吳 爽，強(qiáng) 榮，張瑞雪，華 偉

(1.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710000；2.西北婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳科，陜西 西安 710061)

新生兒疾病篩查(newborn screening，NBS)是一項(xiàng)成功的公共衛(wèi)生項(xiàng)目，是指在新生兒期對(duì)嚴(yán)重危害新生兒健康的先天性、遺傳性疾病施行專項(xiàng)檢查，在出現(xiàn)癥狀之前提供早期診斷和治療，從而改善臨床結(jié)果[1]。1963年，Guthrie和Susi[2]首次報(bào)道了細(xì)菌抑制試驗(yàn)篩查苯丙 酮尿癥(phenylketonuria，PKU)，開啟了新生兒篩查的序幕。隨之，酶活性測(cè)定半乳糖血癥、放射性免疫法篩查先天性甲狀腺功能減低癥(congenital hypothyroidism，CH)均獲得成功，至此以PKU和CH為主的NBS在歐美發(fā)達(dá)地區(qū)迅速開展。到20世紀(jì)90年代，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)使NBS發(fā)生了革命性的轉(zhuǎn)變，它可以通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)篩查多種疾病，大大擴(kuò)展了篩查病種[3]。如今，NBS已在國(guó)際上廣泛推廣，是國(guó)際公認(rèn)的降低新生兒疾病發(fā)病率及死亡率的重要措施。

目前，NBS篩查方法主要包括質(zhì)譜技術(shù)、免疫學(xué)方法、酶學(xué)、高壓液相色譜及電泳等。通過(guò)檢測(cè)生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)新生兒體內(nèi)異常的代謝改變，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)疾病的早期診斷。除CH外，現(xiàn)階段的NBS篩查病種均屬于遺傳性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，活產(chǎn)新生兒中不同種類遺傳性疾病占3%～5%[4]，使這些患兒面臨早期死亡或致殘。某些疾病，如PKU，早期干預(yù)可明顯改善預(yù)后，因而盡快明確診斷尤為重要。但是目前篩查技術(shù)存在篩查病種有限，漏檢，并可能存在假陰性及假陽(yáng)性等缺點(diǎn)，還不能完全滿足臨床需求。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA測(cè)序技術(shù)為NBS開辟了新的途徑。高通量測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)也稱下一代測(cè)序技術(shù)，相較于傳統(tǒng)的一代測(cè)序技術(shù)，它以成本低、通量高、速度快的特點(diǎn)在優(yōu)生遺傳領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，其主要包括：遺傳病的診斷、攜帶者篩查、植入前遺傳學(xué)檢測(cè)、臨床用藥指導(dǎo)等。NGS按照測(cè)序覆蓋范圍大小大致分為：全基因組測(cè)序、全外顯子組測(cè)序、靶向目標(biāo)基因測(cè)序。該技術(shù)通過(guò)一次性檢測(cè)數(shù)百至數(shù)千種基因變異，實(shí)現(xiàn)在分子水平對(duì)遺傳性疾病的精準(zhǔn)診療。在新生兒領(lǐng)域，NGS技術(shù)已作為新生兒遺傳性疾病確診的重要依據(jù)。近年來(lái)，該技術(shù)在NBS方面的應(yīng)用處于探索中，現(xiàn)對(duì)NGS在NBS方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1高通量測(cè)序技術(shù)作為二級(jí)NBS手段的應(yīng)用

目前大部分NBS的模式是將NGS作為二級(jí)篩查手段，即對(duì)生化篩查陽(yáng)性患兒或疑似患兒進(jìn)行測(cè)序，以明確診斷、治療指導(dǎo)和預(yù)后評(píng)估[5]。該種篩查模式在一些疾病中運(yùn)用較為成熟，如遺傳代謝病(inherited metabolic disorders，IMD)、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病、囊性纖維化等。以IMD為例，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)目前在新生兒IMD的篩查中已得到廣泛應(yīng)用，它可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)1個(gè)樣本進(jìn)行幾十種代謝產(chǎn)物的分析，具有高靈敏性和特異性及快速、成本低的優(yōu)勢(shì)。由于IMD沒有特定的臨床表現(xiàn)，且質(zhì)譜檢測(cè)病種有限，同時(shí)涉及多個(gè)指標(biāo)和比率，臨床較難判斷。如甲基丙二酸血癥和丙酸血癥質(zhì)譜指標(biāo)均為C3及C3/C2。更有許多IMD存在亞型，并且不同亞型治療方案均有不同。因此，對(duì)質(zhì)譜后出現(xiàn)可疑陽(yáng)性結(jié)果的患兒進(jìn)行準(zhǔn)確診斷非常重要，NGS能夠同時(shí)對(duì)多種基因進(jìn)行突變分析，成為現(xiàn)階段遺傳代謝病診斷的重要手段。有研究對(duì)1 033例質(zhì)譜陽(yáng)性患兒進(jìn)行NGS，共診斷出各類遺傳代謝病194例，NGS均確定了疾病類型。鑒定出23種IMD，包括10種氨基酸代謝異常(43.5%)、8種有機(jī)酸缺陷病和5種脂肪酸氧化缺陷病[6]。另外，串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果反映的是體內(nèi)代謝物的異常，會(huì)受到嬰兒出生時(shí)的孕周、輸血情況、年齡等混雜因素的限制，NGS可以在分子層面提供明確診斷，以彌補(bǔ)質(zhì)譜技術(shù)的不足[7]。由于質(zhì)譜技術(shù)容易受環(huán)境因素的影響，無(wú)法區(qū)分受影響的患者及雜合攜帶狀態(tài)。有研究表明，NGS在解釋NBS中代謝物濃度異常方面很有價(jià)值，它可以區(qū)分此種情況，并可減少診斷的時(shí)間[8]。

但迄今為止，與質(zhì)譜技術(shù)的方法相比，基因檢測(cè)較質(zhì)譜技術(shù)費(fèi)用高，檢測(cè)周期長(zhǎng)，并且會(huì)帶來(lái)龐大的數(shù)據(jù)分析和難以解讀臨床意義的不明變異，會(huì)給臨床實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)很大的挑戰(zhàn)。有研究對(duì)102例疑似IMD患兒進(jìn)行了NGS，當(dāng)生化實(shí)驗(yàn)提示某種單基因病或特定的IMD時(shí)，NGS可以確診59%(39/66)的患兒，而當(dāng)懷疑IMD但無(wú)臨床表型及生化特異性時(shí)，只有8%(3/36)的患兒通過(guò)NGS得到了診斷[9]。這說(shuō)明了生化檢查和臨床表型在指導(dǎo)NGS數(shù)據(jù)分析中的作用。由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(national institutes of health，NIH)資助的基因組醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生的新生兒測(cè)序(newborn sequencing in genomic medicine and public health，NSIHT)聯(lián)盟成立于2014年。NBseq計(jì)劃是NSIHT項(xiàng)目之一，它在182個(gè)經(jīng)生化檢測(cè)確診IMD的患兒樣本中，發(fā)現(xiàn)DNA測(cè)序遺漏了約20%確診病例，這些病例都是非常罕見的疾病，其中一些可能是由于DNA重組或調(diào)節(jié)基因活性的區(qū)域發(fā)生突變，外顯子測(cè)序無(wú)法檢測(cè)，使用全基因組測(cè)序又較為昂貴，并且結(jié)果解讀更具有挑戰(zhàn)性[10]。最近一項(xiàng)研究顯示，全外顯子測(cè)序技術(shù)(whole exome sequencing，WES)對(duì)于IMD的敏感性為88%，特異性為98.4%，而串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分別為99.0%和99.8%[11]，表明現(xiàn)階段NGS并不適合代替生化檢查作為一級(jí)的遺傳代謝病篩查方法。因此，將NGS技術(shù)應(yīng)用到NBS中仍然是作為生化檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性后的二級(jí)篩查方法。綜上所述，NGS和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)IMD的篩查各有利弊，需要優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，才能發(fā)揮在臨床上的最大價(jià)值。

2高通量測(cè)序技術(shù)作為一級(jí)NBS手段的應(yīng)用

隨著NGS成本的下降和基因數(shù)據(jù)庫(kù)的更新完善，人們開始考慮如何更大規(guī)模地應(yīng)用DNA測(cè)序，并擴(kuò)展篩查病種，以更早地發(fā)現(xiàn)由于基因缺陷而導(dǎo)致的新生兒健康問(wèn)題，以及如何利用分子生物學(xué)改善兒童的臨床結(jié)局。

2.1高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于高危新生兒疾病的篩查

任何一項(xiàng)技術(shù)運(yùn)用于臨床中都是循序漸進(jìn)的過(guò)程。在新生兒重癥監(jiān)護(hù)室(neonatal intensive care unit，NICU)中，遺傳性疾病和先天異常是導(dǎo)致患兒死亡的主要原因，將NGS運(yùn)用于NICU中患兒的篩查是人們考慮進(jìn)行廣泛NGS的第一步。對(duì)于危重患兒，得到準(zhǔn)確診斷關(guān)乎生死，并可以縮短住院時(shí)間，改善臨床結(jié)局。Meng等[12]對(duì)278名小于100天的NICU嬰兒進(jìn)行WES測(cè)序，總體診斷率為36.7%(102/278)，改善臨床結(jié)果52.0%(53/102)；另一項(xiàng)研究對(duì)25名NICU患兒行WES，診斷率為60%，改善臨床結(jié)果83%[13]，說(shuō)明NGS測(cè)序是一種強(qiáng)大的工具，其使用對(duì)臨床決策有顯著影響。除此之外，NICU中的早產(chǎn)兒會(huì)因?yàn)槠鞴傧到y(tǒng)不成熟，如肝臟酶活性較低、長(zhǎng)期腸外營(yíng)養(yǎng)需求等，會(huì)使NBS出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，需要反復(fù)進(jìn)行NBS和額外的后續(xù)檢測(cè)，NGS可以幫助解釋此種情況[14]。有研究對(duì)NICU中的48例新生兒(非IMD疑似患兒)進(jìn)行了NGS，共檢測(cè)到11例新生兒中有13種可能致病或致病突變，該研究的入選人群并不局限于懷疑患有特定遺傳代謝病者，為NGS用于NICU中患兒疾病的篩查提供了參考[15]。但是，由于測(cè)序結(jié)果的解釋可能會(huì)模棱兩可，測(cè)序中還會(huì)有次要發(fā)現(xiàn)，而且父母可能因?yàn)槠洚a(chǎn)生的焦慮情緒及經(jīng)濟(jì)壓力，使這種方法在臨床上的運(yùn)用受到了阻礙[16]。

2.2高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于普通新生兒的篩查

基因組測(cè)序作為“個(gè)性化”或“精確”醫(yī)學(xué)的一部分，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有更廣泛的實(shí)際潛力[17]。1990年，沃爾特·吉爾伯特(Walter Gilbert)就預(yù)示了這一點(diǎn)，其推斷到2030年或2040年，所有新生兒出生時(shí)都會(huì)進(jìn)行基因測(cè)序，有朝一日基因測(cè)序?qū)⒊蔀镹BS的重要手段。

普通新生兒無(wú)相關(guān)的臨床表型，對(duì)其進(jìn)行基因測(cè)序主要是為了當(dāng)前或未來(lái)疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)。早些年，僅有少許國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道將NGS用于普通新生兒疾病的篩查[18]。對(duì)于發(fā)病概率很小的無(wú)癥狀人群，基因組測(cè)序的陽(yáng)性或陰性預(yù)測(cè)價(jià)值尚不清楚，但是對(duì)于目前缺乏常規(guī)生化NBS方法的罕見疾病，可以將NGS用于一階篩查，篩查何種疾病需要仔細(xì)考慮各種因素，如發(fā)病年齡、嚴(yán)重程度、外顯率、確診方法、可治療性及預(yù)后[16]。BabySeq計(jì)劃[19]也是NSIHT項(xiàng)目之一，目的在于探索NGS在健康和患病新生兒中的應(yīng)用情況，并評(píng)估NGS的醫(yī)學(xué)、行為和經(jīng)濟(jì)影響。它對(duì)127名普通新生兒和32名NICU中患兒進(jìn)行WES測(cè)序，結(jié)果提示9.4%(10個(gè)普通，5個(gè)NICU)的新生兒有兒童期患病風(fēng)險(xiǎn)；另外在85名(3.5%)父母同意接受檢測(cè)關(guān)于成人發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)變異的新生兒中，發(fā)現(xiàn)有3名(3.5%)會(huì)導(dǎo)致遺傳性乳腺癌、卵巢癌或林奇綜合征的致病變異，還發(fā)現(xiàn)有7名新生兒與藥物基因組學(xué)的相關(guān)變異[7]。該研究表明了NGS可以提醒攜帶者的父母注意遺傳風(fēng)險(xiǎn)，輔助臨床醫(yī)生為患兒家庭提供生育咨詢，且藥物基因組變異可以指導(dǎo)患兒選擇用藥。BabySeq計(jì)劃還分析了493位新生兒父母及144位臨床醫(yī)生對(duì)NBS和NGS效用和差異的看法，大多數(shù)父母(71%)和臨床醫(yī)生(51%)都認(rèn)為NGS對(duì)孩子健康有益，但其覺得NGS(35%，70%)比NBS更具有風(fēng)險(xiǎn)(19%，39%)(均P<0.05)。與臨床醫(yī)生相比，新生兒父母?jìng)冋J(rèn)為NGS的益處更多，風(fēng)險(xiǎn)更??；而與其父母相比，臨床醫(yī)生更關(guān)注與基因測(cè)序相關(guān)的隱私和歧視問(wèn)題。大多數(shù)父母(93%)和所有臨床醫(yī)生(100%)都同意新生兒在出生后均應(yīng)進(jìn)行NBS，但只有33%的父母和8%的臨床醫(yī)生認(rèn)為所有新生兒都應(yīng)進(jìn)行基因測(cè)序[20]。所以當(dāng)想要將NGS廣泛實(shí)施前，除了關(guān)注其在臨床上使用的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)外，還有必要去了解新生兒父母和臨床醫(yī)生對(duì)NGS的態(tài)度、看法，以及怎么接受和評(píng)價(jià)NGS的診斷結(jié)果。

3展望與挑戰(zhàn)

高通量測(cè)序可通過(guò)一次性檢測(cè)數(shù)千種致病變異縮短診斷疾病的時(shí)間，甚至可檢測(cè)出未知的基因突變，明確未來(lái)疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，為早期干預(yù)、預(yù)防健康問(wèn)題提供可能。這一系列優(yōu)勢(shì)使其近幾年得到了迅速發(fā)展，但與此同時(shí)，它也面臨著諸多挑戰(zhàn)。第一，主要是對(duì)基因變異的解釋，尤其對(duì)特定變異可能出現(xiàn)的臨床表型、嚴(yán)重程度和發(fā)病時(shí)間的預(yù)測(cè)尤其困難，現(xiàn)仍然缺乏足夠大的特定種族基因數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)準(zhǔn)確評(píng)估某些變異的可能致病性。這些無(wú)法解釋的突變，統(tǒng)稱為意義未知的突變(VUS)，會(huì)構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)低估(突變是致病的，與疾病相關(guān)，被解釋為良性)和風(fēng)險(xiǎn)高估(良性突變被誤解為致病)的雙重危險(xiǎn)。所以這一難題需要通過(guò)國(guó)際間聯(lián)合構(gòu)建共享數(shù)據(jù)庫(kù)，以可靠的實(shí)驗(yàn)室快速診斷技術(shù)，解決龐大的數(shù)據(jù)分析問(wèn)題。第二，目前全國(guó)范圍內(nèi)的NBS是國(guó)家優(yōu)生優(yōu)育強(qiáng)制性的政策。若在新生兒篩查中引入NGS，因?yàn)樯婕半[私、倫理問(wèn)題及對(duì)意義未知突變帶來(lái)的心理壓力，可能會(huì)遭到父母的拒絕。針對(duì)這種情況，可以設(shè)計(jì)一組與可防可治疾病相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)基因突變位點(diǎn)進(jìn)行靶向基因測(cè)序，并且這些疾病得到良好預(yù)后的關(guān)鍵是從新生期或幼兒時(shí)期就開始干預(yù)。同時(shí)，它也不太可能取代目前所有的NBS手段，因?yàn)榇?lián)質(zhì)譜等生化測(cè)試在檢測(cè)某些疾病方面更具有優(yōu)勢(shì)，所以須將各種檢驗(yàn)手段依據(jù)其優(yōu)勢(shì)應(yīng)用于臨床，才可以使檢驗(yàn)手段更加成熟完善。