張哲明， 吳 艷， 卞 濤

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院呼吸與危重癥科，江蘇無(wú)錫 214000）

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾是指RNA 中腺苷的第6 位氮原子處發(fā)生的甲基化修飾。在已發(fā)現(xiàn)的RNA 修飾中，m6A 修飾被認(rèn)為是真核生物mRNA 中最常見的修飾類型。此外，這種甲基化修飾也可發(fā)生在rRNA、tRNA、miRNA、circRNA和lncRNA［1］。Dominissini 等［2］的研究顯示，m6A 修飾位點(diǎn)主要集中在終止密碼子附近和長(zhǎng)內(nèi)部外顯子上，這些位點(diǎn)存在共有序列RRm6ACH（R=G/A，H=C/U/A），并且在人類和鼠之間高度保守。由于RNA 修飾增加了RNA 結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，影響生物學(xué)過程［3］，因此了解m6A 修飾的功能和機(jī)制對(duì)于理解這種修飾在分子調(diào)控中的意義至關(guān)重要。m6A 修飾涉及翻譯、剪接、RNA 降解、RNA 穩(wěn)定性、miRNA 成熟等多種生物學(xué)過程［4］。m6A修飾通過甲基轉(zhuǎn)移酶（writers）和去甲基化酶（erasers）的共同作用實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)可逆調(diào)節(jié)，并且可以被m6A 結(jié)合蛋白（readers）選擇性地識(shí)別結(jié)合，從而發(fā)揮作用。目前，對(duì)于m6A 修飾與肺部疾病的研究還很少，其中作用仍不清楚。本文總結(jié)有關(guān)m6A修飾的研究進(jìn)展，并對(duì)m6A修飾與肺部疾病的關(guān)系進(jìn)行了闡述，為深入了解肺部疾病中與m6A 修飾相關(guān)的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供參考資料。

1 m6A修飾概述

writers、erasers 和readers 共同組成m6A 修飾的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中writers 負(fù)責(zé)催化形成m6A 修飾，erasers負(fù)責(zé)去除m6A 修飾，而readers 通過特異性識(shí)別m6A修飾的靶RNA，參與人類疾病的發(fā)生發(fā)展［5］。

1.1 m6A writers METTL3（methyltransferase-like 3）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶。Bokar 等［6］從HeLa 細(xì)胞中將METTL3 分離出來，觀察到它具有S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）結(jié)合活性。METTL3 通過與SAM 結(jié)合而獲得甲基轉(zhuǎn)移酶活性，在METTL3/METTL14 異二聚體和其他甲基轉(zhuǎn)移酶組成的多組分甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中起著核心酶的作用。METTL14 作為支持酶，主要維持復(fù)合物完整性和與底物RNA 結(jié)合，增強(qiáng)催化活性。METTL14 C末端的RGG 重復(fù)序列是RNA 底物的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于METTL3/14 的催化活性必不可少［7］。WTAP（Wilms′tumor 1-associated protein）是一種剪接調(diào)節(jié)因子，不具有催化域，對(duì)RNA 沒有獨(dú)立的催化能力，它通過與METTL3/14 相互作用，將后者定位到核散斑（nuclear speckles），從而激活甲基轉(zhuǎn)移酶催化活性［8］。此外，RBM15、KIAA1429 等調(diào)控酶通過與mRNA 結(jié)合并募集METTL3/14 復(fù)合體，將其引導(dǎo)至靶區(qū)相互作用，但具體作用機(jī)制仍不十分清楚。目前，我們所知的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中各組分的分子量相加與從HeLa 細(xì)胞中分離得到的復(fù)合物分子量并不相等，前者小于后者［9］。這表明甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中存在未知writer參與調(diào)控，需要進(jìn)一步探究。

1.2 m6A erasers 去甲基化酶FTO（fat mass- and obesity-associated protein/ALKB homolog 9，ALKBH9）和ALKBH5 的發(fā)現(xiàn)揭示了m6A 修飾是動(dòng)態(tài)可逆的，兩者屬于ALKB 相關(guān)蛋白家族。FTO 和ALKBH5 都是非血紅素Fe2+/α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）依賴的加氧酶，而Fe2+/α-KG 這一保守結(jié)構(gòu)對(duì)于去甲基化修飾是必不可少的［10］。Su等［10］對(duì)FTO功能的進(jìn)一步研究顯示，F(xiàn)TO 在細(xì)胞核中催化m6A 的去甲基化，而在胞質(zhì)中可同時(shí)介導(dǎo)m6A 和N6，2′-O-dimethyladenosine（m6Am）的去甲基化，但改變FTO 的表達(dá)水平對(duì)m6Am 修飾的RNA 的表達(dá)無(wú)明顯影響，這說明FTO 主要在細(xì)胞核中介導(dǎo)m6A 修飾的RNA 的表達(dá)而發(fā)揮作用。ALKBH5 定位在細(xì)胞核，在低氧條件下表達(dá)上調(diào)。目前發(fā)現(xiàn)ALKBH5 在動(dòng)物中表現(xiàn)出對(duì)m6A產(chǎn)生有效的去甲基化活性，這可能與ALKBH5的N 末端富含丙氨酸的序列和潛在的卷曲結(jié)構(gòu)有關(guān)［11］。目前為止，還沒有檢測(cè)到主要定位于細(xì)胞質(zhì)的m6A 去甲基化酶，對(duì)于胞質(zhì)中RNA 的m6A 修飾如何調(diào)控仍未可知，值得進(jìn)一步研究。

1.3 m6A readers readers 包括含YTH（YT521-B homology）結(jié)構(gòu)域蛋白家族、核內(nèi)不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，hnRNPs）超家族、胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA 結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins，IGF2BPs）、真核生物翻譯起始因子3（eukaryotic translation initiation factor 3，eIF3）等，是m6A 修飾發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。

YTH 結(jié)構(gòu)域是在人類剪接因子YT521-B 中被發(fā)現(xiàn)的，它在真核生物表達(dá)的100 多種蛋白中普遍存在。含YTH結(jié)構(gòu)域蛋白家族分為YTHDF（YTHDF1～3）和YTHDC（YTHDC1～2）兩個(gè)亞家族［12］。YTHDF1是一個(gè)重要的m6A 結(jié)合蛋白，其依賴eIF3 啟動(dòng)和增強(qiáng)翻譯，促進(jìn)m6A 修飾的mRNA 在5′-非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）的非帽依賴性翻譯。相反，YTHDF2 將識(shí)別的mRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)促進(jìn)其降解。具體機(jī)制為YTHDF2 通過N 末端區(qū)域與CNOT1（CCR4-NOT transcription complex subunit 1）的SH 結(jié)構(gòu)域直接相互作用，募集CCR4-NOT 復(fù)合體，從而促進(jìn)染色質(zhì)組裝因子1（chromatin assembly factor 1，CAF1）和CCR4（carbon catabolite repressor 4）的去甲基化作用。YTHDF3 在YTHDF1 促進(jìn)mRNA 翻譯和YTHDF2 促降解中都起著協(xié)同作用，從而影響RNA的代謝［4，13］。YTHDC1 定位于細(xì)胞核，通過募集剪接因子SRSF3（serine and arginine rich splicing factor 3）和抑制SRSF10 與mRNA 結(jié)合，來調(diào)節(jié)核mRNA 的選擇性剪接。YTHDC2可以選擇性地與m6A殘基結(jié)合，降低mRNA的m6A豐度，提高其翻譯效率［14］。readers對(duì)mRNA 的翻譯既有促進(jìn)也有抑制作用，這表明readers 特異性識(shí)別m6A 修飾的RNA 位點(diǎn)，但其在翻譯中的作用需要進(jìn)一步研究。

已發(fā)現(xiàn)的與m6A 修飾有關(guān)的hnRNPs 超家族蛋白有HNRNPA2B1、HNRNPC 和HNRNPG，這些蛋白并不直接識(shí)別并結(jié)合m6A修飾位點(diǎn)，而是識(shí)別因m6A修飾而改變的RNA 結(jié)構(gòu)，從而參與靶RNA 的加工、表達(dá)等過程。這種機(jī)制被稱為m6A 開關(guān)（m6Aswitch）［15］。HNRNPA2B1 是一種細(xì)胞核中的m6A 結(jié)合蛋白，它與核轉(zhuǎn)錄本結(jié)合，調(diào)控RNA 剪接，并促進(jìn)初級(jí)miRNA 的加工［15］。此外，IGF2BPs（IGF2BP1～3）是一種相對(duì)保守的m6A 結(jié)合蛋白，幾乎只在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，能增強(qiáng)mRNA 的穩(wěn)定性，提高翻譯效率。目前已在多種侵襲性癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了IGF2BPs 的異常調(diào)節(jié)［16］?？傊琺6A 結(jié)合蛋白幾乎參與了RNA 代謝的每個(gè)環(huán)節(jié)，有很大研究?jī)r(jià)值。

2 m6A與肺部疾病

越來越多的研究表明，m6A 修飾與肺部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）、肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension，PH）、肺癌、肺纖維化等。

2.1 m6A 修飾與COPD COPD 是一種常見的以持續(xù)存在的呼吸系統(tǒng)癥狀和氣流受限為特征的肺部疾病，氣流受限不完全可逆，呈進(jìn)行性發(fā)展。雖然吸煙、炎癥機(jī)制、氧化應(yīng)激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡等都與其密切相關(guān)，但確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚［17］。

研究表明，在不影響細(xì)胞活力的前提下，暴露于不同濃度的香煙煙霧等有害物質(zhì)刺激后，人肺泡上皮細(xì)胞中m6A 修飾水平均顯著下降，但線性回歸分析結(jié)果未提示有劑量效應(yīng)關(guān)系［18］。通過數(shù)據(jù)集進(jìn)一步分析細(xì)顆粒物對(duì)m6A 修飾調(diào)控因子表達(dá)的影響，研究者觀察到高暴露組METTL3、WTAP、FTO、ALKBH5 和HNRNPC 的表達(dá)均高于低暴露組，而METTL14 和KIAA1429 的表達(dá)在兩組之間無(wú)明顯差異［18］。但是，近期Huang 等［19］用小氣道上皮細(xì)胞為樣本的研究顯示，與對(duì)照組相比，COPD 組中FTO、METTL3、ZNF217、YTHDC1 和YTHDC2 表 達(dá) 下 調(diào)，IGF2BP3 表達(dá)上調(diào)。這可能意味著m6A 修飾的變化具有細(xì)胞類型特異性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)writers、erasers 和readers 之間并非孤立作用，而是存在協(xié)同性，m6A 調(diào)控因子之間的串?dāng)_可能在COPD 的發(fā)生中起重要作用。此外，m6A調(diào)控因子，特別是METTL3、FTO、YTHDC2 和IGF2BP3，還可以間接與一些COPD關(guān)鍵基因相互作用，影響這些基因的表達(dá)，從而參與細(xì)胞對(duì)外源物質(zhì)刺激的反應(yīng)、脂質(zhì)代謝等生物學(xué)過程，促進(jìn)COPD 進(jìn)展［19］。總而言之，該研究首次系統(tǒng)地證明了m6A 調(diào)控因子在COPD 中的表達(dá)和潛在功能，但其中具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

2.2 m6A 修飾與PH PH 是一種以肺動(dòng)脈壓力升高為表現(xiàn)形式的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)，其定義為海平面、平臥靜息狀態(tài)下，經(jīng)右心導(dǎo)管測(cè)量平均肺動(dòng)脈壓力（mean pulmonary artery pressure，mPAP）≥25mmHg。其中，低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是一種由肺部疾病引起的進(jìn)展性疾病，常見病因?yàn)镃OPD 和間質(zhì)性肺疾病。目前針對(duì)此類疾病尚無(wú)有效的治療方法［20］。

缺氧可導(dǎo)致m6A 修飾失調(diào)，從而促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)缺氧對(duì)m6A 修飾的影響具有細(xì)胞類型特異性［21］。既往對(duì)于circRNA 中的m6A 修飾知之甚少，但Zhou 等［21］鑒定出數(shù)千個(gè)細(xì)胞特異性表達(dá)的m6A 修飾的circRNA，擴(kuò)大了人們對(duì)m6A 修飾理解的廣度，并揭示了m6A 修飾對(duì)circRNA 的調(diào)節(jié)。Wang等［22］首次通過基因芯片分析確定了HPH 小鼠模型肺組織中circRNA 的表達(dá)圖譜。在此基礎(chǔ)上，Su等［23］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，從HPH 大鼠肺組織中分離獲取的總circRNA 的m6A修飾水平低于正常對(duì)照組；近半數(shù)circRNA 跨越一個(gè)外顯子，并且來源于單個(gè)外顯子的circRNA 中存在豐富的m6A 修飾。雖然m6A修飾上調(diào)或下調(diào)的circRNA 的親本基因在蛋白質(zhì)修飾過程中都富集，但兩者的作用途徑明顯不同。m6A修飾上調(diào)的circRNA 的親本基因主要在催產(chǎn)素信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、cGMP-PKG 信號(hào)通路及血管平滑肌收縮通路中富集，而下調(diào)的主要參與緊密連接和賴氨酸降解。與無(wú)m6A 修飾的circRNA 相比，m6A修飾的circRNA 在缺氧時(shí)有明顯減少的趨勢(shì)，這提示缺氧時(shí)m6A 可能下調(diào)circRNA 的表達(dá)［23］。circRNA具有miRNA 海綿的作用，可參與miRNA 相應(yīng)靶基因的表達(dá)［24］。為探索circRNA-miRNA 調(diào)控對(duì)PH 相關(guān)基因表達(dá)的影響，研究者通過構(gòu)建circRNA-miRNAmRNA 網(wǎng)絡(luò)，篩選了與Wnt［25］和FoxO［26］這2 條參與PH 進(jìn)展的信號(hào)通路相關(guān)的關(guān)鍵mRNA 和miRNA，經(jīng)檢測(cè)顯示circXpo6和circTmtc3變化最明顯。經(jīng)RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）-PCR 證實(shí)，在低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中，m6A 修飾的circXpo6 和circTmtc3 表達(dá)顯著下調(diào)［23］?？傊?，該研究的結(jié)果表明m6A 修飾的circRNA 與PH有關(guān)，m6A 通過影響circRNA 的穩(wěn)定性，導(dǎo)致Wnt 和FoxO 信號(hào)通路激活，最終促進(jìn)HPH 的發(fā)生發(fā)展［23］。然而，缺氧影響m6A 修飾的確切機(jī)制尚未得到證實(shí)，該研究也沒有詳細(xì)闡述m6A修飾在HPH中的作用。

2.3 m6A 修飾與肺癌 肺癌是一種由肺上皮細(xì)胞惡性增殖而形成的腫瘤。在肺癌的發(fā)生發(fā)展中，m6A修飾發(fā)揮著重要作用。m6A 相關(guān)蛋白表達(dá)的異常能導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是惡性腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力的關(guān)鍵。最近有研究表明，METTL3在香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的EMT 中起關(guān)鍵作用，它通過上調(diào)ZBTB4 mRNA 的m6A 修飾水平來誘導(dǎo)EMT 和肺癌的發(fā)生［27］。Xue 等［28］的研究啟發(fā)了我們對(duì)m6A 和lncRNA在肺癌中作用的理解：lncRNA ABHD11-AS1 在功能上可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和Warburg效應(yīng)，其異位過表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，而METTL3可以通過增強(qiáng)ABHD11-AS1的轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性，上調(diào)其表達(dá)。此外，miR-600 和miR-33a 可通過抑制METTL3的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)METTL3對(duì)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展的積極作用［29］。

去甲基化酶FTO 是肺鱗癌的一個(gè)預(yù)后因素，過表達(dá)的FTO 通過降低MZF1 mRNA 的m6A 修飾水平和穩(wěn)定性來增強(qiáng)MZF1 的表達(dá)，從而發(fā)揮致癌作用［30］。過去我們認(rèn)為ALKBH5 在非小細(xì)胞肺癌中呈異位上調(diào)，且與預(yù)后不良密切相關(guān)。但最近Jin 等［31］的研究表明，ALKBH5也可通過降低YTHDFs介導(dǎo)的YAP 表 達(dá) 和 抑 制miR-107/LATS2（large tumor suppressor kinase 2）介導(dǎo)的YAP 活性來抑制非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。綜上所述，ALKBH5 可抑制腫瘤進(jìn)展，而FTO 促進(jìn)腫瘤形成，若要具體闡明它們作用的差異，則需要進(jìn)一步研究。

Sheng 等［32］觀察到Y(jié)THDF2 在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)，它通過直接與6-磷酸葡萄糖脫氫酶3′-UTR 的m6A 修飾位點(diǎn)結(jié)合，增強(qiáng)磷酸戊糖途徑，為癌細(xì)胞增殖提供能量。與之相反，YTHDC2 在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào)，并且其低表達(dá)與腫瘤的低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和分期顯著相關(guān)，這表明YTHDC2 抑制非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展［33］。我們推測(cè)不同RNA 的m6A 修飾發(fā)生變化后，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式的差異是RNA被不同的m6A結(jié)合蛋白選擇性識(shí)別所導(dǎo)致的。而m6A 結(jié)合蛋白如何選擇性識(shí)別，具體的分子機(jī)制仍需探索。

2.4 其 他 Dai 等［34］基 于WTAP、KIAA1429、YTHDC2、FMR1和ZC3H13這5個(gè)m6A 調(diào)控因子構(gòu)建了預(yù)測(cè)兒童哮喘風(fēng)險(xiǎn)的模型，將哮喘兒童分為A 組和B 組，B 組的m6A 評(píng)分高于A 組，并且檢測(cè)到A 組患兒與輔助性T 細(xì)胞1 型的免疫相關(guān)，而B 組患兒與輔助性T 細(xì)胞2 型的免疫相關(guān)。另外，Kim 等［35］觀察到在人原代氣道上皮細(xì)胞中，F(xiàn)TO缺失會(huì)導(dǎo)致FOXJ1 mRNA 穩(wěn)定性降低，同時(shí)纖毛上皮細(xì)胞明顯減少，杯狀細(xì)胞增多；而FTO敲除的小鼠由于纖毛上皮細(xì)胞缺陷，在過敏原刺激下表現(xiàn)出強(qiáng)烈的哮喘樣表型。由此可見，m6A 調(diào)控因子在哮喘的發(fā)生中起著不可忽視的作用。

Han 等［36］在肺纖維化方面的研究顯示，碳黑處理后的大鼠肺組織中pri-miRNA-126 的m6A 修飾水平下調(diào)，阻礙了miRNA-126的成熟，進(jìn)而激活其下游靶向調(diào)控基因PI3K介導(dǎo)的PI3K/AKT/mTOR 通路，引起肺組織纖維化。

在炎癥反應(yīng)中，ALKBH5基因敲除可抑制靶細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生［37］。此外，Zhao 等［38］的研究顯示ALKBH5 還可以下調(diào)IL6mRNA 的m6A 修飾水平，抑制其核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，減輕放射性肺炎的損害。

3 m6A在肺部疾病中的潛在應(yīng)用

3.1 m6A修飾可作為肺部疾病的生物標(biāo)志物 特征性生物標(biāo)志物在疾病的預(yù)防、診斷和治療中起著至關(guān)重要的作用。上述的研究已表明，m6A異常修飾會(huì)影響肺部疾病的進(jìn)展。例如，在HPH 中，m6A 修飾的circXop6 和circTmtc3 顯著下調(diào)［23］。而circRNA 在特定的細(xì)胞類型或組織中有不同程度的富集，且不易降解，較miRNA、mRNA 等穩(wěn)定。隨著m6A 修飾檢測(cè)技術(shù)的創(chuàng)新，m6A修飾可作為一種有前景的肺部疾病診斷生物標(biāo)志物。早期檢測(cè)到circRNA m6A 修飾水平的變化可能有助于監(jiān)測(cè)和預(yù)防疾病的發(fā)生發(fā)展。

3.2 m6A修飾可作為肺部疾病的治療靶點(diǎn) 越來越多的研究表明，m6A 修飾在肺部疾病中具有重要作用，為以相關(guān)甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶、m6A結(jié)合蛋白或m6A修飾的RNA為靶點(diǎn)的創(chuàng)新治療方案提供了新見解。最近，Li 等［39］通過將一種催化失活的酶連接到ALKBH5 上，創(chuàng)造了一種融合蛋白dm6ACRISPR，它可以特異性地將靶轉(zhuǎn)錄本去甲基化。這種靶向調(diào)控m6A 修飾的融合蛋白有可能用于調(diào)節(jié)肺部疾病的基因表達(dá)和細(xì)胞功能。但目前針對(duì)m6A 修飾的治療方案仍處于初級(jí)階段，還有很多問題有待解決，如治療位點(diǎn)的選擇、治療的副作用和人類個(gè)體差異等。

4 問題與展望

m6A修飾是一個(gè)迅速發(fā)展的新興研究領(lǐng)域，盡管在調(diào)控機(jī)制和腫瘤方面的研究已有所進(jìn)展，但是m6A修飾調(diào)控基因的機(jī)制是復(fù)雜的，不同細(xì)胞中的機(jī)制也不盡相同，因此需要研究者們進(jìn)一步研究其在病理狀態(tài)下確切的變化和作用機(jī)制。目前m6A 修飾在肺部疾病中的研究較少，特別是在COPD等慢性肺疾病中的確切作用仍不清楚，因此m6A 修飾在肺部疾病相關(guān)領(lǐng)域的研究需進(jìn)一步深入，以期其能夠成為臨床評(píng)估和診治疾病的生物標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)。