王東升穆思宇王健崗謝龍飛鐘翔宇

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院膽胰外科,哈爾濱 150086)

近年來通過高通量測序技術(shù)對惡性腫瘤的表觀基因組進(jìn)行了大規(guī)模的系統(tǒng)研究,發(fā)現(xiàn)有不同程度的轉(zhuǎn)錄控制失調(diào),主要包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA 的異常表達(dá)等,與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。隨著表觀遺傳學(xué)的迅猛發(fā)展,一些未知的表觀調(diào)節(jié)子相繼被發(fā)現(xiàn)。1999 年,研究者通過雙鏈寡核苷酸探針成功分離出一種新型編碼人類 CpG 結(jié)合蛋白-CXXC 鋅指蛋白 1(CXXC finger protein-1, CFP1)的cDNA,CFP1 基因位于人染色體18q21.1 區(qū)域,全長2487 bp,轉(zhuǎn)錄生成的蛋白由656 個氨基酸序列組成,定位于細(xì)胞核中[2]。在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)CFP1 蛋白只能與未甲基化的核苷酸序列結(jié)合,通過調(diào)控 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 1(DNMT1)參與胞嘧啶甲基化[3]。CFP1 也是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Set1 的亞基,于H3 組蛋白4 號賴氨酸上進(jìn)行三甲基化(H3K4me3),使染色質(zhì)處于開放狀態(tài)促進(jìn)基因表達(dá)[4]。CFP1 在DNA 甲基化和組蛋白修飾中發(fā)揮重要作用,可能和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)CFP1 發(fā)生基因突變、異常表達(dá)和與DNMT1 結(jié)合障礙等對惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)或抑制作用。本文簡要綜述CFP1 的基本功能及在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展,以期為后續(xù)研究新的腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點提供依據(jù)。

1 CXXC1 的基本功能

1.1 CFP1 與 DNA 甲基化

DNA 甲基化是在 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)催化作用下在基因組CpG 二核苷酸的胞嘧啶5 號碳原子上共價結(jié)合一個甲基基團(tuán),能引起 DNA 構(gòu)象、DNA 穩(wěn)定性及 DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變,從而調(diào)控基因表達(dá)[5]。DNA 甲 基 轉(zhuǎn) 移 酶 主 要 包 括 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b,DNMT3a 和 DNMT3b 完成 DNA初始甲基化,DNMT1 維持DNA 的甲基化狀態(tài)[6]。此外,研究發(fā)現(xiàn)DNMT1 在DNA 初始甲基化中同樣發(fā)揮重要作用[7]。在許多哺乳動物細(xì)胞基因組中存在大量散在的甲基化的CpG 二核苷酸,而在某些區(qū)域,如基因的啟動子處存在高度聚集的CpG 二核苷酸,它們被稱為CpG 島(CpG islands, CGIs),大約72%的人類基因啟動子位于CGIs,它們的甲基化水平很低[8]?；騿幼訁^(qū)域CGIs 的甲基化與基因沉默密切相關(guān),甲基化的DNA 可以招募甲基結(jié)合蛋白(methyl-binding domain proteins, MBDs)抑制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。而在腫瘤細(xì)胞中CGIs 往往呈高甲基化狀態(tài),這種高甲基化狀態(tài)是導(dǎo)致抑癌基因失活的一個重要機制[9]。

CFP1 通過調(diào)控DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)參與胞嘧啶甲基化,Butler 等[10]研究發(fā)現(xiàn)缺乏CFP1 的小鼠胚胎干細(xì)胞(ES)整體基因組70%的胞嘧啶甲基化下降,并伴隨著多聚核糖體水平降低, 導(dǎo)致翻譯起始降低。盡管DNMT1 轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,但DNMT1蛋白合成減少。通過脈沖/chase 分析結(jié)果顯示在CFP1 缺失的小鼠胚胎干細(xì)胞(ES)中DNMT1 蛋白半衰期也有一定程度的降低?；谝陨辖Y(jié)果,Tate等[11]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)缺乏CFP1 的胚胎干細(xì)胞參與DNA 堿基切除修復(fù)的核酸內(nèi)切酶(Apyrimidinic endonuclease/Redox factor-1, Ape1/Ref-1)蛋白表達(dá)下降,DNA 損傷增加。這些結(jié)果揭示了Cfp1 在翻譯起始及DNA 損傷修復(fù)中的作用,表明CFP1 缺失會導(dǎo)致基因組胞嘧啶甲基化水平下降、DNMT1 蛋白合成和半衰期降低及DNA 損傷增加。

1.2 CFP1 與組蛋白修飾

組蛋白與DNA 共同組成核小體,是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位,組蛋白氨基末端(N 端)結(jié)構(gòu)域伸出核小體同其他調(diào)節(jié)蛋白和DNA 發(fā)生相互作用。其N端尾區(qū)可進(jìn)行乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、蘇素化、ADP 核糖基化等修飾,可改變?nèi)旧|(zhì)的狀態(tài)及調(diào)控基因的表達(dá),進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。

組蛋白甲基化修飾相關(guān)蛋白主要包含組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTs) 和組蛋白去甲基轉(zhuǎn)移酶(HDMTs)。組蛋白甲基化對基因表達(dá)的影響較為復(fù)雜,主要取決于被修飾的氨基酸位點,而甲基化程度又分為三個水平,分別為一甲基化、二甲基化、和三甲基化(me1/me2/me3)即分別在同一個氨基酸位點添加一個甲基、兩個甲基和三個甲基[13]。某些被沉默的抑癌基因啟動子區(qū)域均可發(fā)現(xiàn)H3K4me2/3 修飾的缺失以及 H3K9me2/3、H3K27me3 修飾的獲得[14]。大多數(shù)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶都通過Set 結(jié)構(gòu)域來發(fā)揮主要功能,CFP1 作為組蛋白H3K4 甲基轉(zhuǎn)移酶Set1 的組成單位與未甲基化的CpG 島結(jié)合定位H3K4me3 到染色質(zhì)上,從而調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu),促進(jìn)基因表達(dá)[3]。

Yu 等[15]研究發(fā)現(xiàn)在卵母細(xì)胞中CFP1 修飾的H3K4me3 與基因啟動子相關(guān),并在發(fā)育過程中使啟動子激活并轉(zhuǎn)錄。Sha 等[16]研究發(fā)現(xiàn)在成熟卵母細(xì)胞中CFP1 是H3K4me3 積累和沉積在染色質(zhì)上所必要的蛋白,缺乏CFP1 將導(dǎo)致H3K4me3 降低,進(jìn)一步導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性下降、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂障礙、受精后無法完全成熟?；谝陨辖Y(jié)果,Sha等[17]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞缺失CFP1,直接破壞了基因表達(dá)模式,間接破壞了促黃體激素的作用和損害了促卵泡激素對顆粒細(xì)胞的基本信號通路,導(dǎo)致卵泡生長和排卵均受到影響。以上研究表明CFP1 對H3K4me3 的修飾對卵母細(xì)胞增值、減數(shù)分裂、基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要。

2 CXXC1 在惡性腫瘤中的研究

2.1 CFP1 與胃癌

胃癌是一個全球性的健康問題,是癌癥相關(guān)死亡的第三大主要原因,越來越多的研究表明胃癌的表觀遺傳異常可以促進(jìn)癌變發(fā)生[18]。Sun 等[19]對84 例胃癌患者進(jìn)行了研究,通過免疫組化方法檢測胃癌組織中CFP1 與14-3-3 蛋白表達(dá)水平,并進(jìn)行相關(guān)性分析。14-3-3 蛋白在哺乳動物中存在7 個亞型(α/β,γ,ε,ζ,η,σ 和 θ/τ),由不同的基因編碼,可參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞遷移、分化、凋亡等過程[20]。14-3-3σ 編碼基因的甲基化會導(dǎo)致14-3-3σ 蛋白在腫瘤細(xì)胞中持續(xù)低表達(dá),會對P53 產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控作用,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增值[21]。研究發(fā)現(xiàn),在同一視野中CFP1 的表達(dá)量與14-3-3 蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),CFP1 呈高表達(dá)的患者總體生存時間小于呈低表達(dá)的患者,而14-3-3 蛋白對患者生存時間的影響則與CFP1 相反。Mai 等[22]研究發(fā)現(xiàn) CFP1 與 14-3-3 蛋白之間的相互作用與核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)蛋白有關(guān),在B 細(xì)胞中14-3-3 蛋白的表達(dá)依賴于 NF-κB 蛋白在 14-3-3 基因啟動子區(qū)募集CFP1 蛋白,CFP1 是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Set1 的指南針,使啟動子特異性地富集了H3K4me3,使染色質(zhì)處于開放狀態(tài),標(biāo)志轉(zhuǎn)錄激活。因此可以推測CFP1與14-3-3 蛋白通過NF-κB 蛋白可能會影響胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移及侵襲能力等,但仍需進(jìn)一步實驗證明。CFP1 可能會成為胃癌患者新的分子標(biāo)志物及潛在的治療靶點。

2.2 CFP1 與結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer, CRC)是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一,由于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞一系列遺傳和表觀遺傳改變的逐步積累,導(dǎo)致結(jié)直腸腺瘤和侵襲性腺癌的發(fā)生[23]。

相關(guān)研究報道,在60%～70%的大腸癌細(xì)胞中18q 染色體缺失,表明該區(qū)域可能含有與大腸癌發(fā)生有關(guān)的抑癌基因(TSGs)[24]。盡管18q 染色體缺失常影響染色體臂的大部分,但結(jié)腸癌基因(DCC)缺失的18q21 染色體最小區(qū)域已被確定,在同一4mb 染色體區(qū)域內(nèi)還存在甲基 CpG 結(jié)合蛋白1(MBD1)、甲基 CpG 結(jié)合蛋白 2(MBD2)、CpG 結(jié)合蛋白(CFP1)、sma 和 mad 相關(guān)蛋白 4(SMAD4)。為了探究該區(qū)域是否存在抑癌基因,Derks 等[25]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中只有DCC基因啟動子被高甲基化,導(dǎo)致表達(dá)沉默,而其它臨近基因MBD1、MBD2、CFP1、SMAD4 不受影響。此外,Bader 等[26]研究表明CFP1 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中突變率很低,常被認(rèn)為是與結(jié)腸癌發(fā)生無關(guān)的突變。綜上研究表明CFP1基因可能不是結(jié)直腸癌中潛在的抑癌基因,CFP1基因突變在結(jié)直腸癌中的作用有限。

2.3 CFP1 與肺癌

在全球范圍內(nèi),肺癌是最常見的惡性腫瘤,據(jù)報道表觀遺傳改變在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,DNA 甲基化、組蛋白修飾和RNA 表達(dá)在肺癌的早期發(fā)現(xiàn)、評估預(yù)后和治療中具有重要意義[27]。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs, lnc RNA)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[28]。Tao 等[29]研究發(fā)現(xiàn)在肺癌中 lnc RNA P53RRA 表達(dá)下調(diào),P53RRA 可以與RNA 結(jié)合蛋白(G3BP)結(jié)合,取代G3BP 復(fù)合物中的P53,導(dǎo)致P53 更多的保留在細(xì)胞核中,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤進(jìn)展,發(fā)揮抑癌作用。Mao 等[30]通過對比肺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞發(fā)現(xiàn),CFP1 在癌細(xì)胞中與未甲基化的CpG 島結(jié)合力降低,導(dǎo)致癌細(xì)胞 P53RRA 蛋白轉(zhuǎn)錄起始位點H3K4me3 降低、H3K27me3 顯著升高,抑制 P53RRA蛋白表達(dá)。在肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)CFP1 過表達(dá)會增加P53RRA 的表達(dá)水平,發(fā)揮抑癌作用。

有研究表明肺泡巨噬細(xì)胞在肺癌早期起識別并清除腫瘤細(xì)胞的作用,隨著腫瘤發(fā)展又在腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移、侵襲過程中發(fā)揮重要作用[31]。Hui等[32]研究發(fā)現(xiàn)CFP1 缺失會導(dǎo)致粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的受體亞基Csf2rα 基因啟動子區(qū)H3K4 的修飾減少,導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌活性降低。小鼠缺乏CFP1 容易受到細(xì)菌感染,在小鼠肺組織表現(xiàn)出自發(fā)的炎癥癥狀,包括炎癥細(xì)胞的侵潤和表面活性磷脂蛋白的積累。恢復(fù)Csf2rα 的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)肺泡巨噬細(xì)胞活性。肺癌發(fā)生發(fā)展過程中存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制,適度的刺激CFP1 蛋白的表達(dá)可能是治療肺癌的潛在靶點,但尚需進(jìn)一步研究證實。

2.4 CFP1 與膠質(zhì)瘤

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性惡性腦瘤,以治療耐藥而聞名。在過去的十年中,表觀調(diào)控基因的突變被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤發(fā)生的關(guān)鍵驅(qū)動因素。在成人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中,啟動子甲基化導(dǎo)致的DNA 修復(fù)基因MGMT表觀遺傳沉默可以預(yù)測烷基化劑治療的療效。這些表觀遺傳改變被用作生物標(biāo)記,并在膠質(zhì)瘤的分類和治療決定中發(fā)揮核心作用[33]。

Bronner 等[34]研究發(fā)現(xiàn) CFP1 對 DNA 甲基化修飾是通過與DNMT1 相互作用實現(xiàn)的,抑制CFP1 表達(dá)后 DNMT1 活性明顯降低,而 DNMT3a、DNMT3b活性無明顯變化。DNA 甲基化是基因組的一個生物學(xué)過程,DNMT 水平升高而引起啟動子和其他調(diào)控區(qū)域的局部高甲基化,從而使腫瘤抑制基因沉默,因此有研究者提出DNMT 抑制劑是表觀遺傳藥物開發(fā)的潛在靶點,可能為膠質(zhì)瘤治療耐藥患者提供新的治療方案[35]。

有研究表明DNMT1 可能與癌基因或抑癌基因的沉默有關(guān),DNMT 抑制劑的最初目的是促進(jìn)被DNA 高甲基化的抑癌基因重新激活,而不促進(jìn)其它癌基因的激活,因此理想的DNMT 抑制劑需要靶向特定的 DNMT 復(fù)合物[36]。Cheray 等[37]實驗表明DNMT1/USP7、DNMT1/Cfp1、DNMT1/Stat3 復(fù)合物在腦、乳腺和肺腫瘤中表達(dá)明顯增加。通過將U251細(xì)胞皮下注射到小鼠體內(nèi),然后使用替莫唑胺(TMZ)和針對三種復(fù)合物的抑制劑治療,結(jié)果表明,TMZ 和DNMT1/CFP1 抑制劑治療組,TMZ 抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞的死亡百分比明顯增加,腫瘤生長效率明顯降低。異種移植建立體內(nèi)膠質(zhì)瘤模型實驗表明特異性抑制DNMT1/CFP1 復(fù)合物同樣增加了膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡的百分比,具有提高抗腫瘤療效的作用。說明抑制CFP1 與DNMT1 的相互作用可提高化療藥物TMZ 的效果,但具體機制還有待于研究。

2.5 CFP1 與 MLL 白血病

混合譜系白血病(mixed lineage leukemia.MLL)是一類惡性程度高、預(yù)后差的難治性急性白血病,因此急需開發(fā)特定的靶向治療。MLL基因由急性白血病的染色體異位產(chǎn)生,編碼產(chǎn)生白血病的MLL融合蛋白。研究發(fā)現(xiàn)Hoxa9 基因的表達(dá)對急性白血病的發(fā)生有促進(jìn)作用,而MLL 融合蛋白的結(jié)構(gòu)域中含有與DNA 結(jié)合的CXXC 結(jié)構(gòu)域,能夠與未甲基化的DNA 結(jié)合,使Hoxa9 基因位點的CpG 殘基和組蛋白 H3K9 不發(fā)生甲基化,促進(jìn)Hoxa9 基因的表達(dá)[38-39]。

Risner 等[40]尋找是否存在類似的MLL CXXC結(jié)構(gòu)域,進(jìn)行替換,以期尋找新的治療靶點,研究者選擇了 DNMT1、MBD1、CFP1 三種蛋白中的 CXXC結(jié)構(gòu)域,用以替換MLL 融合蛋白的CXXC 結(jié)構(gòu)域。首先比較與未甲基化DNA 結(jié)合的親和力,結(jié)果:MLL CXXC 結(jié)構(gòu)域與未甲基化的DNA 親和力最強,CFP1 CXXC 結(jié)構(gòu)域與未甲基化的DNA 親和力比MLL CXXC 結(jié)構(gòu)域低 7 倍。DNMT1 CXXC 結(jié)構(gòu)域比 MLL CXXC 結(jié)構(gòu)域低 34.4 倍,而 MBD1 CXXC 結(jié)構(gòu)域與未甲基化的DNA 無親和力。在骨髓集落復(fù)制實驗和體內(nèi)白血病實驗表明只有DNMT1CXXC結(jié)構(gòu)域能夠功能性替代 MLL CXXC 結(jié)構(gòu)域,使Hoxa9 基因位點的CpG 殘基和組蛋白H3K9 不發(fā)生甲基化。雖然初步研究表明MLL 白血病中CFP1 CXXC 結(jié)構(gòu)域不能功能性代替MLL CXXC 結(jié)構(gòu)域,但是能否通過CFP1 調(diào)控DNMT1 用于治療白血病仍值得進(jìn)一步探索。

Young 等[41]研究發(fā)現(xiàn),人類 PLB-985 細(xì)胞(人急性髓系白血病細(xì)胞)的正常增值分化需要CFP1蛋白。敲除CFP1 基因?qū)е录?xì)胞存活率降低約50%,倍增時間延長,并且不能向單核細(xì)胞及粒細(xì)胞分化。由此可見CFP1 蛋白是PLB-985 細(xì)胞生存、增殖、分化的必要蛋白,能否通過調(diào)控CFP1 基因的表達(dá)來治療白血病值得進(jìn)一步研究探索。

3 小結(jié)及展望

綜上研究表明,CFP1 主要調(diào)控 DNMT1 和H3K4me3 以外,還存在其它調(diào)節(jié)通路,參與表觀遺傳修飾,與多種惡性腫瘤的發(fā)生、治療及不良預(yù)后密切相關(guān),但其復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制研究以及大樣本隊列研究加速其在臨床中的應(yīng)用仍處于初級階段,亟待進(jìn)一步的探索研究。隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展,CFP1 在臨床方面的研究會越來越深入,期望CFP1在惡性腫瘤診斷、治療及預(yù)后中成為新的突破點。