王蕓 王郁陽 姜曼 趙月妹 張曉春

肺癌是世界上與癌癥相關(guān)死亡的最常見原因，而非小細胞肺癌占原發(fā)性肺惡性腫瘤的80%左右，只有腫瘤完全切除的患者才有很大的機會增加生存率，但是多達30%的I期疾病患者術(shù)后會復(fù)發(fā)[1]。肺癌的發(fā)生、發(fā)展與宿主的細胞免疫、適應(yīng)性免疫和固有免疫密切相關(guān)，其中以T淋巴細胞為主導(dǎo)的細胞免疫在抗腫瘤的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[2]。腫瘤微環(huán)境的免疫抑制性降低了淋巴細胞的浸潤，導(dǎo)致機體免疫功能紊亂，有利于腫瘤細胞的免疫逃逸，因此淋巴細胞亞群的變化可用于監(jiān)測和判斷腫瘤患者的病情與預(yù)后[2]。

免疫治療已成為系統(tǒng)性癌癥治療的額外選擇，而且往往是更好的選擇。程序性死亡受體1（programmed death 1, PD-1）在活化的T細胞、B細胞和骨髓細胞中表達[3]。在正常情況下，PD-1與其配體（programmed cell death ligand 1, PD-L1）的結(jié)合可拮抗主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex, MHC）-CD3介導(dǎo)的T細胞活化途徑，防止由于T細胞過度活化而引起的組織損傷和炎癥，因此腫瘤細胞通過高表達PD-L1來逃避T細胞的殺傷作用[3,4]。PD-1抑制劑與免疫檢查點結(jié)合，可以重新激活T細胞的免疫反應(yīng)以及抑制免疫抑制性調(diào)節(jié)性T細胞，進一步激活宿主免疫系統(tǒng)以識別、攻擊和根除腫瘤細胞，已被認為是臨床治療中一種有前途且有效的策略[3,5]。該療法已顯示出在治療肺癌方面的持續(xù)臨床反應(yīng)，但療效各不相同，部分取決于腫瘤浸潤淋巴細胞的數(shù)量和性質(zhì)，目前應(yīng)用于非小細胞肺癌治療的帕博利珠單抗受到廣泛關(guān)注[5]。因此，本文通過分析帕博利珠單抗治療的非小細胞肺癌患者的外周血中淋巴細胞亞群變化以及治療過程中不同療效患者外周血淋巴細胞亞群的變化，討論應(yīng)用帕博利珠單抗治療對非小細胞肺癌患者外周血淋巴細胞亞群的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月-2020年12月至青島大學(xué)附屬醫(yī)院及濰坊市人民醫(yī)院就診的32例II線單藥應(yīng)用PD-1免疫抑制劑帕博利珠單抗的非小細胞肺癌（IV期）病例為觀察組。本次研究的所有病例都經(jīng)過病理學(xué)明確診斷，其中肺鱗癌25例，肺腺癌7例，在本次研究的非小細胞肺癌患者中，PD-1表達均為陽性。與此同時，選取了30例同期健康查體人員作為對照組，兩組的基線數(shù)據(jù)見表1。

表1 患者臨床特征Tab 1 Clinical characteristics of patients

1.2 排除標準 免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾病的患者；近期存在明顯感染的患者；無可測量病灶的癌癥患者。

1.3 研究方法

1.3.1 檢測方法 所有患者采集靜脈血2 mL，DETA-K2抗凝，進行外周血淋巴細胞亞群的檢測。采集操作均由經(jīng)驗豐富的檢驗科技師完成。

1.3.2 近期療效觀察 根據(jù)實體瘤療效評價標準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST）1.1指南，療效標準為：完全緩解（complete response,CR）：所有目標病灶完全消失；部分緩解（partial response, PR）：所有可測量的目標病灶的直徑總和低于基線≥30%；疾病穩(wěn)定（stable disease, SD）：基線病灶直徑總和有縮小趨勢，但是未達到PR的標準，或有增加但是未達到疾病進展（progressive disease, PD）的評價標準；PD：目標病灶的直徑總和增大20%超過基線或者出現(xiàn)新的病灶。本文中所有患者的療效評價均通過影像資料參照療效評價標準進行評價。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 22.0及GraphPad Prism 8.4.3對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用χ2檢驗，計量資料用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，比較用t檢驗，同時用Logistic回歸行多因素分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組帕博利珠單抗治療前淋巴細胞亞群水平與對照組淋巴細胞亞群水平比較 觀察組32例非小細胞肺癌患者治療前的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+指標較對照組明顯下降（P＜0.05），CD8+水平明顯增高（P＜0.05）。同時，比較了吸煙與非吸煙者之間淋巴細胞亞群的變化差異，發(fā)現(xiàn)無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。可見，非小細胞肺癌患者機體處于免疫抑制狀態(tài)，免疫功能較健康對照組低。

2.2 觀察組患者治療前后的淋巴細胞亞群變化 觀察組32例患者免疫治療前與治療1個周期后淋巴細胞亞群水平比較，結(jié)果顯示治療1個周期后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+數(shù)值雖然較治療前升高，CD8+指標較治療前稍有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療2周期后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+數(shù)值較治療前升高（P＞0.05），差異無統(tǒng)計學(xué)意義，CD8+指標較治療前下降（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；治療4個周期后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+數(shù)值較治療前得到顯著改善（P＜0.05），CD8+指標較治療前明顯下降（P＜0.05）。患者行4個周期的治療后外周血淋巴細胞亞群得到明顯改善，比較各周期淋巴細胞亞群的變化差異發(fā)現(xiàn)，第2周期治療后淋巴細胞亞群的變化與第1周期治療后相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），第4周期治療后淋巴細胞亞群的變化與第1周期治療后相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2），而第4周期治療后淋巴細胞亞群的變化與第2周期治療后相比較差異沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本文以CD3+、CD8+變化為代表繪制了變化圖，見圖1。

圖1 免疫治療過程中CD3+（A）、CD8+（B）T淋巴細胞的變化趨勢Fig 1 The change trend of patients' CD3+ (A) and CD8+ (B) T lymphocyte subsets during immunotherapy, T briefly represents the period; response means SD/PR, non-response means PD.

表2 第1、4周期治療后淋巴細胞亞群的變化Tab 2 Changes of lymphocyte subsets after the first and fourth cycles of immunotherapy

2.3 觀察組患者帕博利珠單抗療效與T淋巴細胞亞群變化的情況 觀察組32例非小細胞肺癌患者中，進行帕博利珠單抗治療后第4周期后達到SD、PR的患者均為24例，占總觀察人數(shù)的75%，達到PD的患者人數(shù)為8例，占總觀察人數(shù)的25%。結(jié)果顯示：第4周期免疫治療后，療效達到SD/PR患者的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+數(shù)值較治療前升高（P＜0.05），CD8+指標較治療前下降（P＜0.05）；療效達到PD患者的淋巴細胞亞群變化，較治療前沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表3。PD-L1的表達陽性的患者與PD-L1表達陰性患者的免疫治療治療效果未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），肺鱗癌與肺腺癌患者在應(yīng)用免疫治療后的效果也未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表4。

表3 第4周期治療后不同療效患者的淋巴細胞亞群比較Tab 3 Changes in the relationship between lymphocyte subsets after the four cycle of immunotherapy

表4 不同療效患者的臨床特征Tab 4 Clinical characteristics of patients

本文通過應(yīng)用Logistic回歸對多因素分析并繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD3+、CD4+、CD8+淋巴細胞對免疫治療效果具有一定的預(yù)測作用。

圖2 第4周期治療后CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴細胞的ROC曲線Fig 2 The ROC curve of CD3+/CD4+/CD8+ T lymphocyte after the fourth cycle of immunotherapy. ROC: receiver operating characteristic curve.

3 討論

腫瘤的防治一直是醫(yī)學(xué)研究的重要方向。近年來，通過免疫治療調(diào)動機體免疫系統(tǒng)，達到清除并殺滅腫瘤細胞的治療方式取得了突破性進展。人體的免疫系統(tǒng)主要包括天然免疫和由體液免疫、細胞免疫組成的獲得性免疫，其中細胞免疫被認為是機體抗腫瘤免疫的主要方式[6]。淋巴細胞大量浸潤是細胞免疫發(fā)揮抗腫瘤反應(yīng)的核心，同時也是免疫治療發(fā)揮作用的細胞學(xué)基礎(chǔ)[6]。因此，淋巴細胞亞群的監(jiān)測對腫瘤的預(yù)防、診斷和藥物療效的判斷具有重要的指導(dǎo)意義。淋巴細胞亞群中，根據(jù)其表面的標志物及生物學(xué)特性可以分為：T淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷（natural killer, NK）細胞，其中T淋巴細胞亞群是是淋巴細胞亞群的主要免疫應(yīng)答形式[7]。T淋巴細胞的特有分子標志為CD3，存在于所有T淋巴細胞的表面，將其進一步細分可分為CD4+T和CD8+T細胞，其中CD4+輔助/誘導(dǎo)T細胞在抗腫瘤的免疫過程中處于核心地位，其分泌的細胞因子不僅對細胞免疫有正向增強作用，而且能促進B細胞的增殖，有利于抗體的產(chǎn)生，輔助體液免疫發(fā)揮抗腫瘤作用；CD8+T細胞有兩種表型一種是CD8+/CD28+，具有細胞毒作用，另一種是CD8+/CD28+，具有抑制作用[7,8]。研究[7]表明，CD8+T細胞不僅對抗原呈遞細胞有一定的細胞毒作用，而且其產(chǎn)生的抑制性的細胞因子，能負反饋抑制CD4+T淋巴細胞的表達，對體液免疫和細胞免疫有抑制作用，因此CD8+T細胞的增多為腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移提供了條件。在正常情況下，CD4+/CD8+的比值處于相對平衡狀態(tài)以維持機體的正常免疫反應(yīng)，比值下降時說明機體的細胞免疫功能下降，對腫瘤細胞的殺傷作用減弱，使患者機體處于免疫抑制狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康查體的對照組相比較，所觀察的腫瘤患者于治療前CD3+、CD4+、CD4+/CD8+指標的計數(shù)較對照組明顯下降，CD8+T淋巴細胞水平明顯增高，這與Yan和吳珊珊研究的結(jié)果[8,11]相一致。T淋巴細胞亞群指標的變化，提示惡性腫瘤患者的細胞免疫處于免疫抑制狀態(tài)，機體的正向免疫細胞數(shù)量減少，負向免疫細胞增加，體內(nèi)細胞免疫功能急劇下降，免疫抑制因子過度表達，免疫抑制微環(huán)境由此形成，這為腫瘤細胞的免疫逃逸和惡性增殖創(chuàng)造了條件。

本研究結(jié)果還顯示，在帕博利珠單抗治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+指標數(shù)值較治療前出現(xiàn)明顯升高現(xiàn)象，CD8+T細胞指標數(shù)值較治療前顯著降低，證明帕博利珠單抗可能在一定程度上緩解了機體的免疫抑制狀態(tài)，對機體的免疫系統(tǒng)具有正向調(diào)節(jié)作用，促進了機體免疫細胞的激活，增強機體的抗腫瘤作用。同時觀察還發(fā)現(xiàn)治療第1周期的淋巴細胞亞群較治療前的變化不具有統(tǒng)計學(xué)差異，第2周期僅CD8+的變化有統(tǒng)計學(xué)意義，而第4周期變化差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與免疫治療起效過程緩慢有關(guān)。

與此同時，本研究還比較了帕博利珠單抗治療后療效評價為SD/PR患者的淋巴細胞亞群變化與療效達到PD患者的淋巴細胞亞群變化，發(fā)現(xiàn)在治療后第4周期，療效達到SD/PR患者的淋巴細胞亞群恢復(fù)效果好，但是治療后療效達到PD患者的淋巴細胞亞群變化較治療前沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)果提示，非小細胞肺癌患者接受帕博利珠單抗治療后，治療療效好的患者的機體免疫抑制狀態(tài)得到了顯著改善，T淋巴細胞浸潤增加，抗腫瘤的免疫抑制細胞數(shù)目也出現(xiàn)下降，增強了機體抗腫瘤免疫反應(yīng)，有利于腫瘤患者預(yù)后和生存；治療效果不佳的患者體內(nèi)的免疫功能未能得到有效的恢復(fù)。同時本文通過比較PD-L1不同表達及不同病理學(xué)類型患者的療效顯示，PD-L1表達及病理學(xué)類型對免疫治療效果的影響不明顯。通過進行單因素與多因素相結(jié)合的分析，定期檢測免疫治療患者的T淋巴細胞亞群，對預(yù)測療效具有一定的價值。同時，這為研究在惡性腫瘤發(fā)生過程中，淋巴細胞的變化及細胞免疫的狀態(tài)的改變，提供了一定程度的參考價值。在觀察組所有患者中未見明顯的不良反應(yīng)。

綜上所述，帕博利珠單抗可以調(diào)節(jié)非小細胞肺癌患者體內(nèi)的淋巴細胞亞群變化，改善機體的免疫狀態(tài)，同時為判斷機體的免疫狀態(tài)及預(yù)測免疫治療效果提供了重要參考價值。因此，定期監(jiān)測患者體內(nèi)淋巴細胞亞群的改變，同時在條件允許的情況下結(jié)合免疫相關(guān)因子的分析，對患者的治療方案的選擇和預(yù)后提供參考依據(jù)。本試驗?zāi)壳皟H隨訪至患者進行免疫治療第4周期，而且本觀察組中僅第4周期淋巴細胞亞群的變化較治療前差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），淋巴細胞亞群是否可以作為免疫治療療效的預(yù)測指標，還有待驗證；同時本觀察組中樣本量相對有限，因此為求進一步驗證試驗結(jié)果，還需要在臨床工作過程中不斷收集、總結(jié)及分析臨床數(shù)據(jù)。

Author contributions

Zhang XC conceived and designed the study. Wang Y, Wang YY, Jiang M, Zhao YM performed the experiments. Wang Y,Wang YY, Zhao YM analyzed the data. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.