崔美麗　劉永樂　俞健　李向紅　羅陽陽　李彥　王發(fā)祥

摘要： 為篩選新型乳酸菌抗凍保護劑，通過復(fù)合蛋白質(zhì)酶水解15 min、30 min、60 min、120 min、240 min制備了不同水解度的鰱魚酶解產(chǎn)物，研究其相對分子質(zhì)量分布、氨基酸組成、表面疏水性、活性巰基含量等特性及其不同酶解時間鰱魚酶解產(chǎn)物和不同質(zhì)量分數(shù)鰱魚酶解產(chǎn)物對乳酸菌凍融存活率的影響。結(jié)果表明，不同酶解時間酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量主要在9.00×101～5.40×105，其氨基酸組成和含量基本相同，親水性氨基酸比例占總量的68%;隨著酶解時間增加，酶解產(chǎn)物的表面疏水性和活性巰基含量均呈先降后升趨勢，其中酶解120 min的鰱魚酶解產(chǎn)物表面疏水性最低，酶解30 min鰱魚酶解產(chǎn)物的活性巰基含量最低;在不添加抗凍保護劑情況下，乳酸菌耐凍性能較差，4次凍融循環(huán)后存活率為22.82%;添加不同酶解時間鰱魚酶解產(chǎn)物均對乳酸菌有一定的抗凍保護效果，其中酶解120 min的酶解產(chǎn)物對乳酸菌的抗凍保護效果最好，添加質(zhì)量分數(shù)為4%時可使乳酸菌4次凍融循環(huán)后的存活率提高至85.20%。說明鰱魚酶解產(chǎn)物是一種潛在的乳酸菌抗凍保護劑。

關(guān)鍵詞： 鰱魚酶解產(chǎn)物;乳酸菌;抗凍保護

中圖分類號： TS201.3 文獻標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）01-0197-07

Characteristics and cryoprotective effect of silver carp muscle hydrolysates on Lactobacillus plantarum

CUI Mei-li， LIU Yong-le， YU Jian， LI Xiang-hong， LUO Yang-yang， LI Yan， WANG Fa-xiang

（School of Chemistry and Food Engineering， Changsha University of Science and Technology， Hunan Provincial Engineering Research Center for Food Processing of Aquatic Biotic Resources， Changsha 410114，China）

Abstract： To screen new type cryoprotectant for Lactobacillus plantarum， the silver carp muscle hydrolysates （SCMHs） with different degrees of hyolysis were prepared by protamex that hydrolyzed for 15 min， 30 min， 60 min， 120 min and 240 min. The properties of SCMHs such as relative molecular mass， amino acid composition， surface hydrophobicity and active sulfhydryl content were studied， and the influence of SCMHs with different enzymolysis time and different mass percentages on the survival rate of L. plantarum after freeze-thaw were also studied. The results showed that the relative molecular mass of SCMHs with different enzymolysis time mainly ranged from 9.0×101 to 5.40×105. The composition and content of amino acids from different SCMHs were similar， and about 68% of the total amino acids were hydrophilic. With the increase of enzymolysis time， the surface hydrophobicity and active sulfhydryl content of SCMHs all presented the trend of decrease first and then increase. The surface hydrophobicity of SCMHs declined to its minimum after enzymolysis for 120 min， and the active sulfhydryl content of SCMHs reached its minimum after enzymolysis for 30 min. The freezing tolerant properties of L. plantarum was poor without the addition of cryoprotectant， and the survival rate of L. plantarum was 22.82% after four cycles of freeze-thaw. Addition of SCMHs with different enzymolysis time showed cryoprotective effect on L. plantarum， and SCMHs after enzymolysis for 120 min exhibited the best effect. The addition of SCMHs with a mass percentage of 4% could increase the survival rate of L. plantarum to 85.20% after four cycles of freeze-thaw. It is suggested that the SCMHs is a potential cryoprotectant for L. plantarum.

Key words： silver carp muscle hydrolysates;Lactobacillus plantarum;cryoprotective

鰱魚 （Hypophthalmichthys molitrix） 是中國四大家魚之一，由于具有價格低廉、生長速度快、養(yǎng)殖量大等優(yōu)點，2018年養(yǎng)殖產(chǎn)量達3.858 9×106 t，在魚類產(chǎn)量排名中僅次于草魚[1]。但是鰱魚肉薄肌間刺多、口感差、土霉味與魚腥味重，嚴重影響了其食用品質(zhì)。目前除加工成冷凍魚糜外，仍然缺乏有競爭力的利用途徑;同時，鰱魚肉的營養(yǎng)價值高，有適宜比例的必需氨基酸，是優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)資源[2]，應(yīng)合理地充分利用，避免浪費。因此，研究開發(fā)新的鰱魚高值化利用途徑具有十分迫切的意義。鰱魚的酶解產(chǎn)物是一種新型的抗凍改良劑，能有效抑制魚糜中蛋白質(zhì)的冷凍變性[3-4]，防止冷凍面團品質(zhì)的凍融損傷[5]，同時對酵母菌等微生物[6-7]也具有良好的抗凍保護活性，值得進一步深入研究。

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠利用可發(fā)酵的碳水化合物來產(chǎn)生大量乳酸的無芽孢細菌統(tǒng)稱，因其良好的發(fā)酵性能和優(yōu)越的益生作用，引起了與人類生活領(lǐng)域密切相關(guān)研究者的注意。目前，乳酸菌在與發(fā)酵相關(guān)的調(diào)味品[8]、果蔬制品[9]、植物蛋白質(zhì)飲品[10]等食品行業(yè)被廣泛應(yīng)用，但許多發(fā)酵食品通常需要貯藏在低溫的環(huán)境中，常采用冷凍干燥技術(shù)來生產(chǎn)乳酸菌直投式發(fā)酵劑，在低溫貯藏或冷凍干燥過程中，往往存在冷凍損傷和蛋白質(zhì)的冷應(yīng)激變化等現(xiàn)象，導(dǎo)致乳酸菌存活率降低及部分功能的喪失[11-13]。當(dāng)前，為了提高乳酸菌的存活率通常采用添加抗凍劑這一方法，已有多種抗凍劑被添加使用，如甘油、氨基酸類物質(zhì)、抗凍蛋白質(zhì)等[14-16]。鰱魚酶解產(chǎn)物已被證實具有良好的抗凍保護效果[3-7]，但其是否對乳酸菌具有抗凍保護作用，還需要進一步研究證實。本研究在課題組前期試驗基礎(chǔ)上，通過使用復(fù)合蛋白質(zhì)酶酶解鰱魚肉，制備系列酶解產(chǎn)物，研究其對乳酸菌凍融循環(huán)處理后存活率的影響及其與酶解產(chǎn)物性質(zhì)的相關(guān)性，旨在為利用鰱魚酶解產(chǎn)物提高乳酸菌在冷凍或凍藏過程中的存活率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鰱魚購于湖南省長沙縣高云小區(qū)菜市場;乳酸菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，CICC20272），本實驗室傳代保藏。

MRS肉湯培養(yǎng)基和改良MRS培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;復(fù)合蛋白質(zhì)酶（Protamex，酶活性≥1.5 AU/g），購自諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司;巰基含量測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所;氨基酸分析用生理體液（PF-1～PF-4、PF-RG）和茚三酮緩沖液，購自日本和光純藥工業(yè)公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8900全自動氨基酸分析儀，日本日立有限公司生產(chǎn);LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司生產(chǎn);BIOTECH-5L生物酶反應(yīng)器，上海保興生物設(shè)備工程有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 鰱魚酶解產(chǎn)物的制備 參考熊思佳等[6]的方法稍作修改。新鮮鰱魚宰殺取肉，用組織搗碎機攪碎，按固液比1∶5與水混勻后加入酶反應(yīng)器，按魚肉干質(zhì)量（魚肉水分含量按80%計）的3%添加復(fù)合蛋白質(zhì)酶，在50 ℃、pH 6.50±0.05的條件下分別對其水解15 min、30 min、60 min、120 min、240 min，90 ℃條件下滅酶15 min，于4 000 g離心后，收集上清液進行冷干，得到系列不同水解度的鰱魚酶解產(chǎn)物。

1.3.2 體積排阻色譜法測定酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布 參考趙城彬等[17]的方法并做修改。采用配備TSKgel 4000SWXL蛋白質(zhì)凝膠柱的高效液相色譜儀測定鰱魚酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布，使用牛血清白蛋白、核糖核酸酶A、過氧化物酶、甘氨酸四聚體和對氨基苯甲酸在柱中的平均保留時間得到相對分子質(zhì)量校準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確稱取0.050 0 g 水解15 min、30 min、60 min、120 min、240 min酶解產(chǎn)物，使用超純水分別溶解并定容至100 ml后，于微孔濾膜（0.45 μm）過濾。利用高效液相色譜儀進行測定，條件為：流速1 ml/min;檢測波長220 nm;進樣量20 μl;柱溫30 ℃;流動相為pH6.5的超純水。

1.3.3 氨基酸組成分析 參考食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[18]，分別準(zhǔn)確稱取25 mg酶解15 min、30 min、60 min、120 min、240 min的酶解產(chǎn)物于水解管中，加入10 ml 6 mol/L的鹽酸，于110 ℃條件下消化22 h，待其冷卻后，以超純水定容至50 ml，吸取1 ml減壓干燥，用1 ml的超純水溶解殘留物，蒸干后用1 ml的檸檬酸鈉緩沖液（pH為2.2）進行溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾后用氨基酸自動分析儀進行測定。

1.3.4 酶解產(chǎn)物表面疏水性分析 酶解產(chǎn)物凍干粉以超純水配制成質(zhì)量濃度為5.0 mg/ml的溶液，參考陳賽等[19]的方法采用反相高效液相色譜法分析酶解產(chǎn)物表面疏水性，疏水性系數(shù)是11～30 min的峰面積與總峰面積比值，值越大代表樣品的表面疏水性越強。

1.3.5 活性巰基含量測定 準(zhǔn)確稱取350 mg酶解產(chǎn)物凍干粉，定容至50 ml，參考巰基測定試劑盒說明書測定其活性巰基含量。

1.3.6 乳酸菌培養(yǎng)液的制備 從斜面挑取1環(huán)乳酸菌，接種至50 ml MRS肉湯中（100 ml三角瓶），于37 ℃條件下靜置24 h，得到一級種子液。按照接種量為2%將其接種至100 ml MRS肉湯中，于37 ℃條件下靜置18 h，即得乳酸菌培養(yǎng)液（菌體含量大于1×108CFU/ml），備用。

1.3.7 乳酸菌冷凍存活率的測定 吸取1.0 ml的乳酸菌培養(yǎng)液加入原先預(yù)裝有9.0 ml無菌水或者相應(yīng)溶液的離心管中，振蕩混勻后制成菌懸液，隨機取一離心管稀釋度為1×10-1的乳酸菌懸液，以稀釋平板法（MRS培養(yǎng)基固體平板）測定其菌落總數(shù)，計為初始活菌數(shù)（N0，N0=2.28×107～4.35×107CFU/ml）;余下各離心管置于-20 ℃冰箱進行凍融循環(huán)處理（-20 ℃冷凍18 h，4 ℃解凍6 h為1個凍融循環(huán)），每間隔2個凍融循環(huán)取出一離心管以稀釋平板計數(shù)法測定其菌落總數(shù)，計為此時的活菌數(shù)（Ni），反復(fù)凍融1～6個循環(huán)，分別計算乳酸菌的存活率（第i個凍融循環(huán)的存活率=Ni/N0×100%）。

1.3.8 不同酶解產(chǎn)物對乳酸菌的抗凍保護能力 參考熊思佳等[6]的方法分別稱取0.2 g系列酶解產(chǎn)物，加入9 ml的無菌水和1 ml的乳酸菌培養(yǎng)液，制得含終含量為2%（質(zhì)量體積分數(shù)）的酶解產(chǎn)物乳酸菌懸液;置于-20 ℃冰箱，對其進行4次凍融循環(huán)，取出測定其活菌數(shù)，計算乳酸菌的存活率;空白對照為無菌水并計算初始的活菌數(shù)，陽性對照為8%的甘油，陰性對照為2%（質(zhì)量體積分數(shù)）的牛血清白蛋白（BSA）。

1.3.9 不同質(zhì)量分數(shù)酶解產(chǎn)物對乳酸菌凍融存活率的影響 稱取酶解120 min的酶解產(chǎn)物，按方法1.3.8的方法制備質(zhì)量分數(shù)為2%、4%、 6%、 8%酶解產(chǎn)物的乳酸菌懸液，于-20 ℃冰箱中進行4次凍融循環(huán)后，測定其乳酸菌的存活率。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理 每組試驗進行3個平行，試驗結(jié)果以x-±s表示，以Microsoft Excel軟件計算并繪圖;采用SPSS 21.0軟件，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，用Duncans檢驗法進行多重比較和差異顯著性分析（ P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰱魚酶解產(chǎn)物的氨基酸組成

課題組以前的研究結(jié)果表明，隨著酶解時間的增加，鰱魚酶解產(chǎn)物（Silver carp muscle hydrolysate，SCMH）的水解度逐漸增加，15 min、30 min、60 min、120 min、240 min酶解產(chǎn)物的水解度分別為9.68%、13.57%、18.42%、23.27%、29.10%，不同酶解產(chǎn)物的基本組成差別不大，其中蛋白質(zhì)（包括蛋白質(zhì)、肽和氨基酸）約占總質(zhì)量的85%[6]。本研究進一步分析了其氨基酸組成，結(jié)果如表1所示。

由表1可見，不同酶解時間鰱魚酶解產(chǎn)物的氨基酸組成和含量均比較接近。其中，必需氨基酸含量接近氨基酸總量的40%，表明其營養(yǎng)價值比較豐富;親水性氨基酸含量超過氨基酸總量的68%，說明酶解產(chǎn)物具有較好的溶解性[20]，也與抗凍蛋白質(zhì)具有較高親水性氨基酸含量的特征相似[21];另外，谷氨酸含量在所有氨基酸中最高，再依次為天冬氨酸、賴氨酸和精氨酸，有研究結(jié)果[22-23]表明這4種氨基酸具有優(yōu)先與自由水相互結(jié)合的能力，通過熱滯活性抑制冰晶的形成，從而具有較好的抗凍保護活性。

2.2 鰱魚酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布

體積排阻色譜法 （Size exclusion chromatography，SEC）是按照分子大小的順序?qū)ζ溥M行分離的色譜方法，已被廣泛應(yīng)用于大分子物質(zhì)的相對分子質(zhì)量分布分析。圖1為不同酶解時間鰱魚酶解產(chǎn)物的SEC色譜圖，可見隨著酶解時間的增加，酶解產(chǎn)物的組分及其含量發(fā)生了明顯變化。以相同條件下分離5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為參考，酶解產(chǎn)物組分的相對分子質(zhì)量主要分布在9.00×101～5.40×105，表明其含有許多不同相對分子質(zhì)量的肽和相對分子質(zhì)量小的游離氨基酸。但隨著水解時間的增加，洗脫時間7 min以前的峰（相對分子質(zhì)量>9.1×104）強度明顯減小，8 min以后的峰（相對分子質(zhì)量<3.0×104）強度逐漸增強，且部分洗脫峰出峰時間稍有后移，其中酶解120 min和240 min酶解產(chǎn)物尤為明顯，表明大分子的蛋白質(zhì)或肽被逐步降解，小分子的肽片段或游離氨基酸含量增加。孫麗潔等[24]認為小分子肽更容易通過羥基及疏水相互作用與冰晶表面結(jié)合，阻礙冰晶生長，從而增強抗凍保護活性。另外，Chen 等[25]的研究結(jié)果證明相對分子質(zhì)量為600～2 700的肽有利于吸附到冰的表面或抑制冰重結(jié)晶，從而具有較高的乳酸菌抗凍保護作用。本研究中，相對分子質(zhì)量600～2 700肽洗脫峰對應(yīng)洗脫時間為10.0～11.5 min。由圖1可見，從酶解時間120 min開始，該部分洗脫峰出現(xiàn)明顯變化，在酶解120 min酶解產(chǎn)物的色譜圖中，保留時間11.4 min左右的峰面積相對于酶解15～90 min酶解產(chǎn)物增加了約1倍，占總峰面積的6.14%。然而，在酶解240 min酶解產(chǎn)物的色譜圖中，對應(yīng)峰的面積繼續(xù)增加，占總峰面積的7.03%，但其洗脫時間右移至11.53 min，相對分子質(zhì)量已小于600。

2.3 鰱魚酶解產(chǎn)物的表面疏水性

表面疏水性是蛋白質(zhì)表面殘基的疏水基團引起的一種表面性質(zhì)，決定了其溶解度、穩(wěn)定性和自締合能力等。根據(jù)反相高效液相色譜的出峰時間和特征，以保留時間11 min為分界點，根據(jù)11 min后峰面積與總峰面積的比值計算樣品的疏水性系數(shù)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，隨著酶解時間增加，酶解產(chǎn)物的疏水性系數(shù)呈先下降后上升的趨勢，酶解時間為120 min時達到最低值（0.42），至酶解時間為240 min時又顯著回升（P<0.05）。酶解產(chǎn)物表面疏水性的變化可能與其水解過程中生產(chǎn)的肽、游離氨基酸的比例和性質(zhì)有關(guān)，顏阿娜等[26]認為抗凍多肽的表面疏水性一般都比較弱，但鰱魚酶解產(chǎn)物的組成比較復(fù)雜，其表面疏水性與抗凍性能的相關(guān)性還有待明確。

2.4 鰱魚酶解產(chǎn)物的活性巰基含量

鰱魚酶解產(chǎn)物中活性巰基含量隨酶解時間的變化如圖3所示。可見，隨著酶解時間延長，酶解產(chǎn)物中活性巰基含量呈先降后升趨勢。酶解前期，可能部分巰基被氧化形成二硫鍵，導(dǎo)致活性巰基含量有所下降，酶解30 min時酶解產(chǎn)物的活性巰基含量最低（72.50 μmol/g）;隨著酶解時間的延長，水解度逐漸增大，大量內(nèi)部的巰基暴露或游離出來，因而活性巰基含量顯著增加（P<0.05），酶解240 min時酶解產(chǎn)物的活性巰基含量增加至105.01 μmol/g。目前還沒有報道證實抗凍蛋白質(zhì)（或肽）的活性巰基含量與其抗凍性能的聯(lián)系，但體系中適量的巰基存在可以起到穩(wěn)定水分子的作用，從而抑制水分遷移和冰晶形成，減輕蛋白質(zhì)冷凍變性和細胞機械損傷[23]。

2.5 乳酸菌的耐凍性能

乳酸菌經(jīng)2、4、6個凍融循環(huán)處理后存活率分別為56.90%±5.43%、22.82%±3.02%、1.12%±0.42%，各處理之間差異顯著。可見，隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，乳酸菌的存活率越來越低，經(jīng)過6次凍融循環(huán)后存活率僅為1.12%，說明本研究使用的乳酸菌耐凍性能較差。因此，為提高乳酸菌冷凍后的活菌數(shù)，添加抗凍保護劑十分必要。

2.6 不同酶解時間鰱魚酶解產(chǎn)物對乳酸菌的抗凍保護效果

在乳酸菌懸液中添加不同酶解時間的鰱魚酶解產(chǎn)物，經(jīng)4次凍融循環(huán)后，其存活率如圖4所示?？梢姡鄬τ趯φ战M（無菌水），不同酶解時間鰱魚酶解產(chǎn)物對乳酸菌均具有一定的抗凍保護作用，其中酶解120 min的酶解產(chǎn)物對乳酸菌的抗凍保護效果最好，存活率超過80%，顯著優(yōu)于陽性對照（8%甘油）（P<0.05）。另外，添加牛血清蛋白（BSA）對乳酸菌存活率的提高并不理想，表明鰱魚酶解產(chǎn)物的抗凍保護作用并不是因為其是蛋白質(zhì)，而可能是因為其中的某種活性組分。此外，抗凍蛋白質(zhì)（肽）通常親水性強、表面疏水性較弱[21，26]，120 min酶解產(chǎn)物的抗凍保護效果最好，可能與其表面疏水性最小（圖2）有關(guān)，也可能是因為其水解度和相對分子質(zhì)量分布（相對分子質(zhì)量600～2 700的肽含量最高）比較適合于發(fā)揮對乳酸菌的低溫保護作用。

2.7 不同質(zhì)量分數(shù)鰱魚酶解產(chǎn)物對乳酸菌凍融存活率的影響

以酶解120 min鰱魚酶解產(chǎn)物為材料研究其對乳酸菌凍融存活率的影響，結(jié)果如圖5所示?？梢?，當(dāng)酶解產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)為4%時，乳酸菌的存活率可達85.20%，質(zhì)量分數(shù)繼續(xù)增加，存活率反而顯著下降（P<0.05），這可能與高質(zhì)量分數(shù)酶解產(chǎn)物導(dǎo)致的高滲環(huán)境對乳酸菌細胞的滲透損傷有關(guān)[27]。楊云等[28]研究指出，高質(zhì)量分數(shù)保護劑的使用會給細胞帶來副作用，在冷凍保護劑加載和去除過程中，由于胞外滲透壓的急劇變化，會引起細胞體積的急劇收縮或膨脹，從而造成細胞膜結(jié)構(gòu)和細胞骨架系統(tǒng)的損傷。同時，冷凍保護劑自身的化學(xué)毒性也會對細胞造成毒性損傷。

3 結(jié)論

本研究制備了酶解15 min、30 min、60 min、120 min、240 min的鰱魚酶解產(chǎn)物，分析了其相對分子質(zhì)量分布、氨基酸組成、表面疏水性、活性巰基含量及其對乳酸菌的抗凍保護活性。結(jié)果表明，系列酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布主要在 9.00×101至5.40×105，不同酶解時間鰱魚酶解產(chǎn)物的氨基酸組成和含量基本相同，親水性氨基酸比例較高，大于氨基酸總量的68%;隨著酶解時間增加，酶解產(chǎn)物的表面疏水性和活性巰基含量均呈先降后升趨勢，其中酶解120 min鰱魚酶解產(chǎn)物的表面疏水性最低，酶解30 min鰱魚酶解產(chǎn)物的活性巰基含量最低。本研究使用的乳酸菌耐凍性能較差，經(jīng)過4次凍融循環(huán)后存活率為22.82%;不同酶解時間鰱魚酶解產(chǎn)物均對乳酸菌有一定的抗凍保護作用，其中酶解120 min酶解產(chǎn)物對乳酸菌的抗凍保護效果最好，添加質(zhì)量分數(shù)為4%時可使乳酸菌經(jīng)過4次凍融循環(huán)后的存活率提高至85.20%。說明鰱魚酶解產(chǎn)物是一種良好的乳酸菌抗凍保護劑，對乳酸菌低溫保藏或凍干過程中提高其存活率具有潛在價值。

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（責(zé)任編輯：張震林）

收稿日期：2020-06-09

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31972106）;湖南省自然科學(xué)基金項目（2020JJ4096）;湖南省教育廳科學(xué)研究項目（17B016、17C0059、18C0233）

作者簡介：崔美麗（1996-），女，山東濱州人，碩士研究生，從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏的研究。（E-mail）cml1070857060@163.com

通訊作者：王發(fā)祥，（E-mail）wfx@csust.edu.cn