楊德新， 王新莊， 閆 磊， 朱小潔， 趙玉璽，， 薛永康， 劉曉曼， 張 震*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450002；2.河南省奶牛生產(chǎn)性能測定中心，鄭州 450046；3.河南省奶牛健康養(yǎng)殖國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450046；4.河南省種牛遺傳性能測定中心，鄭州 450046；5.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

牛病毒性腹瀉/粘膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD)是感染牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)所引起的一種復(fù)雜疾病。該病是以發(fā)熱、黏膜糜爛潰瘍、白細(xì)胞減少、腹瀉、免疫耐受與持續(xù)感染、免疫抑制、先天性缺陷、咳嗽、造成懷孕母牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或畸形胎為主要特征的一種接觸性傳染病[1]。該病不僅致病機(jī)制復(fù)雜，而且缺乏有效的治療手段，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此農(nóng)業(yè)部發(fā)布公告將BVD定為三類疫病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)也將其設(shè)為B類傳染病。我國研究人員李佑民在1980年首次在吉林省發(fā)現(xiàn)BVD/MD并分離出BVDV毒株，到目前為止至少有20多個(gè)省檢測到BVDV血清抗體陽性或者分離得到BVDV毒株[2]。此病毒不僅能夠感染牛，還能感染其他40多種動(dòng)物，目前已確定有8種動(dòng)物還可以發(fā)生BVDV持續(xù)性感染，持續(xù)性感染(PI)是造成該病毒快速傳播的重要因素。近年來，隨著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展和國外牛只的進(jìn)出口，BVDV在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，造成的經(jīng)濟(jì)損失不可估量[3]。BVD見于世界許多國家，美國BVDV的陽性率為51%，加拿大為82%～84%，澳大利亞高達(dá)88%，南美六國平均為85%，法國為76%[4]。本文簡述了牛病毒性腹瀉病毒生物學(xué)特性、流行情況以及診斷方法和防控，旨在為進(jìn)一步研究和治療提供參考。

1 牛病毒性腹瀉病毒的生物學(xué)特性

牛病毒性腹瀉病毒與豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、羊邊界病毒(Border disease virus，BDV)同屬于黃病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒屬(Pestivirus)，是一種長度為12.3～12.5 kb的單鏈陽性RNA病毒，此病毒與CSFV、BDV在血清上可有交叉反應(yīng)。BVDV的基因型與基因亞型眾多，不同的基因型感染牛后所表現(xiàn)的臨床癥狀不同，但是共有癥狀為腹瀉、發(fā)熱等呼吸道癥狀。根據(jù)BVDV的5′-UTR、Npro基因和E2蛋白的核苷酸序列差異，可分為BVDV-1型和BVDV-2型。2004年，歐洲學(xué)者在從巴西進(jìn)口到歐洲的胎牛血清中分離到HoBi-like病毒，但在當(dāng)時(shí)并未得到國際上的廣泛認(rèn)可；2009年，典型的牛的瘟病毒被定義為Ⅲ型BVDV病毒，國際上也逐漸出現(xiàn)了關(guān)于BVDV-3型的報(bào)道。通過遺傳進(jìn)化分析將BVDV-1型進(jìn)一步分為21個(gè)亞型(1a-1u)，BVDV-2型分為4個(gè)亞型(2a-2d)。根據(jù)它們在細(xì)胞培養(yǎng)中的生長特性，可以分為致細(xì)胞病變型(CP)和非致細(xì)胞病變型(NCP)[5]。這兩個(gè)生物基因型的血清學(xué)相同，但是對宿主細(xì)胞的作用不一樣，CP生物型會(huì)破壞組織培養(yǎng)，而NCP生物型則不會(huì)。在自然環(huán)境中NCP型毒株比CP型毒株多，但CP型BVDV的致細(xì)胞病變作用與該病毒的毒力之間并沒有聯(lián)系。

2 牛病毒性腹瀉的流行

2.1 國外流行情況

牛病毒性腹瀉的傳播速度很快，對美國、加拿大等畜牧業(yè)發(fā)展水平高的國家，帶來了嚴(yán)重的損失。自20世紀(jì)80～90年代開始，經(jīng)統(tǒng)計(jì)在美國和加拿大BVD/MD的陽性檢測率為50%～85%，在法國約為76%，在巴西為15.1%～56%，在克羅地亞為79.6%，在澳大利亞和新西蘭約為89%，在印度約為12.5%[6]。BVDV為多種基因型共存，地域性差異明顯。在美國，主要流行BVDV-1a、1b和BVDV-2a亞型[7]，澳大利亞、新西蘭主要為BVDV-1c亞型。

2.2 國內(nèi)流行情況

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和進(jìn)出口的頻繁，我國各地也相繼出現(xiàn)了本病的報(bào)道。曲萍等[8]在新疆、青海、寧夏、甘肅、四川5省調(diào)查BVDV流行情況，發(fā)現(xiàn)新疆、青海、寧夏、甘肅、四川地區(qū)BVDV陽性率分別為85.62%，31.86%，84.24%，58.93%和31.78%。魏偉等[9]在2006—2008年對黑龍江省不同地區(qū)的4個(gè)奶牛養(yǎng)殖場進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，3年的平均BVDV血清陽性率為58.50%。在我國幾乎所有省份都存在BVDV感染的情況，但是并沒有引起重視和采取有效的防控措施，從而導(dǎo)致BVDV快速上升。我國從20世紀(jì)90年代就開始研制疫苗，但由于成本及有效性等原因并沒有投入使用[10]。

3 牛病毒性腹瀉的臨床類型

3.1 持續(xù)性感染

NCP型BVDV產(chǎn)生的非溶質(zhì)感染和逃避宿主免疫應(yīng)答的能力是持續(xù)性感染存在的主要機(jī)制。當(dāng)NCP生物型BVDV在胎牛早期感染時(shí)，胎牛的未成熟免疫系統(tǒng)尚未形成足夠的免疫應(yīng)答，在出生以后就會(huì)攜帶BVDV病毒。胎牛的免疫系統(tǒng)會(huì)識別到病毒是它的組成部分，只要它還活著，病毒就會(huì)留在犢牛體內(nèi)，從而產(chǎn)生PI牛。PI牛出生看起來很正常，但是生長發(fā)育慢，會(huì)感染許多正常的小牛。持續(xù)性感染的牛終生都會(huì)排出病毒，甚至是其他動(dòng)物的一種感染源，因此清除PI牛是控制該病毒傳播的重點(diǎn)。

3.2 急性感染

雖然PI牛是傳染牛群BVDV的重要病源，但隨后的病毒傳播和觀察到的臨床疾病是急性感染的結(jié)果。BVDV可感染胃腸道肌肉層和黏膜下層的神經(jīng)結(jié)，導(dǎo)致正常神經(jīng)功能破壞，造成感染牛腹瀉。臨床表現(xiàn)為食欲下降，精神沉郁，高熱、流鼻涕、流涎、咳嗽、口腔鼻鏡出現(xiàn)潰爛，腹瀉嚴(yán)重，病情嚴(yán)重時(shí)可見血便，急性脫水死亡[11]。急性感染還會(huì)造成感染母牛流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎等癥狀。

3.3 粘膜病

這種臨床病理綜合征發(fā)生在母牛懷孕早期，此時(shí)母牛感染NCP型BVDV，導(dǎo)致產(chǎn)生可持續(xù)感染(PI)牛，持續(xù)感染(PI)牛再感染CP型BVDV可能會(huì)引起病變發(fā)生致死性粘膜病[12]。粘膜病的特點(diǎn)是死亡率高，動(dòng)物通常在臨床癥狀出現(xiàn)后1～2周內(nèi)死亡，尸檢顯示胃腸道不同部位的粘膜有糜爛和潰瘍現(xiàn)狀。

4 牛病毒性腹瀉病毒的診斷

病毒的檢測和鑒定主要分為病原學(xué)檢測、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測3個(gè)方面。本文以病毒的分離、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)3種常用診斷為基礎(chǔ)，展開對牛病毒性腹瀉病毒診斷技術(shù)的闡述。

4.1 病毒分離

相對于其它診斷方法而言，病毒分離是病毒學(xué)診斷的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，該方法主要采集患病動(dòng)物組織器官，接種至單層牛腎細(xì)胞，盲傳幾代后并不斷觀察是否發(fā)生細(xì)胞病變，將病毒從病變細(xì)胞中分離出來。這種方法操作效果較好，準(zhǔn)確性較高,但是細(xì)胞的敏感性、樣品儲(chǔ)存時(shí)間長短、樣品的運(yùn)輸方法、培養(yǎng)液的量和細(xì)胞的數(shù)量等因素都會(huì)影響病毒分離的結(jié)果。

4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是把已知的抗原和抗體包被在載體上，在載體上進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，通過測定吸光度來判斷的一種檢測方法。該方法操作簡單，具有快速、特異性高、成本低等特點(diǎn)，特別適合一些養(yǎng)殖場進(jìn)行大規(guī)模的檢測。目前主要應(yīng)用在牛病毒性腹瀉病毒檢測的方法主要有間接ELISA法、雙抗原(體)夾心ELISA法、間接Dot-ELISA法等。趙月蘭等[13]利用BVDV的重組E2蛋白作為包被抗原，建立了用于檢測抗BVDV抗體的間接Dot-ELISA，與IDEXX HerdChek BVDV抗體ELISA試劑盒同時(shí)測試來自田間奶牛的100份血清樣品的抗BVDV抗體，結(jié)果顯示間接Dot-ELISA的特異性強(qiáng)，靈敏度和準(zhǔn)確度高。胡俊英[14]應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)擴(kuò)增及大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了E2重組蛋白，并以此制備出了抗E2結(jié)構(gòu)蛋白的單克隆抗體與多克隆抗體，建立了基于單抗捕獲BVDV抗原的雙抗體夾心ELISA方法。葛玉鳳等[15]采用原核表達(dá)方法對BVDV-E2基因中免疫原性強(qiáng)的一段序列進(jìn)行截短表達(dá)，獲得了具有良好反應(yīng)活性的重組E2蛋白，以重組E2蛋白為包被抗原建立了檢測BVDV抗體的間接ELISA方法。檢測結(jié)果顯示，此方法具有簡單快速、敏感性特異等優(yōu)點(diǎn)。

4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

在過去的10年中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR作為一種常規(guī)的診斷BVDV的方法得到了廣泛的應(yīng)用[16]。該方法可通過內(nèi)參或外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析。任亞初等[17]根據(jù)BVDV的E2基因保守序列，設(shè)計(jì)合成一對特異性引物，建立了檢測BVDV的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。結(jié)果表明，此種方法與能感染奶牛的其它幾種病毒均無交叉反應(yīng)，檢出敏感度達(dá)4.87×10-1copies/μL，比常規(guī)PCR檢測方法高10倍。李佳暖等[18]在BVDV 5′端非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域設(shè)計(jì)了1對特異性引物，用來檢測BVDV、PEDV、SRV、TGEV等，同時(shí)建立了牛病毒性腹瀉納米PCR檢測方法，該BVDV納米PCR具有較高的敏感性和特異性，是一種高效的檢測手段，可應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查。李健友等[19]利用金納米顆粒材料與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相結(jié)合，針對BVDV 5′-UTR保守序列設(shè)計(jì)引物，建立了BVDV Nano-PCR新型分子檢測方法，結(jié)果表明，建立的BVDV Nano-PCR方法可以用來對臨床樣品進(jìn)行快速診斷和鑒定，具有特異性高、靈敏度好、快速穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。

5 牛病毒性腹瀉的防控

對于BVDV的防控措施主要有捕殺持續(xù)性感染動(dòng)物和接種疫苗，歐美一些國家已經(jīng)實(shí)施了BVDV的凈化方案，主要有淘汰持續(xù)性感染牛、疫苗接種和加強(qiáng)監(jiān)測。BVDV普遍存在，致病機(jī)理復(fù)雜，我國對BVDV的研究尚淺，沒有形成系統(tǒng)的研究體系，再加上我國BVDV毒株的基因型呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢，導(dǎo)致我國并沒有開始對BVDV進(jìn)行凈化[20]。

5.1 牛病毒性腹瀉的預(yù)防

定期為牛群接種疫苗，在牛懷孕后注射抗生素，提高牛的機(jī)體免疫能力。國內(nèi)有BVDV滅活疫苗，對發(fā)病嚴(yán)重的牛群，每隔3～5年免疫1次；對于種公?？稍谂浞N前再接種1次，這樣多數(shù)都可以獲得免疫能力[21]。隨著對BVDV致病機(jī)理和流行病學(xué)知識的積累，控制該病的核心就是清除牛群中PI牛，PI牛是BVDV的高效傳播者。將患病牛隔離，避免與健康牛的密切接觸而發(fā)生交叉感染[22]。PI動(dòng)物需要進(jìn)行2次檢測才可以確定，第1次檢測確定為抗原陽性后，與健康牛群分開喂養(yǎng)，間隔21 d后進(jìn)行再次檢測，結(jié)果為陽性，則立即進(jìn)行撲殺或淘汰。加強(qiáng)日常管理，保持牛群飼料充分，提高牛舍的通風(fēng)質(zhì)量，減少疾病的發(fā)生速率。在BVDV高發(fā)季節(jié)，對牛舍進(jìn)行定期消毒，可以有效的減少腹瀉的發(fā)生率。

5.2 牛病毒性腹瀉的治療

5.2.1 西藥治療 清理病牛腸道，對于一些病情嚴(yán)重的病牛采用高錳酸鉀溶液清理。因?yàn)椴《拘愿篂a會(huì)使病牛迅速脫水，所以進(jìn)行適當(dāng)?shù)捏w液補(bǔ)充是必不可少的，葡萄糖、地塞米松可以有效緩解病牛脫水癥狀，病牛病情緩解時(shí)要繼續(xù)隔離，并觀察無復(fù)發(fā)后才可放歸牛群養(yǎng)殖[23]。

5.2.2 中藥治療 目前，中藥作為一種預(yù)防、治療、診斷疾病的物質(zhì)，在抗病毒方面的優(yōu)勢成為我國研究的熱點(diǎn)，并表現(xiàn)出良好的前景。2017年，宋泉江[24]選擇外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)研究連翹酯苷A對BVDV的作用，發(fā)現(xiàn)在BVDV侵染過程中，連翹皂苷可調(diào)節(jié)CD28/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)的表達(dá)水平與INF-γ的過度分泌，促進(jìn)共刺激分子的表達(dá)，提高腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF-2)、免疫球蛋白2a (IgG2a)和IL-2的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞激活從而抑制BVDV復(fù)制引起的外周血單核細(xì)胞(PBMC)凋亡。通過此項(xiàng)研究表明，中藥在抗BVDV過程中具有較好的成效。越來越多的治療牛病毒性腹瀉的實(shí)用性藥方被發(fā)現(xiàn)，例如白芍散復(fù)方(白芍、車前子、地榆炭、金銀花、滑石、大黃、白頭翁、茯苓、甘草)、白芍湯復(fù)方(赤芍、黃苓、黃連、木香、大黃、金銀花、連翹、茯苓、白術(shù)、甘草)[25]。

6 小 結(jié)

牛病毒性腹瀉病毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜，受地域影響較大，雖只有兩種常見基因型，但卻有20多種不同亞型。隨著國際間進(jìn)出口貿(mào)易的增加，牛病毒性腹瀉在全球范圍內(nèi)都在大量增加，不僅造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也對該病的檢測和預(yù)防帶來了挑戰(zhàn)，特別是PI牛的產(chǎn)生，更加重了該病的傳播，因此對持續(xù)性感染牛的檢測和淘汰刻不容緩。通過了解牛病毒性腹瀉流行情況、臨床類型和檢測技術(shù)，對于該病的預(yù)防和防控具有重要意義。