林逸楚 陳東來 丁啟峰 朱雪娟 朱蓉英 陳勇兵

肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）是非小細(xì)胞肺癌最常見的一種組織學(xué)類型，在肺癌中的占比達(dá)到了50%[1]。2011年國際肺癌研究協(xié)會、美國胸科學(xué)會及歐洲呼吸學(xué)會提出了新的LUAD國際多學(xué)科分類，按鏡下生長模式將LUAD主要分為鱗屑樣生長、腺泡型生長、乳頭型生長、微乳頭型生長和實體型生長[2]。隨著胸部薄層計算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）等篩查技術(shù)成為日常體檢項目，早期LUAD檢出率明顯升高，在影像學(xué)上可表現(xiàn)為亞實性結(jié)節(jié)（純磨玻璃結(jié)節(jié)和混合磨玻璃結(jié)節(jié)）和實性結(jié)節(jié)，其中亞實性結(jié)節(jié)多呈惰性生長，其患者預(yù)后往往優(yōu)于實性結(jié)節(jié)[3]。目前對于LUAD的早篩早診早治雖有所提高，但仍有近50%的術(shù)后患者會遭遇腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[4-6]。此外，尚有少數(shù)LUAD患者在發(fā)現(xiàn)時病程已進(jìn)入中晚期。隨著靶向治療和免疫治療的開展，已有不少患者從中獲益，但迄今為止個體的治療敏感性差異和腫瘤的獲得性耐藥仍是LUAD多學(xué)科干預(yù)過程中最為棘手的難題。因此，探究LUAD發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，明確LUAD對藥物治療的異質(zhì)性來源，可避免早期腫瘤的過度治療，有助于個體化精準(zhǔn)治療的開展。

單細(xì)胞測序是在單細(xì)胞水平上對細(xì)胞群體進(jìn)行特異性分析的一項技術(shù)，其流程主要包括單細(xì)胞分離、細(xì)胞溶解與基因組DNA獲取、全基因組擴(kuò)增、測序與數(shù)據(jù)分析4個方面[7,8]。流式細(xì)胞分選和激光捕獲顯微切割技術(shù)讓單細(xì)胞的捕獲成為可能[8-11]。目前主要采用基于條碼（barcode）的單細(xì)胞識別來實現(xiàn)單細(xì)胞測序，即給每個細(xì)胞加上特定的DNA序列，測序時攜帶相同barcode的序列則視作來自同一個細(xì)胞[7,12]。單細(xì)胞測序包括單細(xì)胞全基因組測序與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），可分別揭示基因組和轉(zhuǎn)錄組的變化，發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞亞型和基因，可用于存在高度異質(zhì)性的干細(xì)胞及胚胎發(fā)育早期的細(xì)胞群體的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的挖掘和亞細(xì)胞成分的基因表達(dá)譜的發(fā)現(xiàn)，與活細(xì)胞成像系統(tǒng)相結(jié)合，可在生理或病理情況下連續(xù)追蹤基因表達(dá)的動力學(xué)變化，從而監(jiān)測疾病的進(jìn)展[7-11]。scRNA-seq可以用最小的樣本開展無偏差高通量研究，測量基因表達(dá)水平更精確，在定量罕見變異和轉(zhuǎn)錄本時具有更高的靈敏度，其優(yōu)勢是全方位、多層次的。為使基礎(chǔ)研究人員和臨床醫(yī)師從微觀角度更好地加深對LUAD這種復(fù)雜疾病的認(rèn)知，本文就近年來scRNA-seq在LUAD中的應(yīng)用及研究進(jìn)展作一綜述。

1 scRNA-seq與LUAD的發(fā)生發(fā)展機(jī)制

1.1 早期LUAD的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）特殊性

1.1.1 早期LUAD與正常肺組織在單細(xì)胞水平上的差異Lavin等[13]通過結(jié)合多元組織成像和配對的scRNA-seq分析比較28例I期-III期LUAD、非侵襲性肺組織（adjacent normal lung tissues, nLung）和血液的免疫特征，發(fā)現(xiàn)與nLung和血液相比，早期LUAD中腫瘤病變部位積聚了更多的免疫細(xì)胞，T細(xì)胞富集程度更高，與單核巨噬細(xì)胞浸潤相關(guān)的CX3CL1表達(dá)水平略高，但是自然殺傷（natural killer, NK）細(xì)胞較少。質(zhì)譜流式技術(shù)結(jié)果表明腫瘤浸潤邊緣三級淋巴樣結(jié)構(gòu)富集，在此結(jié)構(gòu)中T淋巴細(xì)胞明顯增多，巨噬細(xì)胞明顯減少[13]。此外，不同表型T細(xì)胞在不同組織中分布不同，腫瘤部位的Treg細(xì)胞表達(dá)高水平的CTLA4、CD39、ICOS、41BB和低水平的CCR4，而細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞表達(dá)顯著降低，非功能性T細(xì)胞富集，故T-效應(yīng)因子/Treg比值降低，顆粒酶B和γ-干擾素（interferon γ, IFN-γ）的表達(dá)明顯減少，NK細(xì)胞細(xì)胞毒性較低[13]。scRNA-seq分析鑒定出三個不同的表達(dá)高水平主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex, MHC）II類分子的簇：CD1C、CCL22和CD207，推斷為樹突細(xì)胞（dentritic cell,DC）。與nLung和血液相比，腫瘤病變部位CD141+DC（CD207）顯著減少而CD1C+DC（CD1C）略有增加，因此CD1C+DC/CD141+DC比值增加[13]。而早期LUAD中腫瘤浸潤B細(xì)胞的IgGhigh亞群（漿細(xì)胞）具有通過產(chǎn)生免疫球蛋白抑制細(xì)胞生長的功能[13,14]。這與Lambrechts等[15]和Wu等[16]的研究結(jié)論一致。故scRNA-seq可探究LUAD患者不同組織間各成分之間的差異，從而發(fā)現(xiàn)LUAD的發(fā)展變化及特征，有助于發(fā)現(xiàn)新的候選生物標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)。

1.1.2 鱗屑樣生長的早期LUAD 既往研究已證實，含鱗屑樣成分的LUAD預(yù)后優(yōu)于不含有鱗屑樣成分的LUAD，且鱗屑樣成分在影像學(xué)上往往表現(xiàn)為亞實性、低密度的磨玻璃影[17,18]，這種成分作為一種非浸潤病變，惡性程度低、生長速度慢[20]。Lu等[19]對5例磨玻璃結(jié)節(jié)LUAD和5例實體LUAD進(jìn)行scRNA-seq揭示兩者腫瘤細(xì)胞及TME的異質(zhì)性、各亞型組成分布：磨玻璃樣LUAD的細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路和內(nèi)皮細(xì)胞中血管生成通路下調(diào)，成纖維細(xì)胞表達(dá)低水平膠原，T細(xì)胞免疫抑制途徑激活，B細(xì)胞富集，呈遞抗原，誘導(dǎo)激活NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞從而進(jìn)一步增強(qiáng)抑制腫瘤細(xì)胞增殖的免疫反應(yīng)。此外，Xing等[3]針對上述問題對16例亞實性肺腺癌手術(shù)切除樣本進(jìn)行scRNA-seq，結(jié)合6例nLung和9例進(jìn)展性肺腺癌（primary LUAD with lymph node metastasis, mLung）數(shù)據(jù)，揭示了亞實性肺腺癌TME的特征及發(fā)生發(fā)展特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)亞實性肺腺癌增殖相關(guān)途徑與代謝途徑上調(diào)，但處于nLung與mLung之間。而在免疫細(xì)胞方面，亞實性肺腺癌中效應(yīng)CD8+T細(xì)胞富集，缺乏耗竭CD8+T細(xì)胞，殺傷耗竭比和CD4+T細(xì)胞比例處于nLung與mLung之間，且CD16+NK細(xì)胞亞群富集，呈現(xiàn)出明顯的代謝紊亂和強(qiáng)烈的免疫監(jiān)視殺傷應(yīng)激狀態(tài)[3]。這一結(jié)論反映了各細(xì)胞亞型在TME中發(fā)揮的作用并不相同，因此通過scRNA-seq闡明不同TME成分細(xì)胞特異性分子的表達(dá)水平以及基因與細(xì)胞表型的關(guān)系，為預(yù)測腫瘤的性質(zhì)提供一定的參考。

1.1.3 早期表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變LUAD LUAD在年輕女性和從不吸煙的女性中發(fā)病率更高，值得注意的是，亞洲女性中LUAD中的EGFR突變普遍較高，可達(dá)40%-60%。有研究[21]對I期/II期EGFR突變LUAD樣本和5個腫瘤鄰近肺組織的共125,674個細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)早期LUAD樣本中肺常駐巨噬細(xì)胞是最豐富的基質(zhì)細(xì)胞群，高表達(dá)CD68但不表達(dá)CD11B，且白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）可誘導(dǎo)ELF3表達(dá)抑制，減弱2個LUAD細(xì)胞系A(chǔ)549（KRAS突變）和NCI-H1975（EGFR突變L858R）中核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）通路基因的激活，引起細(xì)胞凋亡。研究人員[21]檢測到一個同時表達(dá)效應(yīng)T細(xì)胞及其功能障礙標(biāo)志物的增殖亞型，該亞型內(nèi)的T細(xì)胞主要表現(xiàn)出衰竭和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特征。上述研究提示scRNA-seq可用于鑒定EGFR突變LUAD的新增殖亞型，并為在部分靶向藥干預(yù)患者中嘗試免疫療法提供了思路。

1.2 晚期LUAD 有研究[22]將轉(zhuǎn)移性LUAD接受酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）靶向治療前（TKI naive, TN）、治療期間（residual disease state, RD）及表現(xiàn)出獲得性耐藥的疾病進(jìn)展（progressive disease, PD）階段的腫瘤樣本進(jìn)行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)TME可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，且TME內(nèi)成分基因突變豐富且復(fù)雜，鑒定了一個額外的新致癌突變——EML4-ALK致癌基因重排。在晚期LUAD的TME中載脂蛋白2和質(zhì)膜微囊蛋白-1與肺癌生長遷移、進(jìn)展和抗凋亡有關(guān)，TME中幼稚B細(xì)胞減少，IgGhighB細(xì)胞增多，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[14,23]。轉(zhuǎn)移性LUAD腫瘤上皮細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞所共有的轉(zhuǎn)錄軌跡有明顯調(diào)節(jié)差異，研究人員觀察到一種有明確的腫瘤導(dǎo)向性（tumor-oriented）、侵襲性和異常增殖或凋亡特征的轉(zhuǎn)錄軌跡，這一轉(zhuǎn)錄軌跡的高表達(dá)與LUAD總生存率下降顯著相關(guān)[24]。轉(zhuǎn)移性LUAD中nLung的TME改變出現(xiàn)在病變早期，后期只是持續(xù)這種狀態(tài)：①腫瘤上皮細(xì)胞具有高度血管生成和免疫功能低下的特性；②肌成纖維細(xì)胞逐漸取代了腫瘤基質(zhì)中的基質(zhì)成纖維細(xì)胞；③單核源性巨噬細(xì)胞和DC（CD163+CD14+DC）擴(kuò)展并分化為總體抗炎表型；④B細(xì)胞被激活并在腫瘤組織中擴(kuò)增；⑤細(xì)胞毒性NK細(xì)胞減少，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加，衰竭T細(xì)胞表型晚期已經(jīng)擴(kuò)展到整個細(xì)胞毒性效應(yīng)群體[22,24]。基質(zhì)和免疫種群的這些變化共同將具有免疫能力的組織轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咭种菩訲ME。上述研究應(yīng)用scRNA-seq比較LUAD不同治療時間點(diǎn)TME的變化，對于了解LUAD發(fā)生發(fā)展機(jī)制、治療方案的療效及耐藥機(jī)制提供了參考。

2 scRNA-seq與LUAD患者生存、預(yù)后及其標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)

近期，一項研究通過對腫瘤細(xì)胞/正常上皮細(xì)胞和腫瘤T細(xì)胞/非腫瘤T細(xì)胞進(jìn)行基于scRNA-seq的差異表達(dá)的配體-受體對分析[28]，鑒定出LUAD腫瘤細(xì)胞中65個配體-受體對和T細(xì)胞中96個配體-受體對。研究者選擇其中11個可能顯著影響生存結(jié)果的配體-受體對基因建立機(jī)器學(xué)習(xí)模型以準(zhǔn)確預(yù)測LUAD患者的預(yù)后，并發(fā)現(xiàn)ITGB4、CXCR5和MET在預(yù)測模型中顯著影響對預(yù)后判斷的精準(zhǔn)度[28]。此外，還有研究人員[29]利用scRNA-seq檢測基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建風(fēng)險評分模型作為預(yù)測患者預(yù)后的工具，驗證了風(fēng)險評分模型riskScore是一個強(qiáng)大且獨(dú)立的預(yù)后生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險Score亞型T細(xì)胞抑制性因子p53信號通路和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的激活，這可能是該亞型的預(yù)后較差的原因。腫瘤干細(xì)胞的研究對LUAD的早期診斷與預(yù)后有重大意義，但大多數(shù)研究主要在腫瘤干細(xì)胞上而非腫瘤干性。有研究[30,31]通過scRNA-seq探究了腫瘤細(xì)胞干性指數(shù)（stemness index）及干性相關(guān)基因與患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與正常肺組織相比，LUAD中的mRNA干性指數(shù)更高，且晚期LUAD患者表現(xiàn)出更高的mRNAsi和較差的總體生存率；確定了8個差異表達(dá)的關(guān)鍵基因：HSPA4、CDCA7、CDC20、CDK1、CLIP1、CCNB1、H2AFX和BLM。其中CDC20、CDK1、CCNB1、H2AFX或BLM低表達(dá)的LUAD患者的總體生存率明顯好轉(zhuǎn)，而CLIP1低表達(dá)的總體生存率降低。此外，CDCA7的表達(dá)并不顯著影響LUAD患者的總體生存率[30]。發(fā)現(xiàn)并鑒定了15個共表達(dá)的干性相關(guān)基因，其表達(dá)可能會影響腫瘤發(fā)生、進(jìn)展，化學(xué)療法和免疫療法的療效以及臨床結(jié)果且其過度表達(dá)與LUAD中的免疫浸潤減少有關(guān)，癌癥干性與免疫力之間普遍存在負(fù)相關(guān)[31]。15個SRG可能在進(jìn)一步驗證后可用作潛在的候選生物標(biāo)志物，作為預(yù)后指標(biāo)和治療靶標(biāo)[31,32]。通過免疫評分與基質(zhì)評分，分析表達(dá)譜，確定5個基因（CCR6、ITK、CCR4、DOK2和AMPD1）為LUAD的預(yù)后因素。其中，AMPD1、ITK和DOK2的低表達(dá)與LUAD預(yù)后不良有關(guān)，CCR4是非小細(xì)胞肺癌總體生存率的獨(dú)立危險因素，而腫瘤細(xì)胞中CCR6高表達(dá)是LUAD患者具有良好預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素[32]，此外高表達(dá)KIF2C的LUAD患者的總體生存率顯著降低，“細(xì)胞周期信號傳導(dǎo)途徑”和“p53相關(guān)途徑”顯著富集，推測其可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期信號通路來預(yù)示不良預(yù)后[33]。因此，scRNA-seq可對差異表達(dá)的蛋白和基因等進(jìn)行進(jìn)一步分析與研究，發(fā)現(xiàn)新的基因特征、預(yù)后標(biāo)志物以及相互作用關(guān)系。

3 scRNA-seq與LUAD患者治療方案選擇、優(yōu)化及耐藥機(jī)制的探索

3.1 IFN-γ信號通路表達(dá)下調(diào)——凡德他尼（Vandetanib）潛在的耐藥機(jī)制 Vandetanib在RET重排的晚期非小細(xì)胞肺癌患者中有一定抗腫瘤作用，但療效未得到肯定[25]，故Ma和他的團(tuán)隊[26]用scRNA-seq探究LUAD免疫應(yīng)答相關(guān)基因的異質(zhì)性，比較LC2/ad（Vandetanib敏感）與LC2/ad-R（Vandetanib耐受）細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)LC2/ad富集了較高水平的MHC II基因與IFN-γ信號通路共表達(dá)基因，但LC2/ad-R內(nèi)IFN-γ信號通路失協(xié)調(diào)表達(dá)且MHC II基因表達(dá)水平較低，發(fā)現(xiàn)一種Vandetanib耐藥的可能機(jī)制：IFN-γ信號通路失協(xié)調(diào)表達(dá)并表達(dá)較低水平的MHC II基因，即MHC II和IFN-γ信號通路共同決定了免疫治療耐藥性的形成。

3.2 基因缺失介導(dǎo)的耐藥機(jī)制 Maynard等[22]通過對PD腫瘤樣本分析提出了靶向治療的可能耐藥機(jī)制，并證明腫瘤在治療后異質(zhì)性更為明顯，檢測到KRAS基因上新的突變（G13、G12C突變），提出腫瘤驅(qū)動基因缺失是一種可能的耐藥機(jī)制；同時發(fā)現(xiàn)PD與TN、RD相比，參與Kynurenine通路的IDO1、KYNU和QPRT基因的表達(dá)顯著增加，導(dǎo)致免疫抑制和免疫逃逸，可直接抑制免疫系統(tǒng)活性出現(xiàn)耐藥。靶向治療或免疫治療后復(fù)發(fā)的LUAD可轉(zhuǎn)變?yōu)榉西[癌，原先對靶向藥物敏感的LUAD出現(xiàn)耐藥性正是由于腺癌轉(zhuǎn)變?yōu)轺[癌。故Marynard等[22]獲取并檢測了一個具備EGFR外顯子19缺失癌基因突變且使用EGFR抑制劑奧西替尼治療的患者（TH226）在TN、RD與PD 3個治療時間點(diǎn)的原發(fā)腫瘤部位樣本，分析發(fā)現(xiàn)許多與鱗狀細(xì)胞分化相關(guān)的基因（KRT16、KRT14、KRT6A、KRT5、CLCA2、PKP1、ANXA8、DSG3）在PD階段比TN和RD階段表達(dá)水平高，活檢樣本表明腫瘤由之前單純的腺癌組織形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)轺[癌樣生長，故致使藥物療效不佳，產(chǎn)生“耐藥”。因此，scRNA-seq不僅能夠監(jiān)測癌癥藥物治療過程中產(chǎn)生的生物分子和組織特性，還可以提供高分辨率的基因和通路水平視圖，了解TME的變化及耐藥機(jī)制，進(jìn)一步指導(dǎo)治療方案。

3.3 TME中與耐藥形成有關(guān)的其他因子 劉亞飛等[23]對TME分析發(fā)現(xiàn)，在晚期LUAD單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7（insulin like growth factor binding protein 7, IGFBP7）表達(dá)下調(diào)能逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞對EGFR-TKI的敏感性并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，故推論出IGFBP7參與腫瘤細(xì)胞對EGFR-TKI耐藥過程。除IGFBP7外，簇集蛋白、不均一核糖核蛋白A0和載脂蛋白2也與耐藥性的形成有關(guān)。

免疫療法在LUAD治療中顯示出不同的療效，且常出現(xiàn)治療不徹底現(xiàn)象，這可能是由于腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境的異質(zhì)性所致。Guo等[27]對未接受過治療的11例LUAD患者和3例肺鱗癌患者的12,346個腫瘤細(xì)胞，鄰近正常組織和外周血的T細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)不同組織中的T細(xì)胞組成與比例不同，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞具有異質(zhì)性，主要分為兩大類：一類是“預(yù)衰竭”CD8+T細(xì)胞、未激活的Tregs和激活的CD4+T細(xì)胞；一類是衰竭T細(xì)胞和激活的Tregs；其中前者預(yù)后明顯好于后者[27]。由此可知，通過scRNA-seq解讀TME的異質(zhì)性，對于“預(yù)衰竭”細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)有利于患者分層，選擇合適的免疫療法。

4 討論與展望

LUAD的腫瘤相關(guān)死亡率高，早診早治是降低死亡率的重要手段，但是僅從放射影像學(xué)或組織病理學(xué)上進(jìn)行精準(zhǔn)分型難以實現(xiàn)，而scRNA-seq在分型方面具有更高的精準(zhǔn)度，可在分子水平上對LUAD微環(huán)境和各類細(xì)胞進(jìn)行檢測?？紤]到現(xiàn)有的腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node metastasis, TNM）分期系統(tǒng)分期在評估個體預(yù)后方面仍存在較大局限性，基于TME的免疫評分作為一種用于定量病變區(qū)域免疫細(xì)胞浸潤的預(yù)后指標(biāo)，對補(bǔ)充TNM分期具有良好潛力[34]。既往多項研究[3,13,21,22]表明LUAD有一種獨(dú)立于TNM分期的預(yù)后相關(guān)免疫特征，利用scRNA-seq對TME中免疫細(xì)胞進(jìn)行檢測，有利于建立免疫分期和生存預(yù)測模型，改進(jìn)TNM分期系統(tǒng)，進(jìn)一步指導(dǎo)醫(yī)療決策。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，在LUAD中微乳頭和實性成分與更高的復(fù)發(fā)率相關(guān)[35]，而STAS陽性和淋巴結(jié)包膜外侵犯與更差的預(yù)后相關(guān)[36]，因此我們可以利用scRNA-seq對具有上述病理特征的LUAD進(jìn)行TME解析，進(jìn)而指導(dǎo)輔助治療方案。

雖然scRNA-seq比RNA測序更精確，能檢測到微量的基因表達(dá)子或罕見非編碼RNA，技術(shù)有很大進(jìn)展，但其覆蓋率仍低，且細(xì)胞分離過程中可發(fā)生轉(zhuǎn)錄表達(dá)，大多數(shù)scRNA-seq數(shù)據(jù)集都有一定程度的污染。此外，細(xì)胞分離難易程度不一且有些細(xì)胞易被酶解和（或）機(jī)械破壞殺死，故產(chǎn)生的單細(xì)胞懸浮液很少能按比例代表許多起始細(xì)胞類型。最近發(fā)展的單分子測序技術(shù)無需逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增步驟而直接對單個細(xì)胞的全長mRNAs進(jìn)行測序，從而準(zhǔn)確地檢測基因不同亞型的表達(dá)水平，但高覆蓋率、高保真性及高特異性的擴(kuò)增及技術(shù)產(chǎn)生的誤差仍然是亟待解決的問題。另外，各種數(shù)據(jù)分析軟件（如Seurat、Sincera、NMF、ReF、RC、SCell等）對scRNA-seq的數(shù)據(jù)處理有重大意義，但對大量數(shù)據(jù)結(jié)果的專業(yè)分析仍是一個重大的挑戰(zhàn)[27]。最后，目前高昂的價格亦限制了scRNA-seq的廣泛應(yīng)用。

綜上所述，scRNA-seq有利于對各類LUAD的微環(huán)境解析及分子分型，建立免疫分期及預(yù)后模型，完善LUAD分期，制定最佳治療方案。但scRNA-seq的廣泛使用仍有很長的路要走，急需提高基因覆蓋率和保真性，減少技術(shù)誤差，發(fā)展技術(shù)手段和數(shù)據(jù)測試處理平臺。