劉瑞真 吳小末

【關(guān)鍵詞】 IL-17a HaCaT細(xì)胞 IL-6 IL-22 IL-23 STAT3

[Abstract] Objective： To explore the effect of interleukin-17a （IL-17a） on the expression of IL-6， IL-22， IL-23 in human immortalized keratinocytes （HaCaT） cells and possible mechamism of IL-17a regulating IL-6， IL-22， IL-23 in keratinocytes. Method： HaCaT cells were divided into blank control group （DMEM high-glucose medium only）， induction group （DMEM high-glucose medium containing 80 μg/L IL-17a） and inhibitor group （DMEM high-glucose medium containing 80 μg/L IL-17a and 10 μg/L STAT3 inhibitor Piceatannol）. After 48 h， we examined the expression of IL-6， IL-22， IL-23 by double antibody sandwich enzyme-1inked immunosorbent assay （ELISA） in the cells supernatant and realtime polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to detect the mRNA expression levels of IL-6， IL-22， IL-23 in HaCaT cell of all group. Protein expression of STAT3 was detected by Western Blot. Result： Compared with blank control group and inhibitor group， the expression levels and mRNA of IL-6， IL-22 and IL-23 in HaCaT cells in induction group were significantly increased （P<0.05）. Compared with the blank control group and the inhibitor group， the expression level of STAT3 protein in HaCaT cells in the induction group was significantly increased （P<0.05）. Conclusion： Il-17a can promote the secretion of IL-6， IL-22 and IL-23 by HaCaT cells， which may be regulated by STAT3.

[Key words] IL-17a HaCaT cells IL-6 IL-22 IL-23 STAT3

First-author’s address： Dermatology Hospita of Fuzhou， Fuzhou 350000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.26.004

銀屑病是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，全球發(fā)病率為2%～3%[1]。近年來(lái)該病發(fā)病率逐漸上升，其發(fā)病機(jī)制一直是皮膚科的研究熱點(diǎn)，該病一度被認(rèn)為是由TNF介導(dǎo)的Th1型免疫應(yīng)答相關(guān)的疾病。隨著第3種輔助性T細(xì)胞（T helper 17 cell，Th17）的發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的銀屑病免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制受到了很大的挑戰(zhàn)[2]。Th17是一種新發(fā)現(xiàn)的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞，分泌IL-17a、IL-17F、IL-22等，而其中IL-17a被認(rèn)為是銀屑病生理發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵[3-4]，IL-17a具有誘導(dǎo)趨化、抑制中性粒細(xì)胞凋亡、促進(jìn)新生血管形成、促進(jìn)活化的角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生更多趨化因子、促進(jìn)其他細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6）生成等作用[5]。以往研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血及其皮損處IL-6、IL-17、IL-22、IL-23表達(dá)水平明顯增高[6-7]。關(guān)于銀屑病發(fā)病機(jī)制信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn)，信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal-transducer and activator of transeription-3，STAT3）在銀屑病患者皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)也是升高的，該細(xì)胞因子與信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子被證實(shí)與細(xì)胞的增殖分化及凋亡關(guān)系密切，與銀屑病角質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度增生可能有著一定的聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn)IL-17a可激活STAT3，進(jìn)而激活細(xì)胞增殖的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，在銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用[8]。本研究通過(guò)建立IL-17a誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞增殖模型，探討IL-17a調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞中IL-6、IL-22、IL-23表達(dá)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）細(xì)胞。HaCaT細(xì)胞株（人永生化表皮細(xì)胞）購(gòu)于ATCC。（2）主要藥物和試劑。IL-17a抗體購(gòu)于abcam IL-6 ELISA試劑盒、IL-22 ELISA試劑盒、IL-23 ELISA試劑盒購(gòu)于abcam;STAT3抑制劑（白皮衫醇）購(gòu)于MCE;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶/EDTA、青霉素/鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（50T）購(gòu)于北京索來(lái)寶科技有限公司;STAT3WB抗體購(gòu)于abcam公司。（3）主要儀器。CO2恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置相差顯微鏡、冷凍高速離心機(jī)，QPCR儀，酶標(biāo)儀，80 ℃低溫冰箱、-20 ℃冰箱、4 ℃冰箱，電泳系統(tǒng)及電泳槽，凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞使用高糖DMEM培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素），培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，飽和濕度95%。以5×106個(gè)/mL HaCaT細(xì)胞鋪于6孔板中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。待其細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合度時(shí)開(kāi)始分組。

1.2.2 細(xì)胞分組與處理 空白對(duì)照組（DMEM高糖培養(yǎng)基）、誘導(dǎo)組（含80 μg/L IL-17a的DMEM高糖培養(yǎng)基）、抑制劑組（含80 μg/L IL-17a的DMEM高糖培養(yǎng)基和10 μmol/L白皮衫醇），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞重復(fù)培養(yǎng)6次，刺激48 h后分別收集上清和細(xì)胞。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6、IL-22、IL-23 收集上述不同分組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-22、IL-23濃度，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（A）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品濃度。

1.2.4 Real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-6、IL-22、IL-23 mRNA的表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到相應(yīng)cDNA，以β-actin為參照，用Ultra SYBR Mixture進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)細(xì)胞因子IL-6、IL-22、IL-23的mRNA表達(dá)。引物見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，45個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以Ct值反映基因mRNA含量，采用2-ΔΔCt對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.5 Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞STAT3表達(dá)水平 48 h后收集細(xì)胞提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取10 μg蛋白樣本，經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)膜，用5%牛血清白蛋白封閉，封閉完將NC膜放入裝有一抗（β-actin，STAT3）的抗體雜交盒中，搖床4 ℃孵育過(guò)夜。第二天用TBST洗滌孵育好的NC膜，洗3次，10 min/次。清洗完畢后，將NC膜放入

1︰5 000稀釋的鼠二抗雜交盒中，水平搖床上室溫孵育2 h;將NC膜平置于透明膜上，Thermo ECL試劑盒的A液和B液等體積混合后加到膜表面，暗處?kù)o置3 min后去除膜上發(fā)光液，置于透明膜上。采用凝膠成像系統(tǒng)Versa DocTM imaging system發(fā)光檢測(cè)，收集條帶圖像。用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，確定樣品中目的蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。

1.3 觀察指標(biāo) 比較各組HaCaT細(xì)胞IL-6、IL-22、IL-23表達(dá)水平;比較各組HaCaT細(xì)胞IL-6、IL-22、IL-23 mRNA結(jié)果;比較各組HaCaT細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用（x±s）表示，方差齊性用單因素方差分析（one-way ANOVE），多組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HaCaT細(xì)胞IL-6、IL-22、IL-23表達(dá)水平比較 空白對(duì)照組、誘導(dǎo)組和抑制劑組HaCaT細(xì)胞IL-6、IL-22、IL-23表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與空白對(duì)照組和抑制劑組比較，誘導(dǎo)組的HaCaT細(xì)胞IL-6、IL-22、IL-23表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P空白對(duì)照組=0.028 0、0.042 9、0.014 6，P抑制劑組=0.030 6、0.041 3、0.031 3）。見(jiàn)圖1～3和表2。

0.012 8、0.043 9、0.019 8，P抑制劑組=0.037 7、0.045 6、0.046 8）。見(jiàn)圖4和表3。

3 討論

IL-17a是一個(gè)促炎癥細(xì)胞因子，銀屑病患者皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞IL-17a的表達(dá)水平明顯升高，提示IL-17a在銀屑病的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用[9]。STAT3是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，與腫瘤、自身免疫性疾病等相關(guān)，通過(guò)參與Th17細(xì)胞分化、角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增生與異常分化、與炎癥細(xì)胞相互作用、真皮血管增生等重要病理過(guò)程在銀屑病發(fā)病中起關(guān)鍵作用[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17可通過(guò)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞VEGF的表達(dá)，提示STAT3可能介導(dǎo)IL-17誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞的增殖[12]。通過(guò)研究筆者發(fā)現(xiàn)IL-17a可以促進(jìn)HaCaT細(xì)胞分泌IL-6、IL-22、IL-23。其中IL-6與表皮、真皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化有關(guān)，可引起自身抗原體呈異常而觸發(fā)自身免疫反應(yīng)，可直接刺激T細(xì)胞向表皮遷移、促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞和T細(xì)胞增殖和活化，且和銀屑病的嚴(yán)重程度相關(guān)[13];IL-22是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的炎癥性因子，主要由活化的Th22細(xì)胞、Th17細(xì)胞以及NK細(xì)胞分泌產(chǎn)生[14]。有研究發(fā)現(xiàn)IL-22在銀屑病患者皮損和外周血的表達(dá)異常升高，通過(guò)調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化從而促進(jìn)銀屑病的發(fā)生發(fā)展[15]，此外IL-22與銀屑病患者的病情嚴(yán)重程度有關(guān)，不同分期患者的PASI評(píng)分與血清IL-22呈正相關(guān)[16]。IL-23是銀屑病發(fā)病過(guò)程中IL-17和IL-23/Th17軸的一個(gè)不可或缺的細(xì)胞因子。IL-23不僅可以誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，還促進(jìn)新生血管生成并募集中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞等[17]，還可促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化、活化，加強(qiáng)Th17細(xì)胞誘發(fā)免疫紊亂和維持其功能是[18]。通過(guò)研究筆者還發(fā)現(xiàn)IL-17a刺激HaCaT細(xì)胞分泌IL-6、IL-22、IL-23的這一過(guò)程，可通過(guò)抑制STAT3的表達(dá)而被抑制，提示STAT3在IL-17a促進(jìn)銀屑病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要作用，通過(guò)阻斷STAT3的表達(dá)，可以使IL-17a促角質(zhì)形成細(xì)胞分泌炎癥性細(xì)胞因子的能力下降，從而減緩角質(zhì)細(xì)胞的增殖速度同時(shí)減輕局部的炎癥反應(yīng)[19]，進(jìn)而減緩疾病的進(jìn)展。

盡管目前IL-17、IL-23抗體在銀屑病治療中取得了非常顯著的成效[20]，但作用于STAT3及其上游通路的相關(guān)因子如JAK1/2，也是目前一個(gè)治療靶點(diǎn)，其口服及外用藥物的劑型，以及其較低的經(jīng)濟(jì)成本、較少誘導(dǎo)的不良免疫反應(yīng)，為其在臨床中的應(yīng)用起到了一個(gè)很好的鋪墊，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了STAT3在銀屑病發(fā)病過(guò)程中起的重要作用，為今后開(kāi)展銀屑病新的靶向治療提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2021-08-10） （本文編輯：張爽）