張志杰，李玉龍，翟亞瑩，張格陽(yáng)，朱肖亭，于 翔，張子敬，呂世杰，施巧婷，陳付英，徐照學(xué)，劉 凡*，王二耀*

(1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 鄭州 450002; 2. 河南省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所， 鄭州 450003)

郟縣紅牛是我國(guó)八大地方優(yōu)良黃牛品種之一，主產(chǎn)區(qū)位于河南省平頂山市的郟縣。郟縣紅牛具有體格較大，較為溫順，肌肉豐滿，耐粗飼，遺傳性能較為穩(wěn)定等優(yōu)良特點(diǎn)，具有肉用體型的基礎(chǔ)[1]。但是由于其存在著生長(zhǎng)發(fā)育緩慢等缺點(diǎn)，且隨著農(nóng)業(yè)機(jī)械化水平的提高，其役用性能持續(xù)弱化。再加上國(guó)外優(yōu)良肉牛品種的引進(jìn)，郟縣紅牛的效益降低，許多養(yǎng)殖戶棄養(yǎng)郟縣紅牛，導(dǎo)致其種群數(shù)量持續(xù)下降，許多寶貴的基因丟失，母牛群體不再能滿足相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要[2]。因此，對(duì)郟縣紅牛進(jìn)行品種保護(hù)勢(shì)在必行。

動(dòng)物繁殖技術(shù)是生物技術(shù)的一個(gè)分支，自上世紀(jì)五十年代人工授精技術(shù)的應(yīng)用開(kāi)始，動(dòng)物繁殖技術(shù)翻開(kāi)了新的篇章。而作為最重要的家畜之一，牛的繁殖技術(shù)在過(guò)去的五十年中也取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，包括同期發(fā)情，體外受精、超數(shù)排卵等技術(shù)，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。繁殖技術(shù)在郟縣紅牛上的成功應(yīng)用，對(duì)郟縣紅牛品種的繁育至關(guān)重要，有助于建設(shè)郟縣紅牛的胚胎基因庫(kù)，起著品種保護(hù)和擴(kuò)繁的作用。

1 同期發(fā)情技術(shù)

自然狀態(tài)下，牛只發(fā)情時(shí)間分散，對(duì)其進(jìn)行發(fā)情鑒定和配種會(huì)耗費(fèi)大量的人力和物力，且后代出生時(shí)間不整齊，不利于牛場(chǎng)規(guī)?；纳a(chǎn)[3]。世界各國(guó)早在上世紀(jì)60年代就開(kāi)始了同期發(fā)情的相關(guān)研究，并且在牛的品種改良中獲得了巨大的成功，我國(guó)在70年代時(shí)，也開(kāi)始了相關(guān)研究。

同期發(fā)情在實(shí)踐及生產(chǎn)中常用于提高母畜繁殖率，以達(dá)到牲畜的生產(chǎn)管理水平。一般促使母畜同期發(fā)情的方法分為人為延長(zhǎng)其黃體期和人為縮短黃體期兩種?？蓱?yīng)用的激素種類非常多，包括孕激素、前列腺素、促性腺激素釋放激素等，其處理的方法也不同，不同處理方案的效果有著顯著差異。在探究郟縣紅牛同期發(fā)情技術(shù)方面，李志剛等[4]運(yùn)用兩種同期發(fā)情方法處理郟縣紅牛，發(fā)現(xiàn)CIDR+PG法處理的同期發(fā)情率顯著高于PG法二次處理。但二次PG法操作簡(jiǎn)單，且性價(jià)比高，綜合來(lái)看，2次PG法更具有實(shí)際操作意義。有研究表明，除了激素種類外，季節(jié)和母牛是否經(jīng)產(chǎn)等因素，對(duì)于母牛同期發(fā)情的效果也會(huì)有一定影響。肖杰等[5]運(yùn)用四種常用的同期發(fā)情方法對(duì)郟縣紅牛進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CIDR+PG法和2次PG法處理的效果最好。而在夏秋季(5～10月份)和冬春季(11～4月份)對(duì)郟縣紅牛進(jìn)行同期發(fā)情處理結(jié)果顯示，夏秋季的同期發(fā)情率(60%)顯著低于冬春季(78%)；在各種處理方法中，經(jīng)產(chǎn)牛的同期發(fā)情率都高于育成牛，但是二者的差異并不顯著。

同期發(fā)情可以充分發(fā)揮母牛的生產(chǎn)潛能，使后代犢牛年齡整齊，可節(jié)省在人力、物力、時(shí)間等多個(gè)方面所投入的成本，使得牛場(chǎng)的規(guī)?；?、集約化成為可能，極大的提升了養(yǎng)殖場(chǎng)的生產(chǎn)效率[6-7]。另外，同期發(fā)情也是建立胚胎基因庫(kù)的關(guān)鍵技術(shù)之一，對(duì)于郟縣紅牛的保種和開(kāi)發(fā)利用，有著舉足輕重的作用。

2 超數(shù)排卵技術(shù)

超數(shù)排卵(簡(jiǎn)稱超排)是在母牛發(fā)情周期的一定時(shí)間給予外源性激素處理，使一頭母畜一次排出比自然情況下多幾倍到十幾倍的卵子的過(guò)程稱為超數(shù)排卵。1927年，國(guó)外科學(xué)家首次在小鼠的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了超數(shù)排卵現(xiàn)象，這項(xiàng)技術(shù)隨之在各種動(dòng)物中進(jìn)行嘗試，在1940年時(shí)，首次進(jìn)行了牛的超數(shù)排卵。其主要原理是利用超過(guò)畜體正常水平的外源性促性腺激素，刺激家畜體內(nèi)即將轉(zhuǎn)化為閉鎖卵泡的有腔卵泡都繼續(xù)發(fā)育至成熟而排卵。在超數(shù)排卵過(guò)程中，用到的生殖激素可大致分為促性腺激素、孕激素和前列腺素三類，由于不同的激素在家畜體內(nèi)的半衰期不同，其超排效果也不盡相同。

超排技術(shù)發(fā)展迅速，在水牛和奶牛中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用和推廣，也為地方肉牛品種的應(yīng)用打下基礎(chǔ)[8-9]。但是不同的肉牛品種對(duì)于超數(shù)排卵的結(jié)果會(huì)有一定的影響[10]，為了探索超數(shù)排卵技術(shù)在郟縣紅牛中的應(yīng)用效果，建立對(duì)郟縣紅牛來(lái)說(shuō)相對(duì)穩(wěn)定、有效的超排程序，和小娥等[11]及李志剛等[4]運(yùn)用連續(xù)4 d遞減肌注射FSH法對(duì)郟縣紅牛進(jìn)行超排處理，頭均獲可用胚數(shù)分別為4.53枚和4.28枚，這些結(jié)果表明，試驗(yàn)中所采用的超排方法在郟縣紅牛上的應(yīng)用是完全可行的。

除了牛的品種外，超排激素的劑量、品牌以及供體類型，對(duì)超排結(jié)果都會(huì)有一定程度的影響。肖杰[12]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用兩個(gè)不同來(lái)源的FSH分三個(gè)劑量組280 mg、300 mg、320 mg進(jìn)行試驗(yàn)，加拿大FSH和寧波產(chǎn)FSH分別在30 mg和320 mg處理郟縣紅牛時(shí)可獲得最佳頭均黃體數(shù)、頭均獲胚總數(shù)和頭均可用胚數(shù)，且二者間的差異不顯著。而育成牛的頭均黃體數(shù)、頭獲胚胎總數(shù)顯著低于經(jīng)產(chǎn)牛，但可用胚數(shù)兩者間差異并不顯著，這表明郟縣紅牛的育成?？勺鳛楣w牛進(jìn)行超數(shù)排卵，其提供的可用胚占比例較高。

在實(shí)際操作過(guò)程中，為了最大化的利用郟縣紅牛優(yōu)質(zhì)供體牛，經(jīng)常會(huì)對(duì)其進(jìn)行重復(fù)超排，王新莊等[13]對(duì)供體牛進(jìn)行的3次間隔70 d的連續(xù)超排中，超排的效果無(wú)顯著變化，但在第三次超排中需要適當(dāng)增加超排的劑量。王新莊等[14]另一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，季節(jié)因素對(duì)牛的超排效果也會(huì)有一定的影響。郟縣紅牛的超排效果在冬春季(11月～4月)最好，所獲得的頭均胚總數(shù)(7.23個(gè))和頭均可用胚總數(shù)(6.51個(gè))顯著高于夏秋季(4.57個(gè)和2.90個(gè))，說(shuō)明溫度及光照對(duì)郟縣紅牛的超數(shù)排卵會(huì)有一定的影響。

郟縣紅牛生長(zhǎng)較為緩慢，產(chǎn)犢量較少，對(duì)于種群的擴(kuò)繁非常不利。超數(shù)排卵在郟縣紅牛中的應(yīng)用，可以極大提高優(yōu)良母畜的利用率，提升繁殖效率，對(duì)于快速擴(kuò)大郟縣紅牛的種群數(shù)量有著巨大作用。

3 體外受精技術(shù)

體外受精技術(shù)作為家畜繁殖技術(shù)領(lǐng)域上的第三次革命，從1959年第一胎體外受精小兔的誕生[15]，到八十年代在家畜上的成功應(yīng)用，其發(fā)展非常迅速。1982年，世界首例試管牛成功誕生[16]，標(biāo)志著體外受精技術(shù)在牛的應(yīng)用上邁出了巨大的一步。我國(guó)動(dòng)物體外受精技術(shù)起步晚，但是發(fā)展迅速，在1990年左右得到了第一批試管犢牛，到現(xiàn)在我國(guó)牛的體外受精技術(shù)已經(jīng)達(dá)到了世界先進(jìn)水平。

牛體外受精技術(shù)應(yīng)用廣泛，其目的主要是為了增加肉牛母體的受孕率，大致分為卵母細(xì)胞的體外成熟、精子的體外獲能和體外受精三部分。田萬(wàn)強(qiáng)[17]通過(guò)試驗(yàn)證明，20～24 h是郟縣紅牛卵母細(xì)胞體外成熟的最佳時(shí)間范圍。在郟縣紅牛細(xì)胞培養(yǎng)液中添加10%ECS或者10%FCS與外源激素的聯(lián)合培養(yǎng)都是完全可行的，兩種方案有著完全一致的培養(yǎng)效果。選擇10%ECS可簡(jiǎn)化操作程序，適用于胚胎生產(chǎn)的商業(yè)化。添加5.0 mmol/L咖啡因組精子孵育 30 min 可達(dá)到最佳的獲能效果，卵裂率達(dá)到68.59%、桑囊胚率達(dá)到 28.50%。但由于咖啡因在幫助精子獲能的同時(shí)，對(duì)胚胎會(huì)有一定毒害作用，因此，要盡量減少卵母細(xì)胞在受精液中的停留時(shí)間。

體外受精技術(shù)作為一項(xiàng)重要的繁殖技術(shù)，可以與超排以及胚胎冷凍技術(shù)聯(lián)合在郟縣紅牛中應(yīng)用，可顯著提高優(yōu)質(zhì)母畜的利用效率，快速擴(kuò)繁出優(yōu)質(zhì)畜群。

4 胚胎冷凍技術(shù)

胚胎冷凍技術(shù)是指采取特殊的保護(hù)措施和降溫措施，使胚胎在超低溫(液氮-196 ℃或者-269 ℃)條件下暫時(shí)停止代謝，在升溫之后能夠重新恢復(fù)活力的一種保存胚胎的技術(shù)。體外受精后沒(méi)有及時(shí)移植的胚胎，可通過(guò)常溫保存、低溫保存和冷凍保存等方式進(jìn)行存儲(chǔ)[18]。作為重要的輔助生殖技術(shù)，胚胎冷凍技術(shù)在大部分哺乳動(dòng)物中都有應(yīng)用，1973年首次在牛中獲得成功，至今已經(jīng)比較成熟。

目前，冷凍牛的胚胎時(shí)大多選擇甘油或乙二醇作為冷凍保護(hù)劑[19],相比其他保護(hù)劑如DMSO(二甲基亞砜)來(lái)說(shuō)，保護(hù)效果更好且毒性相對(duì)較小。有資料顯示，冷凍方法及動(dòng)物品種的不同，對(duì)于保護(hù)劑的濃度選擇也不同。肖杰[12]對(duì)郟縣紅牛的冷凍胚胎方法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在受體牛條件相同的情況下，運(yùn)用1.5 mol/L乙二醇和2.0 mol/L的甘油冷凍后胚胎的繼續(xù)發(fā)育率之間無(wú)顯著差異，但選擇甘油作為保護(hù)劑對(duì)于技術(shù)的要求相對(duì)較低，在運(yùn)用甘油作冷凍保護(hù)劑對(duì)郟縣紅牛胚胎進(jìn)行冷凍時(shí)，2.0～2.5 mol/L的濃度比較適宜。

胚胎冷凍技術(shù)使得郟縣紅牛的胚胎可以進(jìn)行存儲(chǔ)、遠(yuǎn)距離運(yùn)輸以及胚胎大面積應(yīng)用移植成為可能，對(duì)于郟縣紅牛胚胎基因庫(kù)的建設(shè)具有極大的理論和實(shí)踐意義。

5 體細(xì)胞克隆技術(shù)

通過(guò)將一個(gè)二倍體細(xì)胞核移入去核卵細(xì)胞，使其在特定條件下進(jìn)行重組，然后植入代孕母體中發(fā)育成新個(gè)體的技術(shù)稱為體細(xì)胞克隆技術(shù)[20]。作為一項(xiàng)輔助繁殖技術(shù)，自首例細(xì)胞克隆綿羊誕生以來(lái)，克隆技術(shù)便以其無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)在畜牧業(yè)的生產(chǎn)中發(fā)揮著巨大作用，具有廣闊的應(yīng)用前景[21]。2003年，我國(guó)首次利用克隆技術(shù)生產(chǎn)了3頭克隆牛[22]，標(biāo)志著我國(guó)在克隆技術(shù)運(yùn)用于牛的生產(chǎn)上邁出了巨大的一步。

盡管克隆牛所需要的細(xì)胞核來(lái)源非常廣泛，且目前核移植的平均效率已經(jīng)有了很大提升，但是其變異仍然較大[23]。變異的來(lái)源包括核源的核型和供體細(xì)胞的處理等[24]。楚秋霞[25]等對(duì)郟縣紅牛耳成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)及傳代的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的活力損害較小，且染色體和核型保持了一定程度的穩(wěn)定性，可以作為郟縣紅牛體細(xì)胞克隆的材料來(lái)源。

由于克隆技術(shù)所需的苛刻環(huán)境和技術(shù)條件，具有高昂的成本，目前其并不具備規(guī)?；a(chǎn)的技術(shù)價(jià)值。且克隆技術(shù)目前存在著克隆效率低[26-27]，克隆動(dòng)物胚胎，胎兒發(fā)育異常如胎兒肥大[28-29]及克隆動(dòng)物發(fā)育缺陷等問(wèn)題。若要將其運(yùn)用到郟縣紅牛的廣泛生產(chǎn)當(dāng)中，還需要進(jìn)一步的努力，對(duì)操作過(guò)程進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，使其更加適應(yīng)工廠規(guī)?；牟僮鱗20]。

6 展望

作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的來(lái)源之一，牛肉在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)一直處于供不應(yīng)求的狀態(tài)。郟縣紅牛作為地方優(yōu)秀肉牛品種之一，肉用性能良好，風(fēng)味獨(dú)特，但其基礎(chǔ)規(guī)模群體較小，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，繁殖能力弱，限制了郟縣紅牛產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。同期發(fā)情、超數(shù)排卵等一系列繁殖技術(shù)在郟縣紅牛集約化養(yǎng)殖中的成功應(yīng)用，一定程度上改善了這一現(xiàn)狀，提高了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)我們也看到，這些繁殖技術(shù)有的并沒(méi)有很完善，還有很大的改進(jìn)空間。我們相信，隨著這些繁殖技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化和更多繁殖技術(shù)在郟縣紅牛上的應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)郟縣紅牛優(yōu)質(zhì)種群的快速擴(kuò)繁，在保種的基礎(chǔ)上為養(yǎng)殖戶增產(chǎn)增收。