林間，王海波，沈鋒

0 引言

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）通常被認(rèn)為起源于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)[1]。ICC發(fā)病隱匿，侵襲性高，易侵犯肝臟周圍組織，發(fā)生淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此大部分患者在初診時(shí)已處于晚期。即使在有條件接受根治性手術(shù)的患者中，術(shù)后復(fù)發(fā)率仍有40%～80%，5年生存率僅為20%～40%[2]。ICC目前缺乏有效的治療方案。近年來，隨著對(duì)ICC分子水平及腫瘤微環(huán)境的深入研究，發(fā)現(xiàn)許多潛在的治療靶點(diǎn)。本文就ICC新發(fā)現(xiàn)的治療靶點(diǎn)進(jìn)行綜述。

1 ICC腫瘤微環(huán)境相關(guān)的潛在治療靶點(diǎn)

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）是由腫瘤細(xì)胞及其周圍基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、脈管系統(tǒng)及分子信號(hào)等形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、維持的一個(gè)關(guān)鍵因素。ICC的腫瘤微環(huán)境以致密的纖維炎性間質(zhì)為特征，稱為腫瘤反應(yīng)性間質(zhì)（tumor reactive stroma,TRS）。這種獨(dú)特的微環(huán)境被腫瘤細(xì)胞激活后，釋放大量的旁分泌信號(hào)，在促進(jìn)ICC侵襲性生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、對(duì)化療和靶向藥物以及免疫抑制劑的治療抵抗等方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用[3]。

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）作為TRS的關(guān)鍵成分，促進(jìn)了腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和化療抵抗等惡性行為。對(duì)ICC患者的癌及癌旁標(biāo)本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，大量的CAFs高表達(dá)IL6，誘導(dǎo)ICC細(xì)胞發(fā)生明顯的表觀遺傳學(xué)改變，增加其惡性程度[4]。全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2）編碼基因是ICC最常見的基因突變之一。在一項(xiàng)針對(duì)吉西他濱治療無效的ICC患者的多中心Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，F(xiàn)GFR酪氨酸激酶抑制劑BGJ398達(dá)到了14.8%的有效率以及75.4%的疾病控制率，展示了該靶點(diǎn)強(qiáng)有力的治療前景[5]。抗纖維化藥物尼達(dá)尼布（nintedanib）是一種酪氨酸激酶的小分子抑制劑，可作用于FGFR、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體，明顯抑制化學(xué)誘導(dǎo)的肝纖維化[6]。尼達(dá)尼布在ICC細(xì)胞系中可以減少活化的CAFs表達(dá)IL6、IL8等促癌因子，抑制ICC細(xì)胞的增殖和侵襲。體外試驗(yàn)中，尼達(dá)尼布抑制了移植瘤的生長(zhǎng)，并可增強(qiáng)ICC化療藥物吉西他濱的療效，提示聯(lián)用尼達(dá)尼布和傳統(tǒng)細(xì)胞毒藥物有望治療伴有CAFs激活的難治性ICC[7]。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages,TAMs）是組成TRS的另一重要成分，主要通過極化的M2表型促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移[8]。在ICC患者中，高密度M2極化的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（M2-TAMs）與高侵襲性和不良的預(yù)后顯著相關(guān)。M2-TAMs可通過促進(jìn)分泌細(xì)胞因子（如粒細(xì)胞——巨噬細(xì)胞集落-刺激因子、腫瘤壞死因子-α和IL6等）、趨化因子（如CCL1、CCL2等）來誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境[9]。CD11b和MHC-Ⅱ均陽性的TAMs可以通過與抗體的Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合，去除結(jié)合在PD-1陽性T細(xì)胞上的抗PD-1抗體，從而消除這種免疫檢查點(diǎn)抑制劑的抗腫瘤作用[10]。在腫瘤形成的背景下，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition,EMT）使腫瘤細(xì)胞增加了發(fā)生和轉(zhuǎn)移的潛能，抵抗免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的清除[11]。體外試驗(yàn)中，M2-TAMs可以促進(jìn)ICC細(xì)胞的EMT，增強(qiáng)了細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。集落刺激因子1（colony stimulating factor 1,CSF1）/CSF1受體軸是影響TAMs分化的關(guān)鍵因素。因此，TAMs是一個(gè)潛在的ICC治療靶點(diǎn)，針對(duì)該靶點(diǎn)可能可以增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑及細(xì)胞毒藥物療效。

2 腫瘤基因相關(guān)的潛在治療靶點(diǎn)

2.1 非編碼RNA

非編碼RNA（non-coding RNA,ncRNA）是一系列不參與蛋白質(zhì)編碼的RNA的總稱，包括微小RNA（microRNA,miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）等，通過招募調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子等特定的蛋白質(zhì)復(fù)合物到基因組DNA上，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、增殖、分化、侵襲、遷移、凋亡等方面發(fā)揮重要作用。MiRNAs編碼基因的突變和miRNAs的異常表達(dá)和包括ICC在內(nèi)的多種腫瘤相關(guān)。Wu等[12]報(bào)道，miR-424-5p在ICC組織中下調(diào)，其過表達(dá)可顯著抑制ICC細(xì)胞的侵襲和遷移。ARK5是人AMP活化蛋白激酶（AMPK）家族的新成員，已發(fā)現(xiàn)其通過調(diào)節(jié)EMT促進(jìn)肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）細(xì)胞系的侵襲、轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)腫瘤對(duì)阿霉素耐藥。該研究亦發(fā)現(xiàn)，ARK5高表達(dá)和ICC患者預(yù)后不良相關(guān)，敲除ARK5基因后可抑制ICC細(xì)胞的侵襲和遷移。而miR-424-5p通過與ARK5 mRNA的3’-UTR結(jié)合，抑制mTOR磷酸化，從而抑制ARK5的表達(dá)，下調(diào)EMT。靶向miR-424-5p及ARK5可以抑制ICC細(xì)胞的侵襲、遷移和EMT進(jìn)展，可能成為ICC治療的一種有效措施。

Rab1A是RAS癌基因家族中的一員，其異常激活參與宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、HCC等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。最近一項(xiàng)國(guó)內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，在ICC組織中，Rab1A在mRNA水平及蛋白水平過表達(dá)，其高表達(dá)是ICC患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素之一[14]。MiR-212-3通過抑制細(xì)胞周期及EMT，靶向調(diào)控Rab1A，導(dǎo)致ICC細(xì)胞增殖和遷移受抑制，提示Rab1A作為靶點(diǎn)在ICC治療中的潛在價(jià)值。

葡萄糖是腫瘤細(xì)胞最主要的能量來源，在很多腫瘤中都觀察到葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transportertype 1,GLUT1）的過表達(dá)[15]。據(jù)報(bào)道，GLUT1在ICC組織中高表達(dá)，其過表達(dá)和較短的總生存期、無瘤生存期相關(guān)。GLUT1正向調(diào)控和腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶2，GLUT1相關(guān)基因被敲除后，ICC細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲能力降低，且對(duì)吉西他濱的敏感度顯著提高，而miR-148A直接調(diào)控GLUT1，其水平下調(diào)導(dǎo)致ICC中GLUT1過表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展和吉西他濱耐藥[16]。該靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)可能有助于解決ICC患者在接受吉西他濱治療過程中常發(fā)生獲得性耐藥這一問題。

具有植物同源域和環(huán)指結(jié)構(gòu)域的泛素樣蛋白1（ubiquitin-like with plant homeodomain and ring finger domains 1,UHRF1）是DNA甲基化維持的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲、凋亡有關(guān)，目前已經(jīng)在多種腫瘤中觀察到其過表達(dá)[17]。Zhu等[18]報(bào)道，UHRF1在ICC組織中過表達(dá)，和預(yù)后不良有關(guān)。下調(diào)的UHRF1減弱了G1/S細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而抑制了體外細(xì)胞增殖和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。在對(duì)其上游機(jī)制的探尋中，發(fā)現(xiàn)miR-124-3p直接調(diào)控UHRF1，該miRNA的升高導(dǎo)致UHRF1的表達(dá)降低，從而抑制了ICC細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期阻滯[18]。

除了上述miRNA，還有多種miRNA被證實(shí)在ICC中異常表達(dá)。MiR-129-2-3p在ICC中表達(dá)顯著降低，而miR-19b-3p則升高，二者均與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期明顯相關(guān)。外源性增強(qiáng)miR-129-2-3p表達(dá)及miR-19b-3p的抑制劑都明顯抑制ICC細(xì)胞的增殖和侵襲能力[19-20]。

LncRNA也在一些研究中被證實(shí)在ICC進(jìn)展過程中起到關(guān)鍵作用。CDKN2B-AS1、CASC15在ICC中均異常表達(dá)[21-22]，參與多種腫瘤生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)。HAGLROS在ICC中高表達(dá)，與不良預(yù)后相關(guān)。HAGLROS通過mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)ICC脂質(zhì)代謝。在ICC細(xì)胞系中敲除HAGLROS后脂質(zhì)相關(guān)蛋白水平降低，細(xì)胞進(jìn)程受阻，mTOR軸失活，自噬增加[23]，而ZEB1-AS1、PCAT6的高表達(dá)與ICC患者的臨床進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)。ZEB1-AS1通過miR-200A/ZEB1信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT，而PCAT6通過調(diào)控miR-330-5p促進(jìn)ICC細(xì)胞系的增殖、轉(zhuǎn)移，異位表達(dá)miR-330-5p可抑制細(xì)胞增殖和侵襲[24-25]。

綜上所述，各種非編碼RNA通過不同的調(diào)控機(jī)制影響了ICC的侵襲行為，有望成為新的預(yù)后標(biāo)志物及重要的治療靶點(diǎn)。

2.2 癌基因

染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白1樣基因（chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein 1-like,CHD1L）被認(rèn)為是一種癌基因，可影響腫瘤細(xì)胞多藥耐藥、DNA修復(fù)、抗凋亡，其過表達(dá)與多種惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[26]。CHD1L的多種致癌機(jī)制使它成為了多個(gè)腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)。一項(xiàng)國(guó)內(nèi)研究通過分析ICC患者的腫瘤組織及配對(duì)的非腫瘤標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)CHD1L在ICC中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤組織分化程度、血管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)。CHD1L表達(dá)陽性的ICC患者預(yù)后差于表達(dá)陰性的患者。在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中，CHD1L和腫瘤細(xì)胞侵襲能力相關(guān)。CHD1L被RNAi沉默后，ICC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力受到了抑制[27]。

Y染色體性別決定區(qū)（sex-determining region of Y chromosome,SRY）-盒轉(zhuǎn)錄因子9（SRY-box transcription factor 9,SOX9）作為癌基因參與腫瘤的啟動(dòng)、增殖、遷移、化療耐藥和細(xì)胞干性維持。在一項(xiàng)對(duì)59例ICC患者的研究中，發(fā)現(xiàn)高SOX9表達(dá)的ICC患者生存時(shí)間明顯短于低表達(dá)的患者。用siRNA干擾SOX9可顯著降低與藥物代謝和多藥耐藥相關(guān)的基因/蛋白的表達(dá)，增加了與p53信號(hào)通路相關(guān)基因的豐度[28]。檢查點(diǎn)激酶1是一種關(guān)鍵的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白，協(xié)調(diào)DNA損傷反應(yīng)，并抑制多藥耐藥基因的表達(dá)。敲除SOX9基因后，吉西他濱誘導(dǎo)檢查點(diǎn)激酶1的磷酸化受抑制，導(dǎo)致ICC細(xì)胞凋亡明顯增加。提示在ICC患者中，可通過靶向SOX9基因調(diào)控吉西他濱的效果[28]。

3 腫瘤表達(dá)蛋白和表觀遺傳修飾酶相關(guān)的潛在治療靶點(diǎn)

3.1 靶點(diǎn)蛋白

哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子Forkhead Box M1（FOXM1）是Forkhead蛋白質(zhì)家族的成員。既往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1逃避抑癌基因p53的腫瘤抑制作用、增加腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡及基因組不穩(wěn)定性的抵抗[29]。Liu及同事[30]分析了184例ICC患者的組織標(biāo)本中FOXM1表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FOXM1過表達(dá)與腫瘤多發(fā)結(jié)節(jié)、腫瘤＞5 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、不良預(yù)后有關(guān)，上調(diào)FOXM1顯著促進(jìn)ICC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲?；蚋患治霭l(fā)現(xiàn)FOXM1影響ICC增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡相關(guān)的c-Myc、P53、經(jīng)典WNT、c-MET和ATM等通路，表明FOXM1在ICC的不同發(fā)展階段均扮演了重要的角色。Forkhead蛋白質(zhì)家族FOXA亞家族中，F(xiàn)OXA1和FOXA2作為雌激素和雄激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子，與HCC的發(fā)病關(guān)系密切。在ICC中，低表達(dá)的FOXA1和高表達(dá)的FOXA3與ICC細(xì)胞的侵襲能力、腫瘤的惡性行為及不良預(yù)后相關(guān)[31]?？傊?，F(xiàn)orkhead蛋白質(zhì)家族的部分成員是ICC患者的可靠預(yù)后指標(biāo)之一，有望成為該病的治療靶點(diǎn)。

3.2 表觀遺傳修飾酶

甲基化、磷酸化、乙?；刃揎椩诩?xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝、發(fā)育等生命過程中發(fā)揮著重要作用。DNA甲基化的動(dòng)態(tài)模式和肝癌的生物學(xué)行為、臨床結(jié)局、化療藥物耐藥性密切相關(guān)。隨著對(duì)癌癥基因組研究的不斷深入，編碼H3K4特異性去甲基化酶KDM5C的基因被鑒定為腫瘤驅(qū)動(dòng)基因，具有抑癌作用。在ICC中，發(fā)現(xiàn)其在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，低表達(dá)和預(yù)后不良相關(guān)。過表達(dá)KDM5C抑制細(xì)胞增殖、侵襲和脂肪酸代謝等關(guān)鍵信號(hào)通路，故該基因是一種ICC惡性行為相關(guān)的靶基因[32]。大麻素受體相互作用蛋白1（cannabinoid receptor-interacting protein 1,CNRIP1）已被證實(shí)和乳腺癌、食管癌的預(yù)后相關(guān)。新發(fā)現(xiàn)CNRIP1通過抑制丙酮酸激酶M2的活性來抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖，其持續(xù)過表達(dá)抑制了小鼠異種移植瘤的生長(zhǎng)。臨床上，CNRIP1與ICC患者的病理分級(jí)、TNM分期等相關(guān)。提示CNRIP1可作為預(yù)測(cè)ICC患者腫瘤復(fù)發(fā)的候選生物標(biāo)志物，強(qiáng)調(diào)了以CNRIP1/Parkin/PKM2通路為靶點(diǎn)治療ICC的潛在可行性[33]。

安羅替尼（Anlotinib）是一種新型的多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，已發(fā)現(xiàn)在多種實(shí)體瘤中具有良好的抗腫瘤作用。最近發(fā)現(xiàn)，安羅替尼具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及阻滯細(xì)胞周期的作用。在患者來源的人源腫瘤異種移植模型中，安羅替尼阻礙了裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。通過轉(zhuǎn)錄組及蛋白修飾分析，發(fā)現(xiàn)安羅替尼靶向血管表皮生長(zhǎng)因子2，通過抑制其磷酸化水平，進(jìn)而使PIK3/AKT信號(hào)通路失活，具有良好的抗ICC活性[34]。阻止AKT信號(hào)激活被認(rèn)為是提高索拉非尼和蘭瓦替尼等酪氨酸激酶抑制劑療效的一個(gè)策略。該研究結(jié)果可推動(dòng)安羅替尼作為索拉非尼等藥物增效劑的臨床試驗(yàn)。

EphA2是一個(gè)跨膜酪氨酸激酶受體，其相關(guān)基因在ICC中具有較高的突變頻率，并與ICC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在體外試驗(yàn)和患者來源的異種移植中，其靶點(diǎn)Ser897的磷酸化抑制劑可有效阻礙具有EphA2突變的ICC的轉(zhuǎn)移。提示對(duì)于同時(shí)具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及EphA2相關(guān)基因突變的患者，Ser897的磷酸化抑制劑可能具有一定的治療效果[35]。EphA2激活可分為配體依賴性途徑和非配體依賴性途徑。配體非依賴性途徑被認(rèn)為是致癌途徑，激活與表皮生長(zhǎng)因子受體靶向藥物的耐藥機(jī)制密切相關(guān)，可被其主要配體EPhinA1競(jìng)爭(zhēng)性抑制。對(duì)EphA2等進(jìn)一步研究可能會(huì)提高西妥昔單抗、厄洛替尼等靶向表皮生長(zhǎng)因子受體的單克隆抗體的療效。

3.3 信號(hào)通路抑制劑

臨床前與臨床試驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PI3K/PTEN/AKT/mTOR、Ras/RAF/MEK/ERK、Wnt、IL6/JAK/STAT等信號(hào)通路抑制劑在ICC細(xì)胞系、異種移植模型及患者中分別起到了不同程度的作用。Notch信號(hào)通路是ICC發(fā)生的主要驅(qū)動(dòng)力，其受體、配體和下游信號(hào)分子等均包含了潛在的治療靶點(diǎn)。近期一項(xiàng)國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，選擇性的NOTCH1抑制劑Crenigacestat顯著減少了五種ICC細(xì)胞系中的Notch通路成分，但不抑制其他Notch受體，并對(duì)Notch依賴性血管生成具有抑制作用。在研究者團(tuán)隊(duì)建立的ICC患者來源的異種移植模型中，Crenigacestat和吉西他濱具有相似的抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果，表明其作為一種ICC治療的潛在策略[36]。目前，針對(duì)Notch受體和配體的單克隆抗體、反義或RNA干擾和糖基化/蛋白酶抑制劑的研究不斷進(jìn)行，未來有望在Notch信號(hào)通路的不同水平中尋找到潛在的治療靶點(diǎn)。

4 其他潛在治療靶點(diǎn)

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染與ICC的發(fā)生密切相關(guān)。乙型肝炎病毒x蛋白（HBV x protein,HBx）作為反式激活蛋白與核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，刺激細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。HBV感染誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞激活，伴隨HBx激活引起的基因異常改變時(shí)，將導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化[37]。筆者單位近年來已對(duì)3243例ICC患者行手術(shù)治療，在對(duì)其中合并HBV感染的患者進(jìn)行的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，接受抗病毒治療的患者預(yù)后好于未接受抗病毒治療且病毒水平較高的患者，肝切除術(shù)后病毒重新激活與較差的預(yù)后相關(guān)。這項(xiàng)大型臨床研究的結(jié)果揭示HBV感染相關(guān)通路及靶點(diǎn)作為ICC預(yù)后預(yù)測(cè)因子以及治療靶點(diǎn)的潛力[37]。

5 總結(jié)

綜上所述，目前許多潛在的ICC輔助治療相關(guān)藥物仍處于臨床前或臨床研究階段，并取得了一些有希望的進(jìn)展。隨著近年來對(duì)ICC相關(guān)腫瘤微環(huán)境、基因、蛋白、表觀遺傳修飾、信號(hào)通路及其與HBV關(guān)系的研究不斷深入，潛在治療靶點(diǎn)不斷被發(fā)掘，基于這些靶點(diǎn)的臨床試驗(yàn)將會(huì)層出不窮，為這種高度惡性、預(yù)后不佳的腫瘤的治療帶來新曙光。