薛俊霞，陳亞運，謝 璐，黃俊云，劉志平

（1.贛南醫(yī)學院2019級碩士研究生，江西 贛州 341000；2.中國醫(yī)科大學2020級博士研究生，遼寧 沈陽 110000；3.贛南醫(yī)學院基礎醫(yī)學院；4.贛南醫(yī)學院炎癥與免疫中心；5.贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 贛州 341000）

機體面臨大量病原菌的威脅，當病原菌進入機體后，機體的固有免疫細胞通過其模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）識別病原體的病原相關分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）后，啟動免疫級聯(lián)反應，清除病原體。PAMPs 主要是指病原微生物表面某些共有的高度保守的分子結構，包括脂多糖、磷壁酸、細菌DNA、螺旋體脂蛋白、病毒RNA 等。其中病毒RNA或加工過的自身RNA由RIG-Ⅰ樣受體（RIG-ⅠLike Receptors，RLRs）識別［1］。RLRs 受體包含RIG-Ⅰ和MDA5 和LGP2 三種類型［2］。其中，黑色素瘤分化相關 基 因5（Melanoma differentiation related gene 5，MDA5）由IFIH1 基因編碼，廣泛表達于髓系的固有免疫細胞［3］。MDA5 與RIG-Ⅰ結構相似：在N 端含有兩個串聯(lián)的CARD 結構域，中間是一個DECH 解螺旋酶結構域，加一個C 末端結構域（CTD）。但兩者的CTD 在結構上差異較大，賦予了二者感知不同病 毒RNA 的 能 力。 與RIG- Ⅰ識 別 短dsRNA 和5‘ppp-RNA 不同，MDA5 識別長dsRNA，或者結合模擬的poly（I∶C）［雙鏈RNA 的類似物，一條鏈是ploy（I），另一條鏈是poly（C）］。本文主要總結了MDA5的信號轉導通路及其調節(jié)以及現(xiàn)有的對MDA5相關疾病的研究。

1 MDA5的信號轉導通路

MDA5 與RIG-Ⅰ相似，通過其CTD 結構域和解旋酶結構域與長鏈dsRNA 結合，然后MDA5 在長dsRNA 上形成蛋白包衣的絲狀物，導致MDA5 兩個CARD 結構域的低聚化。隨后，MDA5兩個CARD 結構域與下游蛋白MAVS 的類CARD 結構域交互，激活MAVS。然后MAVS 招募TRAFs，導致某些干擾素激酶TBK1 和IKKe 的激活，使IRF3 和IRF7 磷酸化。磷酸化的IRF3和IRF7會誘導Ⅰ型IFN的產(chǎn)生。另一方面，招募的TRAFs 可以激活IKKα/IKKβ，導致NF-κB 的激活和抗病毒細胞因子的表達，介導先天性免疫應答。此外，抗原提呈細胞（Antigen pre?senting cell，APC）上的MDA5 也可以激活殺傷性T細胞，啟動適應性免疫應答［4］。MDA5 通過以上多種方式參與免疫應答，應答過強或過弱都可能導致疾病產(chǎn)生。

2 MDA5的活性調節(jié)

2.1 共價修飾

2.1.1 磷酸化修飾二羥基丙酮激酶DAK 可特異性結合MDA5 的CARD 結構域，抑制MDA5 介導的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生和抗病毒活性［5］。RIOK3 能磷酸化MDA5的Ser828抑制MDA5多聚體的發(fā)生和激活［6］。E3 泛素連接酶PIAS2β 介導MDA5 CTD 結構域的磷酸化，促進MDA5的信號激活［7］。

2.1.2 泛素化修飾TRIM65蛋白促進MDA5賴氨酸743 位點的K63 連接泛素化，促進MDA5 的寡聚化和激活［8］。此外，鋅指蛋白ZCCHC3 一方面可以作為病毒RNA 和RLRs 結合的輔受體，促進RIG-Ⅰ和MDA5 對病毒RNA 的結合，也可以促進TRIM25對RIG-Ⅰ和MDA5 CARD 結構域介導的K63 連接的多聚泛素化，從而激活RIG-Ⅰ和MDA5 通路［9］。TRIM40可以通過其CC結構域與MDA5和RIG-Ⅰ的CARD 結構域結合，介導MDA5、RIG-Ⅰ的K27 位和K48 位去泛素化，抑制RLR 信號通路及IFN-β 產(chǎn)生［10］。

類泛素化修飾是將一個小的泛素相關修飾劑（Small ubiquitin-related modifier，SUMO）共價連接到蛋白質上。與泛素化不同的是，類泛素化不會對靶蛋白進行降解，而是調節(jié)蛋白質功能，它們參與了RIG-Ⅰ和MDA5 抗病毒信號的激活、維持和終止全過程。在未感染或病毒感染早期，由TRIM38介導的RIG-Ⅰ和MDA5 的類泛素化抑制了它們K48-多聚素依賴的降解，穩(wěn)定了傳感器蛋白，使通路持續(xù)激活。在感染的后期，由Sentrin/SUMO-specific protease 2（SENP2）對RLRs 進行去類泛素化，觸發(fā)其蛋白酶體降解，促進炎癥終止［11］。

2.2 MDA5 的反饋調節(jié)MDA5 存在反饋調節(jié)，MDA5 作為干擾素刺激基因（Interferon-stimulated genes，ISGs），自分泌或旁分泌的IFN-α/β 能通過Jak-Stat信號通路上調自身的表達。也有研究發(fā)現(xiàn)，MDA5的表達受IRF-3的嚴格調控，用仙臺病毒刺激IRF3 基因敲除的樹突狀細胞發(fā)現(xiàn)正常會上調的MDA5因IRF3基因的敲除不再上調［12］。

2.3 受體間的相關激活LGP2 作為RLRs 家族的成員蛋白，含有具有ATP水解活性的中央DeCH-box解旋酶結構域和羧基末端結構域，參與RNA 結合和構象重排，但LGP2 缺乏氨基末端串聯(lián)Caspase 激活和募集域，因此缺乏獨立的信號轉導活性。LGP2能正向和反向調控RIG-Ⅰ和MDA5 的活性。LGP2 通過協(xié)同結合促進雙鏈RNA（dsRNA）上MDA5寡聚成核，激活MDA5 通路［11］。動物實驗證實，缺乏LGP2的小鼠對某些以MDA5 識別并清除的RNA 病毒［如腦心肌炎病毒（EMCV）］不能觸發(fā)有效的免疫應答［13］。

因此，MDA5 信號激活需要磷酸化、泛素化、類泛素化等多種共價修飾以及下游分子的反饋調節(jié)、受體間的相互激活等多種調節(jié)。調節(jié)過強、過弱或異常調節(jié)都有可能導致疾病的發(fā)生。因此弄清楚MDA5信號通路正常和異常情況下的信號修飾和調節(jié)，對各種疾病的診斷和治療具有重要意義。

3 MDA5與臨床相關疾病

3.1 MDA5與感染

3.1.1 MDA5 在病毒感染中的作用MDA5 主要識別長鏈dsRNA，即呼腸病毒科病毒。MDA5 還可識別某些ssRNA，如微小核糖核酸病毒科病毒（腦心肌炎病毒、鼻病毒、B 型科薩奇病毒）、黃病毒科病毒（丙型肝炎病毒、西尼羅河病毒、寨卡病毒）、部分dsDNA 病毒（痘病毒、單純皰疹病毒、乙型肝炎病毒）。識別病毒后引起上文提到的信號通路激活。下面從病毒引起的大的疾病類型方面概述MDA5在感染中的作用。

3.1.1.1 呼腸病毒科病毒當呼吸道肺上皮細胞感染病毒后，MDA5 能特異性結合呼吸道感染病毒中的副黏病毒V 蛋白，RIG-Ⅰ對IRF-3 的初始激活后，防止IRF-3 的早期降解，從而維持IRF-3 依賴的抗病毒基因的表達［14］。

MDA5 應答的另一大類病毒是腸病毒。它們主要在腸道內繁殖，再從糞便中排出，但很少引起胃腸道的癥狀。這大家族的病毒可引起多種多樣的疾病，如脊髓灰質炎病毒可引起脊髓灰質炎（俗稱小兒麻痹）；腸道病毒71型可引起“手足口病”；柯薩奇病毒可引起心肌炎、流行性肌痛、皰疹性咽峽炎、手足口病和腦膜炎。使用Mda5?/?敲除小鼠實驗和其他多種方法發(fā)現(xiàn)，MDA5信號對小核糖核酸病毒（如腦心肌炎病毒、鼠腦脊髓炎病毒、脊髓灰質炎病毒和柯薩奇B 病毒）誘導Ⅰ型IFN 產(chǎn)生至關重要［15-19］。此外在多種細胞模型中發(fā)現(xiàn)MDA5能有效抑制戊型肝炎病毒、人類諾如病毒和輪狀病毒腸病毒復制。一方面MDA5 過表達可通過類似IFN 的反應誘導重要的抗病毒ISG 的轉錄，而不觸發(fā)功能性IFN 的產(chǎn)生；另一方面MDA5 通過激活STAT1 進而啟動JAK-STAT 級聯(lián)通路，觸發(fā)抗病毒IFN 反應。即證明MDA5 通過引起非典型的IFN 樣應答（部分依賴于JAK-STAT 級聯(lián)反應）有效抑制這幾種病毒的復制。此外也有研究指出諾如病毒（MNoV）感染的小鼠能在血紅素氧化的IRP2 泛素連接酶1（HOIL1，線性泛素鏈組裝復合物的組成成分之一）參與下，通過MDA5 信號途徑，誘導樹突狀細胞Ⅰ型和Ⅲ型IFNs的產(chǎn)生，抵抗病毒感染［20］。

3.1.1.2 肝炎病毒此外，MDA5在抵抗多種肝炎病毒感染中也有重要作用，將HBV復制質粒與RIG-Ⅰ或MDA5表達質粒共轉染Huh7細胞，發(fā)現(xiàn)MDA在相似的蛋白水平時，更能顯著地抑制HBV 的復制。對Mda5?/?小鼠進行感染，結果顯示，Mda5?/?小鼠表現(xiàn)出比WT小鼠更強的乙型肝炎病毒復制，即MDA5能識別乙型肝炎病毒并激活先天免疫信號以抑制病毒復制［21］；而通過對慢性乙型肝炎患者MDA5 和RIG- Ⅰ的mRNA表達量分析，發(fā)現(xiàn)MDA5基因表達下調可能是導致慢性乙型肝炎患者HBV持續(xù)存在的原因之一［22］；此外，MDA5也參與對丙型肝炎病毒ssRNA和丁型肝炎病毒dsRNA的識別過程，并負責介導大量IFN-β和IFN-λ的產(chǎn)生［23-24］。

3.1.1.3 冠狀病毒MDA5 提供誘導Ⅰ型IFN 產(chǎn)生參與機體對冠狀病毒感染的應答過程。MDA5在本世紀發(fā)生的兩種嚴重冠狀病毒感染疾病——MERS 和SARS 中都發(fā)揮了關鍵作用［25］。最新研究表明，MDA5 也參與對新型冠狀病毒（COVID-19）的應答過程，通過對COVID-19 的重要中間宿主穿山甲的RNA 感受器基因進行基因組學比較，發(fā)現(xiàn)除MDA5 識 別Z-DNA 和Z-RNA 的Z-DNA 結 合 蛋 白（ZBP1）外，其他RNA感受器高度保守。從而提出假設，MDA5 和ZBP1 的缺失導致穿山甲對COVID-19感染由抵抗轉變?yōu)槟褪埽?6］。進一步對臨床患者進行分析發(fā)現(xiàn)COVID-19 與抗MDA5 綜合征的全身體征、病理生理機制、致死原因相似。當對COVID-19患者應用抗MDA5綜合征藥物時可更快地改善病癥并顯著提高生存率，即COVID-19 患者臨床表現(xiàn)和用藥選擇與患有抗MDA5 綜合征患者具有相似性［27-28］。

MDA5 作為先天性模式識別受體，在識別和應答dsRNA 病毒、某些ssRNA 病毒和部分dsDNA 病毒中發(fā)揮重要作用，參與抵抗呼腸病毒科病毒、肝炎病毒、冠狀病毒等多種病毒感染過程。綜上所述，MDA5是應對多種病毒感染重要的先天性模式識別受體。

3.1.2 MDA5 在真菌感染中的作用侵入性真菌感染每年造成150 萬人死亡，超過90% 報告真菌感染相關死亡是由隱球菌、念珠菌、曲霉菌、肺孢子菌這四種真菌引起［29］。

3.1.2.1 MDA5 在曲霉菌感染中的作用侵襲性肺曲霉?。↖nvasive pulmonary aspergillosis，IPA）是一種危及生命的疾病，研究證明，依賴MDA5/MAVS的Ⅲ型干擾素和部分Ⅰ型干擾素應答對于誘導中性粒細胞殺死煙曲霉菌孢子至關重要［30］。

3.1.2.2 MDA5 在念珠菌感染中的作用念珠菌是院內（醫(yī)院獲得性）血流感染的第四大常見原因［31］。當用白色念珠菌菌絲刺激體外培養(yǎng)的巨噬細胞時，巨噬細胞MDA5 的表達量增加。對應的臨床分析發(fā)現(xiàn)，慢性黏膜皮膚念珠菌?。–hronic mucocutaneous candidiasis，CMC）患者表達的MDA5水平低于健康對照組，其次，IFIHI 基因的錯義突變與系統(tǒng)性念珠菌感染的易感性之間有很強的聯(lián)系。當用白色念珠菌酵母或菌絲刺激Mda5?/?小鼠的脾細胞發(fā)現(xiàn)IFN-β、IL-6、IL-10 表達低于野生型（WT），而具有假絲酵母菌風險等位基因的人外周血單核細胞會產(chǎn)生更多的促炎細胞因子（IFN-γ和IL-17）和更少的抗炎因子IL-10，提示MDA5 可能在白色念珠菌感染期間至少部分負責Ⅰ型IFN 的誘導，引起免疫紊亂。但具體機制未知［32］。

綜上所述，MDA5 作為病毒RNA 識別受體，也能對曲霉病、念珠菌等真菌產(chǎn)生應答，MDA5能誘導Ⅲ型干擾素和部分Ⅰ型干擾素的表達，激活中性粒細胞抵抗曲霉菌感染。MDA5也參與白色念珠菌感染的免疫應答，但發(fā)揮的作用和作用機制仍需進一步研究。

3.2 MDA5 在自身免疫性疾病中的作用 有文獻指出，MDA5 的功能獲得性突變會使Ⅰ型IFN 表達升高，導致自身免疫?。?3］。而通過運用MDA5 過表達轉基因小鼠實驗，發(fā)現(xiàn)自發(fā)的MDA5 激活導致的MDA5 過表達僅引起慢性Ⅰ型IFN 呈表達狀態(tài)，并不足以引發(fā)自身免疫性或病理性炎癥。只有結合像FcgR2B 缺陷的狼瘡性綜合征等易感背景時，MDA5過表達才能加速自身抗體的產(chǎn)生［34］。

3.2.1 Aicardi-Gtières 綜合征 逆轉錄元件Alu作為逆轉座子，能在DNA 某特定插入位點產(chǎn)生短的正向重復序列。Aicardi-Gtières 綜合征中MDA5 的結構性激活是由于對Alu 逆轉錄元件形成的細胞dsRNA 失去耐受性所致［35］。也有研究指出，Aicardi-Gtières 綜合征相關的MDA5 基因突變是因為MDA5解旋酶結構域中單個氨基酸的替換，使突變的MDA5 以一種獨立于RNA 的方式構成信號，在缺乏外源刺激的情況下也能激活IFN-β 啟動子［36］。也有研究指出，MDA5 有些突變增強了它與RNA 之間的相互作用，針對細胞自身RNA 觸發(fā)信號，增強Ⅰ型IFN的響應［37］。

3.2.2 皮肌炎有研究表明，抗MDA5抗體與一種導致皮膚和肌肉炎癥的罕見疾病—— 皮肌炎（Dermatomyositis，DM）密切相關，在亞洲人群中20%~50% 的DM 患者有抗MDA5 抗體。有研究顯示，抗MDA5 抗體對DM 診斷的敏感性為18%，特異性達100%，表明抗MDA5 抗體對DM 有一定診斷價值［38］。表現(xiàn)為抗MDA5陽性的DM患者血漿中IFN?α的蛋白水平遠高于其他DM 亞型患者，其皮膚活檢以STAT1、ISG15 和MxA 蛋白的強表達（存在）為特征［39］。

3.2.3 1 型糖尿病 有研究表明，MDA5 與1 型糖尿病也有很強的相關性。 1 型糖尿?。═ype 1 diabetes，T1D）是一種與炎癥強烈相關的慢性自身免疫性疾病。β 細胞和免疫細胞釋放的細胞因子和趨化因子以及死亡的β 細胞傳遞的免疫信號可以誘導并增強胰島炎癥，而胰島炎癥可進一步發(fā)展為臨床糖尿病。MDA5可通過識別人工合成的雙鏈多聚肌胞酸［polyinosinic-polycitidiic acid，poly（I∶C）］誘導細胞因子和趨化因子的表達，而沉默MDA5 可減少PIC 誘導的細胞因子和趨化因子的量，從而抑制胰島炎癥［40］。功能受抑制的MDA5 基因突變，可使T1D 的風險降低近50%［41］。5 個與編碼MDA5 相關的獨立的單核苷酸多態(tài)序列可看作1型糖尿病相關基因［42］，且MDA5 能作為MDA5 相關1 型糖尿病臨床預后指標［43］。

3.2.4 白癜風MDA5 通過誘導角質形成細胞在病毒入侵時分泌趨化因子而加重白癜風。白癜風是一種皮膚自反應性CD8+T 細胞浸潤而殺死黑色素細胞為特征的毀容疾病。大量研究表明，病毒入侵參與了白癜風的發(fā)病機制，IFIH1 已被鑒定為白癜風易感基因。病毒入侵顯著激活了MDA5，增強了角化細胞衍生的CXCL10 和CXCL16，這兩個趨化因子在CD8+T 細胞浸潤白癜風皮膚中起重要作用。MDA5可作為病毒侵襲導致的白癜風的潛在治療靶點［44］。

綜上所述，MDA5 的基因突變和功能異常會導致多種自身免疫性疾病的發(fā)生，MDA5 的基因測序和相關抗體檢測在相應疾病的診斷和預后預測中具有重要價值。進一步研究各種抗MDA5陽性的自身免疫病的發(fā)病機制，有利于針對各種自身免疫病的特性開發(fā)有效藥和特效藥。

3.3 MDA5在癌癥中的應用

3.3.1 MDA5 參與的癌癥MDA5 在癌細胞中識別病毒RNA 模擬物并激活線粒體凋亡途徑［45］。MDA5 異位表達導致多種細胞包括癌細胞生長停滯［46］，在黑色素瘤細胞系中，MDA5/MAVS/Caspase-9和Apaf-1 信號通路激活，產(chǎn)生并介導獨立于Ⅰ型IFNs 和p53 促凋亡信號通路的促凋亡蛋白Noxa，而非惡性細胞可通過上調Bcl-xL，免于MDA5 誘導的凋亡。因此，細胞質的MDA5/MAVS 通路的激活會在Bcl2 家族蛋白調節(jié)下引起黑色素瘤細胞特異性凋亡［47］。胰腺癌細胞凋亡也有MDA5/MAVS 途徑的參與，poly（I∶C）激活MDA5，導致轉錄因子IRF3 磷酸化，IFN-β 產(chǎn)生，MHC-Ⅰ表達上調，誘導凋亡。MDA5信號也通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活Caspase誘導腫瘤細胞凋亡，并使腫瘤細胞對外源性Fas 介導的凋亡更加敏感。用MDA5 配體全身治療原位胰腺癌小鼠時，可更多地激活腫瘤抗原特異性CD8+T 細胞，并在腫瘤微環(huán)境中形成免疫原性細胞因子。 在兩種不同的胰腺癌小鼠模型也證實，MDA5通過CD8+T細胞誘導腫瘤細胞凋亡并顯著延長生存期［48］。利用含活性突變Ras的人胰腺癌和結直腸癌細胞證明Ras/Raf/MEK/ERK 通路的激活可抑制MDA5介導的人胰腺癌和結腸直腸癌細胞促凋亡的活性，而當應用Ras/Raf/MEK/ERK 通路分子抑制劑，MDA5 的促凋亡活性升高［46］。在神經(jīng)母細胞瘤中，MDA5 可與TLR3 協(xié)同作用抑制腫瘤的發(fā)展，其中，MDA5 的過表達會減弱癌細胞的增殖［49］。此外，MDA5 也參與肝癌細胞凋亡，MDA5 可上調激活Caspase3/7 途徑誘導肝癌細胞凋亡，poly（I∶C）脂質體通過激活MDA5抑制小鼠肝癌細胞的生長［50］。

3.3.2 MDA5 在臨床抗腫瘤治療中的應用臨床的抗腫瘤DNA 去甲基化劑5-AZA-CdR 能模擬逆轉錄病毒侵入腫瘤起始細胞誘導dsRNA 的形成過程，激活MDA5/MAVS/IRF7 級聯(lián)信號，從而刺激Ⅲ型干擾素而不是Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，有效誘導抗增殖反應。短期低劑量5-AZA-CdR 可顯著降低小鼠腸道腫瘤起始細胞的發(fā)生頻率［51］。使用人工合成的RNA 如poly（I∶C）激活MDA5 或使用腺病毒載體過表達MDA5 都可激活MDA5 下游信號通路促進抗腫瘤免疫，誘導癌細胞死亡［52-53］。以上結果提示，IFIH1 基因型和MDA5 表達水平可能在預測患者對靶向表觀遺傳調控藥物的反應具有指導意義。綜上所述，MDA5在黑色素瘤、胰腺癌、結直腸癌、神經(jīng)母細胞瘤和肝癌等癌癥中抗癌細胞免疫和誘導癌細胞凋亡的特性正在被用來開發(fā)成各種癌癥的潛在治療手段，如肽疫苗在使用poly（I）CLC 佐劑進行兩次連續(xù)免疫后會通過刺激TLR3和MDA5表達，產(chǎn)生大量內源性腫瘤反應性殺傷性T細胞（CTL）［4］。

4 結論與展望

MDA5 信號通路激活可觸發(fā)先天性免疫應答和獲得性免疫應答，發(fā)揮抗感染作用。當機體產(chǎn)生腫瘤細胞時，MDA5可觸發(fā)抗腫瘤免疫，抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡，當MDA5 調控異常，產(chǎn)生大量Ⅰ型干擾素時，會導致多種自身免疫病的發(fā)生。所以，了解機體生理病理狀態(tài)下MDA5 信號通路的激活和調控機制，對疾病的致病機制、治療方法的研究有重要意義。