張萌卉，劉笑聰，郭藝紅

N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）是在真核生物中普遍存在的一種RNA表觀遺傳修飾，見于哺乳動物、植物、酵母、果蠅等各種真核生物及病毒RNA中。自m6A全轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)及去甲基化酶肥胖相關(guān)蛋白（FTO）的發(fā)現(xiàn)，m6A功能逐漸成為研究熱點。越來越多的研究表明，m6A參與多種生物過程，如腫瘤發(fā)生、干細胞轉(zhuǎn)化和配子生成等[1]。現(xiàn)對m6A檢測技術(shù)的發(fā)展、動態(tài)網(wǎng)絡(luò)的形成以及m6A在男女生殖系統(tǒng)的研究進展進行綜述。

1 m6A概述

1.1 m6A檢測技術(shù)的發(fā)展RNA m6A修飾是1974年在純化的帶有多聚腺苷酸尾巴的RNA中首次被發(fā)現(xiàn)的[2]，但傳統(tǒng)檢測方法（如液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、斑點印跡法等）無法定位RNA中的m6A，使m6A研究進展緩慢。直到2012年m6A免疫共沉淀技術(shù)與高通量測序技術(shù)（MeRIP-seq）相結(jié)合的技術(shù)出現(xiàn)，首次揭示了m6A在mRNA中的廣泛分布及富集位置，m6A生物學功能研究得以迅速發(fā)展。2020年，劉建釗團隊和賈桂芳團隊分別開發(fā)出新的m6A高通量測序方法：一種是m6A-label-seq，利用細胞代謝進行單堿基分辨測序[3]；另一種是m6A-SEAL（FTO-assisted m6A selectivechemical labeling method），一種無抗體、FTO輔助化學標記方法[4]，進一步提高檢測方法的準確度和敏感度。

近年，有學者將人工智能技術(shù)與miCLIP-Seq數(shù)據(jù)相結(jié)合，開發(fā)出基于深度學習框架的DeepM6ASeq模型，不僅可以用于預測和描述含m6A的序列，還可以借助深度學習模型中的顯著性地圖使m6A位點的位置可視化，為未來m6A的研究提供更多的可能[5]。

1.2 m6A動態(tài)網(wǎng)絡(luò)的作用多項研究表明，m6A在3種酶的動態(tài)調(diào)控下發(fā)揮各種生物功能：①甲基轉(zhuǎn)移酶，包括METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429和RBM15/15B等；②去甲基化酶，包括FTO和ALKBH5，兩者均為α-KG和Fe（Ⅱ）依賴的AlkB雙加氧酶家族成員；③結(jié)合蛋白，包括YTH蛋白家族、HNRNP蛋白家族等，識別并介導m6A發(fā)揮調(diào)控作用。

m6A動態(tài)網(wǎng)絡(luò)能夠在相關(guān)酶的催化調(diào)控下介導RNA剪接、出核、翻譯等多種RNA代謝過程。①影響RNA剪接：METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5和YTHDC1定位在富含剪接因子的核斑點，強烈提示m6A與RNA剪接事件的關(guān)系。YTHDC1與核不均核糖核蛋白（hnRNP）及其他調(diào)節(jié)因子相互作用參與RNA剪接過程[6]。②影響RNA出核：人類細胞系中，YTHDC1通過與富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子3（SRSF3）相互作用促進核內(nèi)m6A修飾RNA重新分配至細胞質(zhì)中[7]。③調(diào)節(jié)RNA翻譯：YTHDF1與翻譯起始因子eIFs、核糖體等翻譯機制相互作用，促進翻譯起始，確保m6A修飾的動態(tài)轉(zhuǎn)錄本有效生成蛋白質(zhì)[8]。④調(diào)節(jié)RNA穩(wěn)定性：RNA穩(wěn)定性可直接影響細胞內(nèi)總體RNA豐度，m6A通過多種蛋白的調(diào)節(jié)參與該過程，即m6A選擇性結(jié)合YTHDF2蛋白，使胞質(zhì)中mRNA定位從翻譯池向衰變點轉(zhuǎn)移，從而降低mRNA穩(wěn)定性，加速轉(zhuǎn)錄本衰變[9]。

2 m6A在女性生殖系統(tǒng)中的研究進展

2.1 m6A在卵母細胞成熟中的作用卵母細胞的成熟是指在排卵前數(shù)小時，充分發(fā)育的優(yōu)勢卵泡中的卵母細胞恢復減數(shù)分裂，從第一次減數(shù)分裂前期的雙線期繼續(xù)發(fā)育至第二次減數(shù)分裂中期的過程。因此，卵母細胞第一次減數(shù)分裂阻滯與恢復的精密調(diào)控是卵母細胞成熟的關(guān)鍵，對卵子質(zhì)量、受精過程及早期胚胎發(fā)育具有十分重要的作用。豬卵母細胞從胚泡期到第二次減數(shù)分裂的發(fā)育過程中，總m6A水平顯著升高。體外成熟過程中，甲基化抑制劑能使核酸m6A水平降低，并使胚泡破裂率、第一極體排出率、孤雌生殖的卵裂率和囊胚率顯著降低，嚴重阻礙卵母細胞成熟[10]。上述研究提示m6A在卵母細胞成熟過程中發(fā)揮重要作用。

近期，多項研究對m6A參與調(diào)控卵母細胞成熟的機制進行探索。甲基化抑制劑干擾成熟促進因子（MPF）調(diào)控的染色體/紡錘體組裝，導致減數(shù)分裂過程中紡錘體缺陷和染色體錯位概率增加，進而影響豬卵母細胞成熟[10]。甲基化酶METTL3可能通過調(diào)控mRNA翻譯效率，影響紡錘體形態(tài)和第一極體排出率，進而影響卵母細胞成熟[11]。Ythdc1基因的缺失導致小鼠卵母細胞大量的可變剪切缺陷，改變3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）長度，造成卵母細胞發(fā)育停滯，無成熟卵泡，無法產(chǎn)生后代[12]。有研究發(fā)現(xiàn)KIAA1429可能參與YTHDC1的可變剪切。YTHDC1通過識別Kiaa1429編碼的前體RNA上的m6A修飾，招募剪接因子促進可變剪切。因而Kiaa1429基因缺失會引起卵泡相關(guān)基因可變剪切異常，轉(zhuǎn)錄組譜表達改變，影響顆粒細胞分化，卵泡發(fā)育缺陷，胚泡未發(fā)生破裂，喪失繼續(xù)減數(shù)分裂的能力[13]。

甲基化結(jié)合蛋白Ythdf2參與母體轉(zhuǎn)錄本的降解，敲除母系遺傳Ythdf2，在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中母體mRNA衰變受阻，合子基因組激活受阻，使受精后早期胚胎發(fā)育遲緩[14]，在小鼠實驗中也觀察到胚胎發(fā)育停滯，出現(xiàn)異常的胞質(zhì)分裂[15]。

2.2 顆粒細胞中m6A調(diào)控對卵泡發(fā)育的作用卵泡發(fā)育是個漫長而復雜的過程，受到多種信號分子、激素的精密調(diào)控。顆粒細胞是卵泡的重要組成部分，在發(fā)育過程中受到卵泡內(nèi)各種細胞因子的調(diào)控，同時也通過細胞連接等方式影響卵泡的發(fā)育。顆粒細胞的增殖、分化和凋亡與卵泡選擇、卵泡閉鎖等各種發(fā)育過程密切相關(guān)，參與卵巢功能減退和多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）等疾病的發(fā)生發(fā)展。

m6A是真核生物中普遍存在的RNA修飾，近年來多項研究發(fā)現(xiàn)，m6A在卵巢顆粒細胞中含量豐富，在顆粒細胞對卵泡發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。顆粒細胞中m6A水平異常影響顆粒細胞的凋亡和增殖，損害卵巢功能，并進一步導致早發(fā)性卵巢功能不全（prematureovarian insufficiency，POI）[16]。長期接受免疫抑制劑治療的年輕女性腫瘤患者，常見的不良反應是卵巢功能減退，嚴重影響生育能力。免疫抑制劑環(huán)磷酰胺以時間和濃度依賴的方式影響m6A含量，且增加甲基化酶，抑制去甲基化酶FTO，抑制卵巢功能[17]。FOXO3是參與顆粒細胞增殖與凋亡的重要因子，其在顆粒細胞中的過表達與PCOS患者中顆粒細胞的高凋亡相關(guān)。與正常排卵女性相比，非肥胖PCOS患者黃素化顆粒細胞中m6A修飾的改變影響FOXO3轉(zhuǎn)錄[18]。

2.3 m6A在性激素合成中的作用以斑馬魚為研究對象的實驗表明，Mettl3突變導致的卵母細胞成熟障礙部分與性激素合成有關(guān)。在雌性斑馬魚中，黃體生成激素（LH）信號負責刺激卵母細胞成熟和排卵，11-酮基睪酮（11-KT）和雌二醇（E2）是斑馬魚主要的雄激素和雌激素。Mettl3基因突變的斑馬魚卵母細胞大多數(shù)發(fā)育阻滯，伴有低水平LHβ，低血清濃度的11-KT和E2，加用雙羥孕酮處理，可補救卵母細胞成熟缺陷[19]。m6A修飾水平降低，導致對上述激素合成有重要作用的基因表達中斷。m6A對性激素合成的調(diào)控作用成為研究m6A動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對卵母細胞成熟調(diào)控機制的另一種切入口。

3 m6A在男性生殖系統(tǒng)中的研究進展

精子生成包括精原細胞的增殖分化、精母細胞的減數(shù)分裂和圓形精子細胞減數(shù)分裂后的精子發(fā)生，是一種高度特異性的分化過程，離不開轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及翻譯水平的精準調(diào)控。

3.1 m6A與男性生殖功能的關(guān)系精液質(zhì)量下降和精子功能損害是影響男性生殖功能的常見原因，主要疾病包括弱精子癥和少精子癥。Yang等[20]對20例弱精子癥患者和健康男性的精液進行分析，發(fā)現(xiàn)弱精子癥患者精子mRNA中m6A明顯升高，升高的m6A與精子活力下降顯著相關(guān)。睪酮等生殖激素與精液質(zhì)量密切相關(guān)[21]，m6A甲基化可能通過影響Camkk2轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和提高Ppm1a的翻譯效率調(diào)節(jié)自噬，降低睪酮合成，繼而損害生殖功能[22]。以上研究表明，m6A甲基化修飾在男性生殖功能中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。因此，充分了解m6A在生殖功能中的分子機制，有利于為弱精子癥和少精子癥患者提供更有效的治療。

3.2 m6A影響男性生殖功能的機制METTL3介導的m6A修飾影響轉(zhuǎn)錄本的選擇性剪切事件，導致突變組小鼠睪丸中多種基因外顯子增加（exon inclusion）水平降低，產(chǎn)生較短的轉(zhuǎn)錄本，從而影響精原細胞分化、生殖細胞數(shù)量減少[23]。METTL3和METTL14依賴的m6A修飾調(diào)節(jié)甲基化轉(zhuǎn)錄本的翻譯，促進精子發(fā)生所必需蛋白質(zhì)的翻譯，同時在精子發(fā)生晚期抑制翻譯，以防止過量的蛋白質(zhì)產(chǎn)生有害后果[24]。兩者單一缺失會促進部分基因的翻譯，包括DNA復制和修復相關(guān)的因子，其中Gfer基因過表達與男性不育有關(guān)；兩者聯(lián)合缺失會抑制翻譯過程，同時可在突變體中觀察到人類少弱畸形精子綜合征（oligo-astenoteratozoospermia syndrome，OAT）表型[25]。

去甲基化酶ALKBH5在睪丸中含量豐富，在睪丸發(fā)育和精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用。Zheng等[26]發(fā)現(xiàn)，去甲基化酶ALKBH5缺失的純合子小鼠睪丸體積小，精子活力下降，數(shù)量和形態(tài)異常。轉(zhuǎn)錄組分析顯示差異表達的基因與精子發(fā)生相關(guān)，涉及凋亡和異常分化等過程[26]。這表明哺乳動物mRNA中可逆的m6A修飾在基本的生物過程中起著廣泛和關(guān)鍵的作用。隨后有研究對ALKBH5影響精子發(fā)生的潛在機制進行研究，發(fā)現(xiàn)ALKBH5介導的m6A擦除對RNA的正確剪接和長3′-UTR mRNA的產(chǎn)生至關(guān)重要。Alkbh5缺失導致參與精子發(fā)生和精子鞭毛形成的重要基因，如Foxj1、Dnaaf3、Crem、Prm2，發(fā)生異常剪切，產(chǎn)生更多的短3′-UTR轉(zhuǎn)錄本，并在伸長型精子細胞中快速降解，從而降低雄性鼠的生育力[27]。

3.3 m6A在精原細胞增殖中的作用m6A去甲基化酶FTO在精原細胞增殖中發(fā)揮重要作用。甲氯芬酸酯在體外通過與FTO競爭性結(jié)合核酸，抑制FTO的去甲基酶活性，有效提升3′-UTR m6A修飾，降低Cdk2的mRNA穩(wěn)定性，從而顯著抑制精原細胞增殖；同時，3′-UTR上m6A位點的突變可以減輕Cdk mRNA的降解[28]。

3.4 m6A在生殖干細胞中的作用有絲分裂向減數(shù)分裂的轉(zhuǎn)變是生殖干細胞開始分化的關(guān)鍵事件。Bailey等[29]發(fā)現(xiàn)，在減數(shù)分裂的早期階段，YTHDC2通過轉(zhuǎn)錄后修飾下調(diào)先前的有絲分裂程序（如細胞周期蛋白CyclinA2的表達），并促進減數(shù)分裂和分化基因（Dmc1、Spo11、Sycp3）的適當表達。Jain等[30]有同樣的發(fā)現(xiàn)，Ythdc2突變型精原細胞的有絲分裂發(fā)生相對正常，但是在減數(shù)分裂中過早地出現(xiàn)凝聚染色體和單極紡錘體，并發(fā)生凋亡；同時該研究發(fā)現(xiàn)Ythdc2和Meioc突變表型在這方面高度一致，提示Ythdc2和Meioc在減數(shù)分裂開始前后共同調(diào)節(jié)生殖細胞的發(fā)育。

4 結(jié)語與展望

m6A動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在于卵母細胞減數(shù)分裂、精子發(fā)生等生殖過程中。在女性生殖系統(tǒng)中，m6A通過多種途徑調(diào)控卵母細胞成熟，如干擾染色體/紡錘體組裝、影響轉(zhuǎn)錄本剪切、翻譯及降解。顆粒細胞中m6A水平異常促進顆粒細胞的凋亡，進而損害卵巢功能，與POI、PCOS等生殖內(nèi)分泌疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在男性生殖系統(tǒng)中，多種酶類介導的m6A修飾通過轉(zhuǎn)錄后修飾影響轉(zhuǎn)錄本的剪切、翻譯等過程，導致精原細胞分化異常，生殖細胞質(zhì)量和數(shù)量減少，嚴重影響生育力。但是m6A動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在生殖系統(tǒng)中的具體作用機制還需更深入的研究，為未來生殖障礙性疾病的診治提供更有效的幫助。