金 燕，劉開揚(yáng)

溶瘤病毒療法是治療癌癥希望的新選擇。2015年10月，安進(jìn)公司(Amgen)經(jīng)過基因改造的HSV-1(T-VEC)被美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)批準(zhǔn)用于黑色素瘤的治療，這是首個FDA批準(zhǔn)的溶瘤病毒[1]。新城疫病毒是眾多溶瘤病毒中的一種，具有很長的臨床應(yīng)用歷史，與來自正在開發(fā)用于癌癥治療的不同病毒家族的重組溶瘤病毒之間有很大的相似性，大多是針對實(shí)體腫瘤的治療。然而，針對腫瘤治療的最佳治療效果和特異性不明確，最終限制了惡性腫瘤的成功治療。在過去的幾十年中，溶酶體的分子調(diào)控研究迅速發(fā)展。自噬-溶酶體途徑與癌癥的標(biāo)志密切相關(guān)，例如逃避細(xì)胞死亡途徑、逃避免疫監(jiān)視和降低新陳代謝[2]。因此，靶向NDV抗腫瘤細(xì)胞過程中的溶酶體具有巨大的治療潛力，因?yàn)樗粌H會觸發(fā)凋亡和溶酶體細(xì)胞死亡途徑，而且會抑制細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬。此外，溶酶體通過在酸性環(huán)境中隔離癌癥藥物而在癌癥抗藥性中發(fā)揮重要作用，導(dǎo)致藥物作用減弱[3]。溶酶體可以被認(rèn)為是癌細(xì)胞的致命弱點(diǎn)，因此，在NDV抗腫瘤過程中聯(lián)合靶向溶酶體可以提高抗腫瘤的治療效果。

1 溶酶體的結(jié)構(gòu)與功能

溶酶體是一種單層囊狀細(xì)胞器，目前的資料顯示，對于溶酶體的命名方式根據(jù)其功能和形成過程的不同，有一種新的提法，即前溶酶體和溶酶體。溶酶體的功能為主要負(fù)責(zé)降解各種生物大分子及衰老損傷的細(xì)胞器，還參與病原體防御作用、細(xì)胞凋亡與自噬和腫瘤的發(fā)生發(fā)展等多種生物過程[4]。溶酶體與腫瘤之間的聯(lián)系非常密切，通常認(rèn)為的觀點(diǎn)有：①在細(xì)胞膜受損的情況下，核膜暴露被溶酶體溶解，導(dǎo)致細(xì)胞突變；②腫瘤細(xì)胞大量增殖需要的某些營養(yǎng)物質(zhì)可由溶酶體降解大分子物質(zhì)產(chǎn)生；③許多致癌物質(zhì)可以導(dǎo)致細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)機(jī)制受損，其機(jī)制可能與溶酶體釋放的水解酶有關(guān)系。溶酶體內(nèi)含60多種酸性水解酶，包括組織蛋白酶、核糖/脫氧核糖核酸酶、酸性磷酸酶、糖苷酶、脂肪酶、硫酸脂酶等。在眾多水解酶中，組織蛋白酶與腫瘤之間的關(guān)系最為重要，并且被廣泛研究，根據(jù)蛋白水解的機(jī)制不同可分為：半胱氨酸組織蛋白酶(大部分的組織蛋白酶均為此酶)、天冬氨酸組織蛋白酶(包括cathepsin D、E)和絲氨酸組織蛋白酶(包括cathepsin A、G)。各種水解酶主要在酸性環(huán)境(pH4.5)中活躍，為了保護(hù)其他細(xì)胞間室免受酶的消化，這些水解酶由空泡型H+ATPases(V-ATPases)、溶酶體相關(guān)膜蛋白1和2(lamp1，lamp2)、溶酶體整體膜蛋白2(limp2)和CD63等溶酶體膜蛋白滯留在囊泡內(nèi)[5]。

2 依賴溶酶體途徑的凋亡

細(xì)胞凋亡是進(jìn)化高度保守的生理機(jī)制，參與消除感染、受損、衰老或不必要的細(xì)胞，在發(fā)育和控制機(jī)體內(nèi)環(huán)境平穩(wěn)等方面具有重要意義[6]。FAS/FASL-FADD-Caspase途徑是外源性途徑的代表途徑。同源三聚體FasL與三分子Fas結(jié)合并使其相互交聯(lián)，通過Fas上的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(death effect domain，DED)募集Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(fas-associated death domain，F(xiàn)ADD/MORT1)，并與凋亡啟始蛋白Procaspase-8結(jié)合形成所謂的死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(death inducing signaling complex， DISC)，Procaspase-8進(jìn)而活化為Caspase-8，激活下游Caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白[7]。內(nèi)源性途徑(線粒體途徑)主要受B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤蛋白-2(B-cell CLL/lymphoma 2, Bcl-2)家族調(diào)控，此家族是一個擁有著25種Bcl-2家族同源蛋白的家族，Bax、Bad和Bid等屬于促凋亡成員；Bcl-2、Bcl-X和Bcl-W屬于抑制細(xì)胞凋亡的成員。內(nèi)源性途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制與在各種刺激因子的作用下導(dǎo)致線粒體受損而最后發(fā)生線粒體外膜通透(mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP)有著密切聯(lián)系，caspase8、caspase10 和端粒酶B等可以對底物 Bid直接切割產(chǎn)生tBid，誘導(dǎo)效應(yīng)蛋白Bax和Bak在線粒體膜上聚集形成孔道，導(dǎo)致MOMP的發(fā)生[8]。MOMP發(fā)生后，細(xì)胞色素-C(cytochrome C，cyt-C)和Smac(second mitochondria-derived activator of caspases，Smac)從線粒體膜間隙釋放到胞質(zhì)中。cyt-C的釋放是激活凋亡的重要角色，在dATP的存在下cyt-C通過與凋亡相關(guān)因子1(apaf1)結(jié)合形成多聚體，然后通過Caspase募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain，CARD)與procaspase9結(jié)合而形成凋亡小體。凋亡小體上的procaspase9進(jìn)行切割活化，促使caspase3大量活化進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[9]。

Wu等[10]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞結(jié)合的cardosin A整合素可內(nèi)化到溶酶體，觸發(fā)溶酶體膜通透性增加，并且觸發(fā)細(xì)胞凋亡級聯(lián)開始，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。此外，Li等[11]研究使用克羅米芬檸檬酸鹽處理宮頸癌細(xì)胞hale可誘導(dǎo)cathepsin B和cathepsin D從溶酶體內(nèi)釋放到胞漿中，進(jìn)而抑制細(xì)胞活力并引起細(xì)胞凋亡。這種由于主要由溶酶體膜滲透(lysosomal membrane permeabilization, LMP)引起的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡被稱為 “溶酶體途徑的凋亡”[12-13]?；钚匝跷镔|(zhì)(ROS)、鞘氨醇、Bcl-2家族等經(jīng)典的刺激均可觸發(fā)溶酶體膜通透性增加，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[14-15]。除上述，LMP也可由其他刺激物誘導(dǎo)，包括細(xì)胞骨架破壞和溶酶體膜中鞘磷脂增加；抑制V型H+ATPase可削弱溶酶體的酸化進(jìn)而導(dǎo)致溶酶體的失穩(wěn)；在誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡時，Bax構(gòu)象發(fā)生改變后可實(shí)現(xiàn)從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至溶酶體膜上，誘導(dǎo)溶酶體膜發(fā)生通透[16]。

凋亡發(fā)生時，溶酶體膜通透在其中有著不容忽視的作用，尤其是在凋亡發(fā)生的起始時期。LMP的后果和隨后細(xì)胞以何種模式死亡與溶酶體損傷的情況關(guān)系密切。一般認(rèn)為強(qiáng)度較低的細(xì)胞應(yīng)激引發(fā)的溶酶體內(nèi)容物釋放的劑量有限，誘導(dǎo)凋亡或凋亡樣細(xì)胞死亡的發(fā)生；而在高強(qiáng)度的應(yīng)激刺激下，溶酶體膜高程度的損傷和其內(nèi)部酸性蛋白酶的大量釋放導(dǎo)致細(xì)胞不受控的損害和死亡[17]。在溶酶體膜通透發(fā)生一定程度后，釋放各種酸性蛋白酶到胞質(zhì)中，通過對下游信號分子的剪切處理可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中cathepsins是含量相對豐富及作用比較重要的一類酶。cathepsins B、D、H和L等可對Bid/Bim進(jìn)行水解剪切，剪切后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至線粒體膜上，激活效應(yīng)蛋白Bax/Bak。溶酶體發(fā)生LMP后除了釋放組織蛋白酶，糜蛋白酶和磷脂酶類也會釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[18]。

3 溶酶體參與細(xì)胞自噬

自噬廣泛地參與機(jī)體生長、發(fā)育、衰老和分化，組織器官的代謝調(diào)控，凋亡小體的清除等多種過程。起始、延伸、閉合和降解4個步驟是組成自噬過程的關(guān)鍵部分，簡單說就是先合成并組裝完成吞噬小泡，吞噬小泡在吞噬了異物之后變成了自噬體，然后裝載了“貨物”的自噬體與溶酶體融合，此時溶酶體內(nèi)的水解酶便可以將“貨物”降解。這種降解的過程需要消耗大量溶酶體，而腫瘤細(xì)胞為了維持自噬通量，需要通過溶酶體生物合成(lysosomal biogenesis)及溶酶體重塑(autophagic lysosomal reformation, ALR)等途徑保障溶酶體的供給，維持溶酶體和自噬體的動態(tài)平衡，保證自噬的進(jìn)行[19]。溶酶體(包括其水解酶、膜蛋白和 V-ATPase等復(fù)合體)大部分是由TFEB-coordinated lysosomal expression and regulation(CLEAR)基因網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控合成的，因此TFEB對于調(diào)控自噬進(jìn)程中溶酶體的穩(wěn)態(tài)十分重要[20]。TFEB是basic helix-loop-helix leucine zipper(bHLH-Zip)轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，作為核轉(zhuǎn)錄因子，TFEB只有轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核并與CLEAR原件結(jié)合才能啟動整個基因網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)錄[21]。TFEB在細(xì)胞內(nèi)的活性與定位主要取決于它的2個絲氨酸殘基Ser142和Ser211的磷酸化的狀態(tài)，當(dāng)Ser142和Ser211均被磷酸化時，TFEB處于失活狀態(tài)并且定位于胞漿，當(dāng)Ser142和Ser211被去磷酸化時，TFEB被激活并轉(zhuǎn)位入核，啟動溶酶體的生物合成[22]。除了調(diào)控溶酶體的生物合成之外，TFEB入核后可以起始許多自噬相關(guān)基因(autophagy related gene，Atg)的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控自噬的發(fā)生[23]。

mTOR通路對溶酶體穩(wěn)態(tài)及自噬的調(diào)節(jié)其實(shí)也是對生長與代謝之間的調(diào)節(jié)，在調(diào)節(jié)過程中，不僅有營養(yǎng)因素，還有能量的因素。mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)作為一個“明星”因子，主要由mTOR、Raptor (regulatory protein associated with mTOR)和mLST8(mammalian lethal with Sec13 protein 8)等原件組成[24]。普遍認(rèn)為mTORC1處于活化狀態(tài)的前提是定位在溶酶體上，當(dāng)活化mTORC1時，除了可以通過抑制ULK1 復(fù)合體進(jìn)而抑制自噬的發(fā)生，還可以使TFEB的絲氨酸殘基Ser142和Ser211磷酸化，抑制其轉(zhuǎn)位入核，進(jìn)而抑制溶酶體生物合成和自噬[25]；當(dāng)細(xì)胞受到饑餓等刺激或在mTORC1抑制劑(如Torin1、pp242)處理時，mTORC1從溶酶體膜分離，解除對ULK1及自噬的抑制，并且引起TFEB的Ser142和Ser211去磷酸化，TFEB轉(zhuǎn)位入核，誘導(dǎo)TFEB下游靶基因轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)溶酶體的數(shù)量及功能[26]。因此，自噬體形成及溶酶體的生物合成在調(diào)控自噬溶酶體形成方面起到了重要作用。

4 溶酶體在NDV誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與自噬中的作用

新城疫病毒是一種具有高度傳染性的禽類病原體，屬于副粘病毒科(paramyxoviridae)副粘病毒屬(avulavirus genus)，最早被發(fā)現(xiàn)于英國新城，因此得名。NDV粒子的直徑大約為100～400 nm，其外層的包膜是由宿主細(xì)胞磷脂雙分子層脂膜和病毒糖蛋白組成的雙層膜結(jié)構(gòu)[27]。NDV基因組為單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA分子[ssRNA(-)]，主要編碼大分子RNA聚合酶蛋白(large protein，L)，是RNA依賴性RNA聚合酶；核衣殼蛋白(nucleocapsid protein， NP)是核衣殼的主要組成成分；磷酸化蛋白(phosphoprotein，P)、基質(zhì)蛋白(matrix protein，M)主要參與RNA的合成以及病毒的組裝過程；血凝素—神經(jīng)氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase protein，HN)可以與細(xì)胞上的唾液酸受體結(jié)合，促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞；融合蛋白(fusion protein，F(xiàn))主要參與病毒的穿入與細(xì)胞融合等過程[28]。根據(jù)禽類受感染后的致死程度，NDV毒株被分為3種致病型：速發(fā)型(高毒性)、中性毒性和低毒性(低毒力或無毒性)[29]。F蛋白裂解位點(diǎn)的不同是毒力強(qiáng)弱的主要決定因素：速發(fā)型和中胚層菌株的F切割位點(diǎn)具有多堿基氨基酸基序(112R/G/KR-Q/K-K/R-R↓F117)，可以被普遍存在的Furin-like蛋白酶識別和切割。相反，輕型菌株具有單堿基氨基酸(112GR/K-Q-G-R↓F117)，它們的復(fù)制周期僅限于特定組織[30]。

4.1NDV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 NDV感染導(dǎo)致線粒體損傷及膜電位喪失，發(fā)生MOMP、Cyt-c釋放和caspase 9活化的聯(lián)級反應(yīng)，這是內(nèi)源性凋亡途徑的3個基本要素。在NDV感染腫瘤細(xì)胞過程中，病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)會誘導(dǎo)細(xì)胞分泌Bcl-2家族蛋白，對于改變線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)起到非常重要的作用[31]。Molouki等[32]發(fā)現(xiàn)NDVAF2240毒株的M蛋白通過其BH3結(jié)構(gòu)域與Bax相互作用，促進(jìn)了Bax從細(xì)胞質(zhì)到線粒體膜的轉(zhuǎn)位，從而導(dǎo)致內(nèi)源性凋亡途徑的激活。隨后在HT29、Hela和HCT116細(xì)胞中感染NDVAF2240毒株后被證實(shí)了具有同樣的效果[33]。Bax可通過自身BH3結(jié)構(gòu)域與該家族其他蛋白相互結(jié)合，而NDV的M蛋白含有與Bax相互作用的BH3結(jié)構(gòu)域，因此在沒有Bax的情況下，M蛋白能激活其他促凋亡成員[34]。Bax敲除細(xì)胞在感染病毒后死亡，可以發(fā)現(xiàn)NDV也能夠與除Bax之外的凋亡蛋白相互作用，并檢測到細(xì)胞色素c釋放到胞質(zhì)中，證明線粒體途徑細(xì)胞凋亡可以通過直接或間接影響線粒體表面蛋白質(zhì)的一些其他相互作用被激活，從而形成釋放線粒體因子的孔道[32]。

4.2溶酶體參與調(diào)控NDV誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡 靶向腫瘤中的溶酶體將有巨大的治療潛力，因?yàn)樗梢杂|發(fā)細(xì)胞凋亡和溶酶體細(xì)胞死亡途徑，也可抑制癌細(xì)胞通過自噬進(jìn)行自我保護(hù)[35]。此外，溶酶體可通過其酸性環(huán)境隔離抗癌藥物，導(dǎo)致藥物作用的鈍化，在癌癥耐藥性中發(fā)揮重要作用[36]。Song等[37]研究發(fā)現(xiàn)將大鼠腎小管上皮細(xì)胞暴露于鉛中可以誘導(dǎo)溶酶體膜通透化，導(dǎo)致組織蛋白酶B和D釋放誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，然后使用CA 074和Pep A抑制組織蛋白酶B和D的活性，發(fā)現(xiàn)凋亡現(xiàn)象有所減輕。這提示除了經(jīng)典的死亡途徑，還有可能存在其它形式的死亡通道，而由溶酶體介導(dǎo)的死亡通道就是其中之一。當(dāng)某些凋亡因子刺激腫瘤細(xì)胞時，可增強(qiáng)溶酶體膜通透性和釋放各種酸性水解酶進(jìn)入細(xì)胞漿，然后誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。組織蛋白酶的泄露除了可誘導(dǎo)非caspase依賴型程序性細(xì)胞死亡，還可以觸發(fā)細(xì)胞線粒體途徑凋亡。Granato等[38]研究發(fā)現(xiàn)2-苯乙炔磺酰胺(PES)可通過使溶酶體膜穩(wěn)定性降低而阻礙70kD熱休克蛋白(HSP70)的作用，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中各種酸性水解酶的釋放，觸發(fā)線粒體途徑凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡并抑制腫瘤生長。德國科學(xué)家使用NDV LaSota毒株感染胃癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)NDV可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)并與細(xì)胞表面受體結(jié)合形成復(fù)合物，腫瘤細(xì)胞中的溶酶體可攝取此復(fù)合物，然后導(dǎo)致溶酶體穩(wěn)定性降低發(fā)生LMP，釋放出各種蛋白水解酶，造成細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂，誘導(dǎo)細(xì)胞溶解死亡[39]。

4.3NDV感染誘導(dǎo)自噬利于NDV的復(fù)制 近年來許多研究都集中在自噬病毒感染中有何作用。在NDV感染的癌細(xì)胞中觀可以察到過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER)，通過PERK /eIF2α，IRE1 / JNK和ATF6/CHOP觸發(fā)自噬。研究顯示NDV的P和NP蛋白的異位表達(dá)可通過上調(diào)ER應(yīng)激標(biāo)記蛋白GRP78和GRP94改變了ER穩(wěn)態(tài)[40]。Meng等[41]研究發(fā)現(xiàn)，NDV Beaudette C毒株感染人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞時表現(xiàn)出完整的自噬通量，LC3-II在早期增加并且持續(xù)存在，p62則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。NDV La Sota株在感染人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞后依然表現(xiàn)出完整的自噬通量[42]。他們進(jìn)一步報道，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/ Beclin-1途徑在NDV誘導(dǎo)自噬中促進(jìn)了LC3的轉(zhuǎn)化和p62的降解，并促進(jìn)病毒的復(fù)制[41]。盡管自噬是一種細(xì)胞防御機(jī)制，但某些病毒已經(jīng)進(jìn)化出使用自噬小泡進(jìn)行自身復(fù)制的策略。例如，NDV感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的過程中，將自噬相基因Atg5和Beclin-1用RNAi分別干擾分沉默后，病毒復(fù)制能力明顯下降[41]。Sun等[43]利用禽源細(xì)胞DF-1和CEF作為細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)新城疫病毒感染引發(fā)LC3-II增加，而p62減少，證實(shí)了細(xì)胞中發(fā)生了完全自噬。通過自噬阻斷劑(渥曼青霉素和氯喹)藥物處理抑制自噬可減少細(xì)胞中NDV的復(fù)制，再通過干擾自噬相關(guān)基因Bclin1以及敲除Atg5可能抑制NDV的復(fù)制，進(jìn)一步說明自噬對NDV在細(xì)胞中復(fù)制的重要性。

4.4自噬可通過清除受損線粒體抑制凋亡 為了闡明自噬如何調(diào)節(jié)凋亡，Meng等[44]研究發(fā)現(xiàn)使用NDV LaSota株感染A549細(xì)胞后，受損的線粒體被溶酶體小泡包裹后與溶酶體融合，通過自噬清除，從而導(dǎo)致cyt-C釋放減少及抑制caspase的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡。自噬中負(fù)責(zé)調(diào)控自噬體形成的核心分子Beclin-1存在BH3結(jié)合域，能與多種Bcl-2 抗凋亡家族蛋白結(jié)合，如Bcl-2、Bcl-xL/Bcl-2L1以及Mcl-1，這種與抗凋亡家族蛋白的結(jié)合可能會對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接的促凋亡及抗自噬效應(yīng)[45]。但是當(dāng)藥物作用于腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)自噬水平增高后，可能會導(dǎo)致Beclin-1-Bcl-2復(fù)合體或Beclin-1-Bcl-xL復(fù)合體解離，從而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生促自噬及抗凋亡的效應(yīng)[46]。進(jìn)一步提示自噬的激活可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力增強(qiáng)，有利于病毒復(fù)制和延長細(xì)胞存活。由于其抗凋亡作用，NDV和自噬抑制劑的組合已成為一種增強(qiáng)病毒抗腫瘤潛力的新策略。

5 小 結(jié)

綜上，NDV在對抗腫瘤細(xì)胞的過程中，一方面會促進(jìn)溶酶體生物合成并且啟動線粒體自噬-溶酶體途徑，進(jìn)而構(gòu)成線粒體—溶酶體交互作用，對NDV感染誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡有抵抗作用；另一方面能夠引起細(xì)胞中的溶酶體膜發(fā)生LMP，使其內(nèi)部的組織蛋白酶和水解酶釋放入胞漿，進(jìn)而破壞感染細(xì)胞應(yīng)對NDV建立的線粒體—溶酶體交互作用，提高腫瘤細(xì)胞對NDV感染的敏感性。此外，釋放的組織蛋白酶和水解酶對線粒體進(jìn)一步損傷，降低線粒體膜電勢，進(jìn)而導(dǎo)致MOMP及后續(xù)線粒體凋亡發(fā)生。因此，了解溶酶體在NDV誘導(dǎo)凋亡和自噬的作用，可以提高NDV治療各種癌癥的治療潛力，為今后攻克腫瘤提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突：無