柯俊泉，董 忠 ，潘廷明，汪偉劍

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）是中老年人的常見病和多發(fā)病。有調(diào)查報(bào)告指出，60 歲以上的老年人KOA 的患病率為50%，75 歲以上的老年人KOA 的患病率為80%[1-2]。該病主要的臨床特點(diǎn)為關(guān)節(jié)軟骨組織退變、軟骨丟失、軟骨下骨改變及滑膜炎等關(guān)節(jié)組織病變。該病可導(dǎo)致患者出現(xiàn)患側(cè)膝關(guān)節(jié)腫痛、膝關(guān)節(jié)活動(dòng)受限等，甚至可發(fā)生嚴(yán)重的關(guān)節(jié)畸形。隨著臨床上對KOA 病理機(jī)制研究的不斷深入，相關(guān)的研究人員越來越關(guān)注軟骨細(xì)胞凋亡與KOA 進(jìn)展之間的關(guān)系[3]。軟骨組織中的細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，屬于細(xì)胞的程序性死亡。軟骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，但其凋亡過程具有獨(dú)特性。軟骨細(xì)胞的凋亡過程與基質(zhì)降解具有緊密的關(guān)聯(lián)性[4-5]。當(dāng)某些病理因素作用于軟骨細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡機(jī)制可被啟動(dòng)。細(xì)胞的過度凋亡可間接導(dǎo)致基質(zhì)合成相應(yīng)減少，軟骨細(xì)胞失去維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能，從而可形成惡性循環(huán)。bcl-2 基因是參與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的相關(guān)原癌基因之一。bcl-2 家族中有許多可促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡和抑制軟骨細(xì)胞凋亡的成員，包括bcl-2、bax 和bcl-x 等。軟骨細(xì)胞的大量凋亡與bcl-2和bax 失衡有關(guān)[6]。

1 bcl-2、bax 在軟骨細(xì)胞凋亡中的作用

bcl-2 家族主要是通過表達(dá)蛋白的相互作用來實(shí)現(xiàn)調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡的目的。軟骨細(xì)胞凋亡是指在一定的生理或病理因素影響下，軟骨細(xì)胞自主啟動(dòng)死亡程序。而當(dāng)局部軟骨組織發(fā)生損傷或有相關(guān)的凋亡因子介入，迫使大量的軟骨細(xì)胞不得不啟動(dòng)凋亡程序時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解可失衡，凋亡小體的數(shù)量可增多，從而可使軟骨細(xì)胞無法維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在bcl-2 家族中，bcl-2 和bax 是一組細(xì)胞凋亡調(diào)控基因。目前，醫(yī)學(xué)界對bcl-2 和bax 的結(jié)構(gòu)和生理功能都有深度的研究。

軟骨細(xì)胞凋亡是一個(gè)有多種細(xì)胞因子、多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與的復(fù)雜的病理過程。該過程主要涉及上游和下游信號通路。上游信號通路包括MAPKs、PI3K-Akt、JAKs/statl、Wnt/β-Catenin 和核因子kB。下游信號通路主要涵蓋死亡受體途徑，以及與bcl-2、bax 關(guān)系密切的線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡途徑[7]。bcl-2 和bax 可通過表達(dá)的蛋白直接或間接參與到凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，從而實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。bcl-2 可通過表達(dá)蛋白實(shí)現(xiàn)抗凋亡的作用，其表達(dá)的蛋白主要錨定于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜等。因此，bcl-2 蛋白可存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，這種結(jié)構(gòu)使其可阻斷Ca2+向細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)，間接促使Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶失去活性，從而實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡的目的。另外，bcl-2 蛋白還可改變線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)，通過膜電位調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡，并可通過抑制caspase 的激活及細(xì)胞色素c（cytc）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等重要蛋白的釋放，起到阻抑細(xì)胞凋亡的作用[8]。因此，bcl-2 蛋白結(jié)合相關(guān)因子常被用于評價(jià)bcl-2 家族基因在細(xì)胞凋亡中的作用。王振龍等[9]通過藥物干預(yù)的方式降低腫瘤細(xì)胞中bcl-2 的表達(dá)，增加其中bax 的表達(dá)，同時(shí)采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測到腫瘤細(xì)胞中CHOP 的表達(dá)上調(diào)。CHOP 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡的重要促進(jìn)因子。張鐵山等[10]通過進(jìn)行氟誘導(dǎo)乳鼠軟骨細(xì)胞凋亡機(jī)制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，凋亡的軟骨細(xì)胞具有細(xì)胞核緊縮凝聚、內(nèi)膜結(jié)構(gòu)不清、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張的特點(diǎn)，并顯露大量的空泡，其中的bcl-2 蛋白表達(dá)也明顯降低。bax 表達(dá)的蛋白是一種整合膜蛋白，主要散落在細(xì)胞的內(nèi)膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，通過形成同型二聚體促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。bcl-2 蛋白可與bax 競爭性地結(jié)合，并形成更為穩(wěn)定的bcl-2/bax 異二聚體。bcl-2/bax 二聚體可阻抑bax/bax 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此，bcl-2/bax 可構(gòu)成一個(gè)平衡系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，bcl-2 蛋白占優(yōu)勢時(shí)，細(xì)胞可生存，bax 蛋白大量表達(dá)則可加速細(xì)胞的凋亡[11]。二者的蛋白表達(dá)比值可控制細(xì)胞的生存與凋亡。

2 軟骨細(xì)胞凋亡對KOA 的影響

KOA 是由于機(jī)械和生物因素的長期累積作用，使軟骨細(xì)胞過度凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)的合成與代謝發(fā)生紊亂所導(dǎo)致的膝關(guān)節(jié)疾病[12]。軟骨細(xì)胞是成熟軟骨中唯一能維持內(nèi)部環(huán)境平衡的細(xì)胞類型。這類細(xì)胞過度凋亡可加重KOA 的病情。因此，有研究認(rèn)為，阻抑軟骨細(xì)胞的凋亡可在一定程度上改變KOA 的轉(zhuǎn)歸[13-14]。KOA 的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)漫長而緩慢的過程，這也與軟骨細(xì)胞的凋亡過程不同步有關(guān)。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在正常的膝關(guān)節(jié)軟骨組織中，凋亡細(xì)胞的檢出率很低，且多存在于軟骨表面。但在KOA 模型中，軟骨表面至中層都存在細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。當(dāng)軟骨表面發(fā)生纖維化時(shí)，這種現(xiàn)象甚至可出現(xiàn)在軟骨深層。

近年來，關(guān)于軟骨細(xì)胞凋亡在KOA 中作用的研究越來越多。相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[15-16]、人體實(shí)驗(yàn)（包含體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）[17]結(jié)果表明，在發(fā)生KOA 的軟骨組織中，細(xì)胞凋亡的發(fā)生率很高。軟骨細(xì)胞凋亡在KOA 的進(jìn)展中具有重要的作用。目前，大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)研究均以動(dòng)物KOA 模型為研究對象。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記測定法（TUNEL）是目前檢測軟骨細(xì)胞凋亡過程中染色體DNA 斷裂的常用方法。

3 預(yù)處理KOA 模型對bcl-2 和bax 蛋白表達(dá)的影響

軟骨細(xì)胞過度凋亡是KOA 發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)的一種病理變化過程。bcl-2 和bax 基因是參與軟骨細(xì)胞凋亡機(jī)制的一類相關(guān)因子。因此，通過影響bcl-2 和bax 的表達(dá)，阻抑軟骨細(xì)胞的凋亡，闡明預(yù)處理在KOA 治療中的有效性成為近年來臨床上研究的重點(diǎn)。具體而言，即運(yùn)用各種檢測bcl-2 和bax 蛋白的手段、預(yù)處理方法可明顯減少KOA 患者軟骨組織中的凋亡細(xì)胞。而且，運(yùn)用檢測bcl-2 和bax 蛋白的手段發(fā)現(xiàn)bcl-2 的表達(dá)增加、bax 的表達(dá)降低可在一定程度上闡釋預(yù)處理在KOA 治療中的有效性。

邢恩福等[18]將rhil-1 受體拮抗劑注入兔KOA 模型的膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，并采用TUNEL 染色法在光鏡下觀察兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中細(xì)胞凋亡的情況，結(jié)果顯示，與模型組兔相比，實(shí)驗(yàn)組兔軟骨組織中的凋亡細(xì)胞明顯減少。該研究結(jié)果表明，采用rhil-1 受體拮抗劑對兔KOA 模型進(jìn)行預(yù)處理可降低其軟骨細(xì)胞的凋亡率。進(jìn)行Western blot 檢測的結(jié)果表明，與模型組兔相比，實(shí)驗(yàn)組兔軟骨組織中bcl-2 蛋白的表達(dá)明顯增加，bax 蛋白的表達(dá)顯著降低。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄- 聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組兔軟骨組織中bcl-2 蛋白的信使核糖核酸（mRNA）增強(qiáng)，bax 蛋白的mRNA 減弱。近年來，張媛媛等[19]、張宇標(biāo)等[20]、胡炯等[21]分別采用電針、甲基蓮心堿和染料木素對大鼠KOA 模型進(jìn)行預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)，與KOA 模型組大鼠相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠軟骨組織中凋亡阻抑蛋白bcl-2 的表達(dá)升高，促凋亡蛋白bax的表達(dá)降低。此外，中藥在減輕KOA 的嚴(yán)重程度中顯示出良好的作用。何曉瑾等[22]研究骨痹方對KOA 大鼠軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響后發(fā)現(xiàn)，該方可促進(jìn)其軟骨組織中Akt和Bcl-2 蛋白的表達(dá)，抑制其軟骨細(xì)胞的凋亡。李成付等[23]對兔KOA 模型軟骨組織中bcl-2/bax、Akt 的表達(dá)進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，牛膝乙醇提取物可有效增加兔軟骨組織中bcl-2 和bax 蛋白的表達(dá)，阻抑其軟骨細(xì)胞的凋亡。

4 軟骨細(xì)胞凋亡與軟骨細(xì)胞自噬的關(guān)系

軟骨細(xì)胞的死亡可能包括凋亡和自噬兩種形式。這兩種形式可能存在于KOA 的不同病理階段。但自噬與凋亡、壞死不同。在軟骨細(xì)胞發(fā)生自噬的早期，其中的染色質(zhì)可發(fā)生無序凝聚，高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量可增加，吞噬小泡和細(xì)胞外基質(zhì)小泡可發(fā)生聚集。西班牙拉科魯納的研究人員曾表示，增加KOA 患者軟骨細(xì)胞的自噬水平可防止其軟骨組織發(fā)生退化[24]。一項(xiàng)關(guān)于TUNEL 染色陽性的人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的研究表明，高爾基58 K 蛋白和caspase-2l重疊，這一研究結(jié)果證實(shí)了上述的觀點(diǎn)[25]。相關(guān)的研究報(bào)道表明，bcl-2 可作用于陽性的自噬調(diào)節(jié)因子beclin-1[26]。這些證據(jù)都提示，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。這二者之間的關(guān)聯(lián)性也為研究KOA 與軟骨細(xì)胞凋亡關(guān)聯(lián)性的人員提供了新的研究思路。

5 小結(jié)

KOA 的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。臨床上尚不清楚該病具體的發(fā)病機(jī)制。目前，對bax 和bcl-2 的研究主要集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上。bax 和bcl-2 是兩種已明確可參與細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)因子，可能存在于軟骨細(xì)胞凋亡的多個(gè)信號途徑中?，F(xiàn)今，關(guān)于軟骨細(xì)胞凋亡信號通路與KOA 發(fā)病關(guān)系的研究報(bào)道較少。今后，相關(guān)的研究人員可加強(qiáng)對bax 和bcl-2 蛋白的深入研究，并對各種途徑之間的聯(lián)系進(jìn)行研究，從而為臨床上治療KOA 提供指導(dǎo)。