丁聚賢 ，謝興文，許偉，李鼎鵬，李寧，蘇積亮，柳博，李建國(guó)，柴利軍

0 引言

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）好發(fā)于青少年以及兒童，是臨床最多見的原發(fā)惡性骨腫瘤，常見部位為四肢關(guān)節(jié)附近，早期易出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，病死率高，惡性程度高[1]。目前，新輔助化療聯(lián)合手術(shù)是早期OS治療的一線選擇方案，術(shù)前化療可殺死部分OS細(xì)胞和微小的跳躍灶、縮小腫瘤體積，有利于手術(shù)切除。但仍有部分患者面臨治療失敗，導(dǎo)致早期局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，其主要原因是腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物耐藥及低敏感度[2]。近年來，逆轉(zhuǎn)OS耐藥的制劑逐漸應(yīng)用于臨床，但效果不佳且不良反應(yīng)大，因此尋求全新的有效逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的方法迫在眉睫。中醫(yī)藥具有高效、低毒、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的優(yōu)勢(shì)，近年來關(guān)于中醫(yī)中藥逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的研究較多，ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)參與了腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的重要進(jìn)程，已有大量研究證實(shí)部分中藥可通過調(diào)控ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)OS細(xì)胞的化療耐藥[3]。本文從ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)與OS化療耐藥性產(chǎn)生的關(guān)系及中醫(yī)藥通過調(diào)控ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)的機(jī)制作一概述，以期為中醫(yī)藥輔助治療OS提供臨床依據(jù)。

1 ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

近年來，對(duì)于腫瘤化療耐藥的產(chǎn)生機(jī)制已取得了大量的突破性進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)化療藥物的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)及活化障礙、轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的酶活性異常、腫瘤細(xì)胞損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、細(xì)胞周期阻滯與凋亡失衡、自噬等都會(huì)影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感度[4]，其中化療藥物攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)及活化障礙尤為重要，腫瘤細(xì)胞可借某些膜蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能將化療藥物排出細(xì)胞外，從而達(dá)到降低細(xì)胞內(nèi)有效藥物濃度的目的，進(jìn)而降低化療藥物的殺傷作用。ABC（ATP-binding cassette,ABC）跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族在腫瘤細(xì)胞中的主要作用是將那些進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出去，它參與了腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的重要進(jìn)程，目前發(fā)現(xiàn)該家族有48個(gè)成員，研究較多的如P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MDR-associated protein,MRP1），可作為化療藥外泵系統(tǒng)，降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，最終對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐藥[5]。

1.1 P-gp介導(dǎo)的腫瘤化療耐藥機(jī)制

P-gp是有MDR編碼的分子量為170 kDa的蛋白質(zhì)，約包含1276～1280個(gè)氨基酸，依賴ATP產(chǎn)生的能量發(fā)揮其功能[6]。P-gp與轉(zhuǎn)運(yùn)毒物及藥物等的解毒功能有關(guān)，位于細(xì)胞膜上，由結(jié)構(gòu)相似的兩半組成，每一半都有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（MSD）和1個(gè)高度保守的ATP結(jié)合域（NBD）[7]。P-gp與多種腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)，腫瘤細(xì)胞膜表面高表達(dá)的P-gp能抑制抗腫瘤藥物的吸收并促其外排（如蒽環(huán)類、紫杉醇、長(zhǎng)春堿、依托泊苷），導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥的低敏感度。綜合現(xiàn)有研究，P-gp參與化療耐藥途徑的機(jī)制有三種：（1）藥物與P-gp直接結(jié)合并排除胞外；（2）抗腫瘤藥與P-gp在脂質(zhì)分子層結(jié)合，從而化療藥未進(jìn)入胞內(nèi)便被排出；（3）部分抗腫瘤藥最終進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，P-gp會(huì)將其泵入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜腔，出胞作用將其排出細(xì)胞[8]。此外，P-gp還可通過各種方式參與腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、遷移及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等。目前已有大量研究證實(shí)P-gp的高表達(dá)與腫瘤惡性程度及化療耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)，Sugawara[9]報(bào)道，在腎上腺腫瘤、胰島素腫瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌組織中P-gp均存在高表達(dá)，與腫瘤的惡性組織學(xué)行為呈正相關(guān)。Leonard等[10]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌、腎癌、白血病和乳腺癌等惡性腫瘤化療后腫瘤的進(jìn)展與P-gp的表達(dá)也呈正相關(guān)。楊力[11]研究發(fā)現(xiàn)P-gp在OS組織中多呈陽(yáng)性表達(dá)，可作為判斷OS性質(zhì)及評(píng)估其化療預(yù)后的指標(biāo)。由此可見，多種腫瘤組織內(nèi)存在P-gp的異常表達(dá)，且與腫瘤組織的惡性程度及對(duì)化療藥物的敏感度密切相關(guān)。

1.2 MRP1介導(dǎo)的腫瘤化療耐藥機(jī)制

MRP1基因位于人類染色體16p13.1上，與P-gp的功能相似，都可通過外排作用泵出抗癌藥物發(fā)揮腫瘤細(xì)胞的解毒作用，但二者轉(zhuǎn)運(yùn)底物和機(jī)制存在差異，MRP1優(yōu)先運(yùn)載親水分子和有機(jī)陰離子，無法轉(zhuǎn)運(yùn)未被修飾的抗腫瘤化合物，在泵出化療藥物前抗癌藥物需要與谷胱甘肽（glutathione,GSH）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase,GST）耦合為有機(jī)陰離子結(jié)合物，然后再依靠細(xì)胞膜上的ATP泵出細(xì)胞外，從而降低化療藥在細(xì)胞內(nèi)的有效作用濃度[12]。同時(shí)，MRP1可改變細(xì)胞內(nèi)藥物的分布，阻斷細(xì)胞的解毒系統(tǒng)，從而介導(dǎo)耐藥[13]?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)MRP1蛋白的表達(dá)率與多種腫瘤細(xì)胞的耐藥性相關(guān)，且與患者的預(yù)后相關(guān)，介導(dǎo)著如OS、肝癌等多種惡性腫瘤的耐藥過程[14]。Li等[15]研究了缺氧與人OS細(xì)胞Notch信號(hào)通路和MRP1的表達(dá)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)低氧條件下OS細(xì)胞可通過Notch信號(hào)途徑上調(diào)MRP1蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致對(duì)化療藥物的敏感度降低?？傊?，MRP1的表達(dá)與OS密切相關(guān)，與OS惡性程度、耐藥程度呈正相關(guān)。

2 中藥逆轉(zhuǎn)骨肉瘤化療耐藥的研究

2.1 通過調(diào)控P-gp的表達(dá)逆轉(zhuǎn)OS化療耐藥

中藥逆轉(zhuǎn)OS化療耐藥常見的機(jī)制是通過鈣離子阻滯作用及調(diào)控某些信號(hào)通路的表達(dá)，從而抑制P-gp的表達(dá)起到逆轉(zhuǎn)化療耐藥的作用。中藥粉防己主要活性成分粉防己堿具有抗炎、鈣通道阻滯及抗氧化的作用[16]，高濃度粉防己堿具有強(qiáng)大的逆轉(zhuǎn)阿霉素對(duì)OS耐藥的作用，可通過抑制細(xì)胞膜上P-gp的表達(dá)增加化療藥在人OS耐藥U2OS細(xì)胞內(nèi)的積聚，抑制外排[17]。姜黃素與粉防己堿相似，亦可通過抑制P-gp的表達(dá)增加化療藥在耐藥細(xì)胞內(nèi)的有效作用濃度，體外研究發(fā)現(xiàn)，2 μg/ml的姜黃素對(duì)U-2OS/ADM細(xì)胞的抑制率接近50%[18]。我國(guó)著名傳統(tǒng)方劑片仔癀的抗腫瘤作用已得到廣泛證實(shí)，可通過誘導(dǎo)OS細(xì)胞凋亡、抑制其遷移和侵襲能力，有效地在體內(nèi)外水平抑制OS細(xì)胞生長(zhǎng)[19]。同時(shí)，體外研究發(fā)現(xiàn)[20]片仔癀具有顯著逆轉(zhuǎn)OS細(xì)胞耐藥的作用，與姜黃素、粉防己堿相比，片仔癀似乎更具優(yōu)勢(shì)，其不僅可通過抑制P-gp的表達(dá)，增加化療藥在耐藥細(xì)胞U-2OS/ADM內(nèi)的有效積聚，還可通過調(diào)控凋亡蛋白家族（下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2，并上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)）顯著增加耐藥OS細(xì)胞U-2OS/ADM的凋亡作用，因此片仔癀可通過多途徑有效逆轉(zhuǎn)OS細(xì)胞的耐藥作用。蘆薈酮B是中藥苦豆子的黃酮類化合物，具有黃酮類化合物典型的抗炎、抗氧化作用。Xia等[21]通過體外研究發(fā)現(xiàn)蘆薈酮B可以通過NF-κB信號(hào)途徑抑制P-gp的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有效逆轉(zhuǎn)MG-63/DOX細(xì)胞對(duì)多柔比星的耐藥性，同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)無毒濃度下的蘆薈酮B可以增加多柔比星誘導(dǎo)的OS細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)中藥砒霜主要活性成分三氧化二砷[22]與川芎嗪[23-24]均可通過下調(diào)細(xì)胞膜P-gp和Bcl-2蛋白增強(qiáng)OS細(xì)胞的化療敏感度，誘導(dǎo)其凋亡，川芎嗪可以顯著增強(qiáng)U-2OS細(xì)胞對(duì)阿霉素、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺的敏感度，三氧化二砷聯(lián)合阿霉素能顯著抑制MG63/DOX細(xì)胞的增殖。綜上，我們發(fā)現(xiàn)，許多中藥單體具有明確的逆轉(zhuǎn)OS化療耐藥的作用，最主要的機(jī)制是抑制細(xì)胞膜表面的P-gp表達(dá)，部分中藥單體還與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路、抑凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax的協(xié)同調(diào)控有關(guān)。

2.2 通過調(diào)控MRP1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)OS化療耐藥

MRP1蛋白介導(dǎo)著多種腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物，如抵抗蒽環(huán)類、長(zhǎng)春新堿、抗葉酸藥物等[25]的耐藥過程，與OS的耐藥機(jī)制密切相關(guān)，已有部分研究證明中藥有效成分可通過下調(diào)MRP1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)OS化療的耐藥性。淫羊藿有效成分淫羊藿苷Ⅱ和淫羊藿苷（ICT）對(duì)人OS耐藥細(xì)胞MG-63/DOX均有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用，且ICT逆轉(zhuǎn)作用更佳，呈劑量依賴性誘導(dǎo)凋亡，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)ICT降低了MG-63/DOX細(xì)胞內(nèi)MDR1和MRP1基因編碼的蛋白水平[26]。β-欖香烯不僅可以通過多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，減少骨肉瘤患者化療不良反應(yīng)，還可以協(xié)同增強(qiáng)放化療的效果[27-28]。體外研究發(fā)現(xiàn)欖香烯能通過下調(diào)MRP1的表達(dá)有效抑制阿霉素所誘導(dǎo)的MG-63細(xì)胞耐藥[29]。此外，P-gp/MRP1抑制劑漢防己甲素能夠有效逆轉(zhuǎn)OS細(xì)胞對(duì)阿霉素、依托泊苷、長(zhǎng)春瑞濱的耐藥性，因而對(duì)已產(chǎn)生耐藥的OS治療推薦P-gp和MRP1抑制劑聯(lián)合應(yīng)用[30]。綜上，中藥有效成分在逆轉(zhuǎn)OS化療耐藥的過程中與下調(diào)MRP1的表達(dá)密切相關(guān)。另外，屠重棋等[31]應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了6例正常骨組織和45例OS組織中MRP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MRP1在OS中高表達(dá)，且與惡性程度呈正相關(guān)。因此，抑制MRP1的表達(dá)是降低OS侵襲性與逆轉(zhuǎn)化療耐藥的有效手段。

3 小結(jié)

近年來，中藥抗腫瘤研究呈日漸增多的趨勢(shì)，中藥可利用多通路、多靶點(diǎn)協(xié)同的優(yōu)勢(shì)，不僅能提高機(jī)體免疫功能，還具有明顯的化療增敏、改善肝功能、促進(jìn)造血功能恢復(fù)、防止肺轉(zhuǎn)移等輔助抗腫瘤的作用[32]，因此在OS治療過程中具有較好的應(yīng)用價(jià)值和前景。目前中藥逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥的主要機(jī)制有下調(diào)P-gp的表達(dá)、抑制MRP1基因的表達(dá)、促進(jìn)耐藥細(xì)胞的凋亡、調(diào)控某些信號(hào)通路等[33]，其中P-gp與MRP1是ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的主要成員蛋白，也是目前介導(dǎo)OS化療耐藥的主要分子蛋白，通過上述研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)中藥是通過下調(diào)P-gp與MRP1實(shí)現(xiàn)OS逆轉(zhuǎn)耐藥的，但部分中藥單體如欖香烯可通過多種途徑（降低MRP1表達(dá)及抑制酶系統(tǒng)表達(dá)）逆轉(zhuǎn)OS的化療耐藥，且目前的研究主要集中在體外實(shí)驗(yàn)，因此在未來應(yīng)注重單體的臨床療效對(duì)比研究及部分明確有逆轉(zhuǎn)作用的中藥單體其他機(jī)制的再研究，以發(fā)揮中藥抗OS的最大優(yōu)勢(shì)。