沈誠 李玨 李佳龍 車國衛(wèi)

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）是分布在腫瘤細(xì)胞周圍的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)，是指腫瘤基質(zhì)中的各種細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞以及附近區(qū)域的間質(zhì)和浸潤(rùn)在其中的生物分子等組成的胞外環(huán)境[1,2]。腫瘤細(xì)胞是“種子”，其周圍的細(xì)胞及非細(xì)胞組份構(gòu)成“土壤（腫瘤微環(huán)境）”，因“土壤”和“種子”特殊的內(nèi)在關(guān)系，“腫瘤微環(huán)境”現(xiàn)已成為腫瘤精準(zhǔn)治療研究的關(guān)鍵靶點(diǎn)[3]。

近年來，國內(nèi)外相關(guān)專家學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在組織創(chuàng)傷與炎癥修復(fù)過程中同樣存在著成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換[4]。通常情況下研究者認(rèn)為，癌細(xì)胞分泌的因子為了營造腫瘤微環(huán)境，即為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)營造一個(gè)合適的微環(huán)境，常常促進(jìn)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的發(fā)生[5]。作為構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵要素，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）不但與正常成纖維細(xì)胞密切相關(guān)，而且可以分泌多種物質(zhì)參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)控[6]。近年來研究[7]提示，CAFs分泌的物質(zhì)中就包括外泌體，該種物質(zhì)一方面能夠通過營造適合腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境而使癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移與侵襲能力，另一方面還能夠介導(dǎo)腫瘤免疫抑制，從而在一定程度上推動(dòng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本文就CAFs來源相關(guān)外泌體在肺惡性腫瘤中的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展做一綜述。

1 CAFs概述

1.1 CAFs的來源 關(guān)于CAFs的來源[8-10]，就現(xiàn)階段已發(fā)表的研究成果來看，主要有以下幾種來源：①在癌細(xì)胞分泌的血小板衍生因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β, TGF-β）等各種細(xì)胞因子作用下，由常駐成纖維細(xì)胞，即剩余正常間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成；②骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。它被視為CAF 前體細(xì)胞的一種；③血管外膜細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞；④上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition, EMT），如TGF-β1能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞；⑤脂肪細(xì)胞。據(jù)有關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中存在著大量脂肪細(xì)胞，其中脂肪干細(xì)胞直接與腫瘤細(xì)胞相互作用從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞的分化?？傊?，通過對(duì)不同CAFs起源的認(rèn)識(shí)，可以促進(jìn)和幫忙我們了解不同的CAFs的表型和功能。

1.2 CAFs異質(zhì)性 據(jù)研究成果表明，細(xì)胞表型的差異是CAFs異質(zhì)性的主要體現(xiàn)，具體來講，CAFs表型轉(zhuǎn)換具有兩種特性：其一為時(shí)相性，主要反映在腫瘤發(fā)展階段與表型轉(zhuǎn)換密切相關(guān)；其二為空間特性，一方面是指癌組織不同部位的成纖維細(xì)胞具有不同的表型，另一方面是同一成纖維細(xì)胞在組織內(nèi)各種部位的差異化表型體現(xiàn)[11]。同時(shí)，隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，在單細(xì)胞水平上定量分析細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的差異成為可能。研究者利用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)，在小鼠乳腺癌模型中，按照CAFs亞群的基因可將其分為以下四群[12]：①mCAF亞群，其由常駐組織成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換而來；②dCAF亞群，其來源于腫瘤上皮間質(zhì)；③vCAF亞群，其由血管周細(xì)胞轉(zhuǎn)換而來；④cCAF亞群，其與vCAF重疊，與此同時(shí)還具有較強(qiáng)的增殖能力。

1.3 CAFs的功能及作用 CAFs可以通過建立并重塑細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，使腫瘤細(xì)胞易于侵入血管[13]；通過分泌多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子，CAFs可與腫瘤細(xì)胞或其他基質(zhì)細(xì)胞相互作用，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[14]。同時(shí)，CAFs也被認(rèn)為是開發(fā)新型抗癌藥物的重要靶標(biāo)[15]。其主要作用包括：①CAFs可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生；②CAFs促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；③CAFs可以促進(jìn)腫瘤血管的生成；④CAFs促進(jìn)腫瘤的耐藥。

2 外泌體概述

作為一種細(xì)胞外細(xì)胞器，細(xì)胞外囊泡主要來源于真核細(xì)胞，首次提及則是在1983年Gurunathan等[16]研究網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟的過程中發(fā)現(xiàn)了一種和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相關(guān)的膜型囊泡（vesicles）被分泌到細(xì)胞外，并于4年后在超速離心下獲得。其主要包括外泌體（exosomes）、脫落微泡（shed microvesicle, SMV）和凋亡小體（apoptosis body, AB）三種，而外泌體是其中最為重要的一種[17]。有文獻(xiàn)[18]指出，外泌體一方面能夠通過營造適合肺癌發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境而使癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移與侵襲能力，另一方面還能夠介導(dǎo)腫瘤免疫抑制，從而在一定程度上推動(dòng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。除此之外，外泌體在惡性腫瘤微環(huán)境中，與肥大細(xì)胞、惡性細(xì)胞等互相交互攝取并將外泌體攜帶的諸多成分轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，還可靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞中mRNA、蛋白等水平，改變細(xì)胞的生物學(xué)特性[19]。

2.1 外泌體的提取與分離 外泌體分離方法一般是基于其物理化學(xué)特性，包括大小、密度、質(zhì)量、表面蛋白等特點(diǎn)。常見的方法包括了超速離心法、蔗糖密度梯度離心法、商品化試劑盒沉淀法、聚合物沉淀法、免疫磁珠法和微流控芯片法[20,21]。

超速離心法分離外泌體是目前最普遍的一種方法，但在分離過程中，由于超高速離心，外泌體的結(jié)構(gòu)、功能很容易遭到破壞，對(duì)結(jié)果分析產(chǎn)生不利；蔗糖密度梯度離心法是超速離心法的改進(jìn)與優(yōu)化，但依然存在和超速離心法相類似的結(jié)果[17,22]。商品化試劑盒沉淀法不僅操作簡(jiǎn)便，同時(shí)也不需要特殊的設(shè)備，然而市面上目前有的商品化試劑盒價(jià)格較為昂貴，不利于大批量提取外泌體[17,22]。聚合物沉淀法操作過程雖然不涉及大型昂貴儀器設(shè)備的協(xié)助，但易受到共沉淀的其他物質(zhì)的污染，影響下游分析[23,24]。免疫磁珠法分選具有特異性強(qiáng)、純度較高、不影響外泌體結(jié)構(gòu)形態(tài)的特點(diǎn)，但是其仍存在效率低，磁珠費(fèi)用高昂的缺點(diǎn)，難以普及[23]。近年來利用微流控芯片來分離外泌體得到眾多學(xué)者的關(guān)注[25]。一方面，微流控技術(shù)能夠分離小體積樣品中的外泌體，有助于臨床前腫瘤小動(dòng)物模型試驗(yàn)的研究；另一方面，微流體技術(shù)自動(dòng)化程度高，所需樣品量小，相較于超速離心法更適合臨床應(yīng)用。

2.2 外泌體的生物學(xué)特點(diǎn) 在經(jīng)過一系列調(diào)控過程如“內(nèi)吞-融合-外排”等后，細(xì)胞能夠形成30 nm-150 nm大小的囊泡，此即為外泌體，無論是在正常的生理?xiàng)l件下，還是在病理?xiàng)l件下，外泌體都能產(chǎn)生，在電子顯微鏡下外泌體呈現(xiàn)典型的50 nm-100 nm杯狀或蝶形脂質(zhì)雙分子膜結(jié)構(gòu)[26]。相關(guān)研究[27,28]結(jié)果表明，外泌體具有熱休克蛋白70、凋亡相關(guān)基因-2（apoptosis-linked gene-2, ALG-2）相互作用蛋白X、四次跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）、腫瘤易感基因101蛋白等特定的表面分子特征，同時(shí)其存在于幾乎所有的人體液體中。

2.3 外泌體的生物學(xué)功能 外泌體含有多種蛋白質(zhì)、核酸、甚至病毒等遺傳物質(zhì)，這些內(nèi)含物可以通過外泌體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，能調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)和信號(hào)通路的改變，在細(xì)胞間物質(zhì)和信息轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[29,30]，主要包括：①外泌體能作為信號(hào)復(fù)合物通過受體介導(dǎo)對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生直接的刺激作用；②可將多種活性生物成分如細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)受體細(xì)胞轉(zhuǎn)換過程以及發(fā)揮其改變細(xì)胞功能狀態(tài)的作用，這一系列過程是通過影響靶細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、翻譯，調(diào)節(jié)其信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。此外，外泌體還具有免疫調(diào)節(jié)等功能。

3 CAFs與肺癌的相關(guān)性

CAFs可以通過建立并重塑細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，促使腫瘤血管的生成。研究[31]發(fā)現(xiàn)CAFs與新生血管相關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal derived factor 1, SDF-1）有密切相關(guān)性，其可以募集內(nèi)皮祖細(xì)胞來促進(jìn)血管的生成。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，CAFs也起到至關(guān)重要的角色。CAFs中高表達(dá)的白細(xì)胞介素6可以激活肺癌細(xì)胞Janus激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3信號(hào)通路，促進(jìn)肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，上調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因如基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)，從而明顯地增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能和活性[32]。此外，CAFs也促進(jìn)肺癌的耐藥和免疫。CAFs促進(jìn)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549產(chǎn)生胰島素樣生長(zhǎng)因子-2來介導(dǎo)耐藥[15]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-11在順鉑治療后的肺腺癌患者癌灶內(nèi)受到上調(diào)的作用，進(jìn)一步激活抗凋亡途徑及肺癌細(xì)胞耐藥性[33]。結(jié)果還表明，白細(xì)胞介素-11高表達(dá)的患者對(duì)順鉑的反應(yīng)較低表達(dá)的患者差。

4 外泌體與肺癌的相關(guān)性

外泌體在肺癌微環(huán)境形成的方面有促進(jìn)作用，同時(shí)還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[34]。伴隨著癌基因的不穩(wěn)定性，低氧、酸中毒等因素的影響以及炎癥免疫反應(yīng)等誘因均能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞釋放外泌體形成腫瘤微環(huán)境。此外，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可以調(diào)控其自身的免疫狀態(tài)。參與的主要機(jī)制是通過攜帶免疫抑制因子并抑制免疫細(xì)胞發(fā)揮的抗腫瘤免疫效應(yīng)，誘導(dǎo)免疫抑制和調(diào)節(jié)細(xì)胞群，例如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞等[35,36]。此外，外泌體也參與免疫逃逸作用，主要是通過轉(zhuǎn)導(dǎo)特定蛋白和RNA進(jìn)入受體細(xì)胞來進(jìn)行發(fā)揮[37]。因此，外泌體可通過多途徑參與肺癌的發(fā)生和發(fā)展。

在肺癌診斷中外泌體RNA和蛋白質(zhì)也有一定作用。肺癌患者中，外泌體RNA水平明顯高于健康者，且RNA水平與肺癌的進(jìn)展程度、生存率都有密切關(guān)系[38]。研究發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中肺癌來源的外泌體相關(guān)的miRNA等對(duì)診斷有較高價(jià)值[38,39]。肺癌細(xì)胞來源的外泌體中富集多種蛋白質(zhì)成分，在肺癌發(fā)生發(fā)展方面有明顯促進(jìn)作用，可能是早期診斷肺癌的有效方法和途徑。

外泌體在肺癌治療中也有一定意義。目前肺癌的治療包括了手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療、分子靶向治療，但針對(duì)不同時(shí)期的肺癌患者所采用的各種治療方式均存在局限性，同時(shí)肺癌患者存在早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移可能的特點(diǎn)，導(dǎo)致患者預(yù)后往往較差。研究發(fā)現(xiàn)，基于外泌體的研究可為肺癌患者的治療帶來新希望。外泌體不僅在化療藥物的敏感性方面有增強(qiáng)作用，同時(shí)還可以抑制癌基因的表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，因此其成分和功能也為肺癌的治療提供多個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。研究[40]發(fā)現(xiàn)在肺腺癌中，癌細(xì)胞來源的外泌體所包含的miR-181a能增加肺腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇和鉑類化療的敏感性。通過使用酶抑制劑和去甲基化藥物可降低癌細(xì)胞來源的外泌體所包含的miR-512和miR-373活性，繼而增加肺癌細(xì)胞對(duì)鉑類的化療敏感性[41]。

5 CAFs來源的外泌體在肺癌中的作用

肺癌作為一種高度致死性的惡性腫瘤，占所有新增癌癥病例的13.2%，占所有癌癥相關(guān)死亡的25.9%。外泌體的組成較為復(fù)雜，通過進(jìn)入血液循環(huán)，而后被靶細(xì)胞吸收，從而調(diào)節(jié)靶細(xì)胞基因表達(dá)和細(xì)胞功能。此外，外泌體相關(guān)的miRNA作為短單鏈和非編碼RNA分子，調(diào)節(jié)致癌基因或抑癌基因的表達(dá)，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)。

肺癌細(xì)胞來源的外泌體在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的報(bào)道較多[7,42-44]，而有關(guān)肺癌CAFs來源的外泌體研究報(bào)道較少。You等[45]利用對(duì)照培養(yǎng)基的方式，采用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)手段對(duì)肺癌細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAFs可通過釋放的外泌體來促進(jìn)肺癌細(xì)胞中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）。類似的結(jié)果在Yang等[46]研究中有報(bào)道，CAFs來源的外泌體包含有高表達(dá)的miR-210，同時(shí)其通過靶向UPF1來激活PTEN/PI3K/AKT通路以促進(jìn)EMT，從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的遷移、增殖和侵襲能力。同時(shí)，CAFs分泌的外泌體中SNAI1水平與CAFs中的SNAI1表達(dá)有相關(guān)性。此外，外泌體中SNAI1的水平對(duì)于誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞中的EMT起重要促進(jìn)作用。用外泌體釋放抑制劑GW4869處理CAFs后可明顯抑制它們對(duì)受體上皮細(xì)胞的EMT誘導(dǎo)作用。Guo等[47]研究發(fā)現(xiàn)肺鱗癌CAFs來源的外泌體中miR-369對(duì)肺鱗癌細(xì)胞遷移，侵襲和腫瘤發(fā)生有相關(guān)性，miR-369可能是肺鱗癌重要的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

6 展望

在腫瘤微環(huán)境中，CAFs是肺癌基質(zhì)內(nèi)的重要細(xì)胞成分，外泌體是多種細(xì)胞間的溝通工具，CAFs和腫瘤來源的外泌體研究較為廣泛。但是，CAFs來源的外泌體在惡性腫瘤中的作用機(jī)制依然缺乏深入研究，尤其是在肺癌的相關(guān)研究中相對(duì)空缺。因此，有關(guān)CAFs來源的外泌體研究有著廣闊的前景，深入研究肺癌微環(huán)境、CAFs和與之相關(guān)來源的外泌體三者間的關(guān)系，將更有利于了解肺部惡性腫瘤的惡性進(jìn)程、耐藥等作用機(jī)制，從而造福更多的患者。