯(lián)受體家族蛋白的Frizzled 受體結(jié)合的糖蛋白，參與細(xì)胞分化、增殖和遷移等重要生物學(xué)功能的調(diào)控［8］。Wnt 信號(hào)通路主要有2種：經(jīng)典Wnt通路（Wnt/β-catenin 途徑）和非經(jīng)典Wnt通路（包括Wnt/Ca2+途徑和Wnt/平面細(xì)胞極性途徑）［9］。

關(guān)于經(jīng)典Wnt 通路的研究較為深入。Wnt 與配體結(jié)合，形成卷曲蛋白-脂蛋白受體的復(fù)合物，并將Dishevelled 蛋白募集到細(xì)胞質(zhì)膜上，抑制降解復(fù)合物功能，導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)β-catenin 積累，遷移至細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活基因表達(dá)。當(dāng)缺乏Wnt 配體時(shí)，β-catenin 不斷被降解復(fù)合物磷酸化，進(jìn)而被降解，Wnt 信號(hào)被抑制［10］。Huelsken 等［11］的研究顯示，在中胚層形成的過程中，Wnt/β-catenin 信號(hào)的激活會(huì)促進(jìn)心臟分化，在心臟發(fā)育過程中必不可少，缺乏β-catenin 的小鼠中胚層發(fā)育受損。Klaus 等［12］的研究顯示，Wnt/β-catenin 信號(hào)可激活心臟前體細(xì)胞中的心臟特異基因。缺乏β-catenin 將導(dǎo)致心臟特異基因無法正常激活，Nkx2.5缺失的心肌細(xì)胞具有異常的生理狀態(tài)、非同步收縮和動(dòng)作電位改變［13］。與經(jīng)典Wnt 通路相比，關(guān)于非經(jīng)典Wnt 通路的研究相對(duì)較少，但其在心臟發(fā)育中的作用不可或缺。研究表明，Wnt11 是通過非經(jīng)典Wnt 通路介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)的［14］。Wnt11 在非洲爪蟾外植體中的過度表達(dá)誘導(dǎo)了具有收縮表型的細(xì)胞的形成。小鼠胚胎細(xì)胞中心肌細(xì)胞的終末分化與Wnt11 表達(dá)的顯著增加有關(guān)，向培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞中添加Wnt11 可導(dǎo)致跳動(dòng)細(xì)胞比例增加［15］。

2 AhR及其生理功能簡(jiǎn)介

AhR是一種多功能、由配體激活的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，是Per-Arnt-Sim 家族中一個(gè)高度保守和廣泛分布的成員，通過介導(dǎo)外源性信號(hào)或內(nèi)源性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以增強(qiáng)靶基因的表達(dá)，其靶基因包括藥物代謝的細(xì)胞色素P450 1A1（cytochrome P450 1A1，CYP1A1）、環(huán)氧合酶2、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1 等［16］。正常情況下，AhR 與熱休克蛋白90、乙型肝炎病毒X 相關(guān)蛋白2 和熱休克蛋白23 的復(fù)合物以休眠狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)AhR 與配體結(jié)合時(shí)，暴露AhR核定位信號(hào)，AhR轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，與AhR核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白形成異二聚體，與下游靶基因效應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)［17］。AhR 的配體包括外源性配體苯并芘（benzo［a］pyrene）、2，3，7，8-四氯二苯并二噁英（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）和氯化聯(lián)苯。此外，還有研究報(bào)道了多種內(nèi)源性配體，包括色氨酸代謝物，如6-甲酰吲哚［3，2-b］咔唑（6-formylindolo［3，2-b］carbazole，F(xiàn)ICZ）、酪蛋白和膳食吲哚衍生物，以及膽紅素和二十碳烯酸［18］。

AhR 除了參與內(nèi)源和外源性代謝外，在心臟發(fā)育毒性中發(fā)揮著重要作用［19］。研究表明，AhR 可調(diào)節(jié)重要的心臟發(fā)生基因的表達(dá)，通過基因敲除或在發(fā)育早期暴露激動(dòng)劑，對(duì)內(nèi)源性AhR 功能進(jìn)行干擾，均可引發(fā)心臟結(jié)構(gòu)和功能異常，導(dǎo)致胎兒心臟生理改變，包括心率增加、右心室和左心室擴(kuò)張、射血分?jǐn)?shù)減少等［20］。長(zhǎng)期流行病學(xué)研究表明多環(huán)芳烴在心肌細(xì)胞發(fā)育過程中不恰當(dāng)?shù)丶せ預(yù)hR，導(dǎo)致心臟發(fā)生室循環(huán)不良和心肌細(xì)胞增殖減少等障礙，這種形式的毒性完全依賴于AhR，并被AhR基因敲除所阻止［21］。除了環(huán)境中的污染物可以導(dǎo)致心肌發(fā)育毒性之外，臨床藥物也會(huì)有相似的副作用。高效化療藥物阿霉素（adriamycin/doxorubicin，DOX）顯著的副作用即為累積的劑量依賴性心臟毒性。心肌細(xì)胞中，DOX 代謝產(chǎn)生的活性氧通過激活caspase-3 和caspase-9 凋亡通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［22-23］。Volkova 等［24］的研究顯示，DOX 可激活心臟AhR，藥物代謝基因CYP1A1表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生抗氧化特性，AhR 的激活可對(duì)抗DOX 對(duì)心肌細(xì)胞的毒性。總之，心臟發(fā)育需要AhR信號(hào)通路的精確調(diào)控。

隨著Wnt及AhR 信號(hào)通路在心臟發(fā)育中的作用的深入研究，越來越多證據(jù)表明Wnt 與AhR 之間存在聯(lián)系，進(jìn)而共同影響心臟發(fā)育［3-4］。

3 Wnt對(duì)AhR信號(hào)通路的影響

3.1 影響效應(yīng) Braeuning［25］認(rèn)為β-catenin 可能從不同的機(jī)制對(duì)AhR 產(chǎn)生正向影響。在穩(wěn)定表達(dá)CTNNB1（β-catenin 是其編碼產(chǎn)物蛋白）的細(xì)胞中，TCDD 激活A(yù)hR報(bào)告基因表達(dá)的程度明顯更高，也說明了Wnt信號(hào)對(duì)AhR 的激活作用［26］。胚胎干細(xì)胞分化過程中持續(xù)的AhR 激活破壞了心臟中胚層個(gè)體發(fā)育過程中的信號(hào)的表達(dá)，并導(dǎo)致心肌細(xì)胞譜系收縮力的喪失［27］。而AhR 受體的過早激活會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)，進(jìn)而使心肌發(fā)育異常，導(dǎo)致先心病的發(fā)生［28-29］。

3.2 影響機(jī)制 Wnt 信號(hào)通路對(duì)AhR 的作用可以表現(xiàn)為調(diào)節(jié)其信使RNA 以及蛋白質(zhì)的表達(dá)，這通過β-catenin 與AhR 相互作用或在DNA 結(jié)合水平的干擾，在小鼠的肝細(xì)胞中充當(dāng)AhR 的協(xié)同激活劑來實(shí)現(xiàn)［30-33］。β-catenin 是通過Wnt/β-catenin 途徑介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵整合子，占有重要地位［34］。Mathew等［35］通過mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)及微陣列結(jié)果顯示，AhR對(duì)β-catenin 信號(hào)產(chǎn)生正反應(yīng)，即Wnt 信號(hào)能夠激活A(yù)hR相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)。在人胚胎腎細(xì)胞293中，AhR 的表達(dá)在β-catenin 過度表達(dá)突變體及Wnt3a 處理后顯著升高。在高表達(dá)β-catenin 的細(xì)胞中，AhR也呈高水平表達(dá)，而不表達(dá)β-catenin 的細(xì)胞其AhR水平較低［25，36］。綜上說明，Wnt 能夠調(diào)節(jié)AhR 信號(hào)通路。在我們實(shí)驗(yàn)室的斑馬魚心臟發(fā)育模型的研究顯示，Wnt 可能通過誘導(dǎo)AhR 的抑制劑AhRRb 的表達(dá)進(jìn)而抑制AhR 靶基因的表達(dá)［4］。目前，關(guān)于Wnt對(duì)AhR 影響的研究大多選用的是肝細(xì)胞模型，在心肌細(xì)胞中的研究較少，而Wnt 對(duì)AhR 的調(diào)節(jié)是否存在組織特異性還不得而知，Wnt 信號(hào)通過調(diào)控AhR進(jìn)而影響心臟發(fā)育還需要進(jìn)一步研究。

4 AhR對(duì)Wnt信號(hào)通路的影響

4.1 AhR 上調(diào)Wnt 信號(hào)通路 當(dāng)AhR 內(nèi)源性配體FICZ 和抗氧化劑鎘共同處理小鼠胚胎，CTNNB1和Nkx2.5的mRNA 表達(dá)水平明顯升高，心臟體積顯著增加［37］。在小鼠胚胎癌細(xì)胞系心肌定向分化過程中，敲減AhR會(huì)通過干擾β-catenin 的轉(zhuǎn)錄而抑制心臟發(fā)育［38］。以上研究提示，AhR 可能通過上調(diào)Wnt信號(hào)因子或調(diào)控β-catenin 的轉(zhuǎn)錄激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，但AhR 對(duì)經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路的上調(diào)機(jī)制尚不清楚。

4.2 AhR 下調(diào)Wnt 信號(hào)通路 PM2.5 有機(jī)提取物（extractable organic matter，EOM）、TCDD等AhR激活物質(zhì)暴露可導(dǎo)致心臟發(fā)育異常，與經(jīng)典Wnt 信號(hào)的下調(diào)有關(guān)［39］。Zhang 等［40］的研究顯示，PM2.5 中的EOM 通過激活A(yù)hR，抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，導(dǎo)致斑馬魚胚胎心臟畸形。TCDD 暴露激活的AhR 通過結(jié)合和促進(jìn)β-catenin 的泛素化來下調(diào)β-catenin［41］。另外，AhR 與Wnt 信號(hào)間的相互作用涉及AhR 對(duì)R-海綿蛋白（R-spondin，Rspo）水平的影響［42］。Rspo 是一種分泌因子，可通過阻止Wnt 受體降解而發(fā)揮Wnt激動(dòng)劑作用，其缺少會(huì)導(dǎo)致心臟發(fā)育過程中右心室畸形［43-44］。在斑馬魚中，TCDD 誘導(dǎo)Rspo1 再生的作用依賴于低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6（low-density lipoprotein receptor-related protein 6，LRP6），與Rspo相關(guān)的Wnt共受體［45-46］。另外，Schneider等［47］的研究提示，TCDD誘導(dǎo)的小鼠胚胎AhR信號(hào)激活下調(diào)了體內(nèi)Rspo2 和Rspo3，而Rspo2 和Rspo3 的補(bǔ)充能部分對(duì)抗TCDD的毒性作用。

5 總結(jié)與展望

AhR 和Wnt 信號(hào)通路除獨(dú)立調(diào)控心肌特異基因來影響心臟發(fā)育外，這2 種信號(hào)通路之間的相互作用業(yè)已成為心臟發(fā)育研究的另一突破口。在不同模型中，Wnt 信號(hào)不僅能夠激活A(yù)hR 相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)，也可能通過誘導(dǎo)AhR 抑制劑AhRRb 的表達(dá)而抑制AhR 靶基因的表達(dá)。AhR 對(duì)Wnt 信號(hào)通路也具有兩方面的影響，既能激活也能抑制經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路。但Wnt-AhR 相互作用的組織特異性，以及具體的調(diào)控模式均有待進(jìn)一步探索。