林智慧 鄧新發(fā) 王雪仁 蘇丹 封磊 宋萍

摘? 要：為了解煙草內(nèi)生菌的煙堿降解機(jī)制，以一株具有高效煙堿降解功能的內(nèi)生菌G16為對(duì)象，通過降解培養(yǎng)及代謝產(chǎn)物分析，對(duì)其煙堿降解特征進(jìn)行研究。結(jié)果表明，該菌株經(jīng)鑒定為Rhizobium sp.G16，在煙堿培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)符合Slogistic模型，煙堿對(duì)G16菌株的最大生長(zhǎng)抑制濃度為4000 mg/L;G16菌株的煙堿降解受到pH、接種量及煙堿濃度的影響，其降解過程可采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行描述;對(duì)G16菌株降解煙堿的中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)主要為尼古丁提林、3-（3， 4-dihydro-2H-pyrrol-5-yl）pyridine、脫甲基尼古丁、2，3-聯(lián)吡啶、可鐵寧等物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：煙堿;內(nèi)生菌;降解特征;動(dòng)力學(xué);中間產(chǎn)物

Abstract： In order to understand the nicotine-degrading mechanisms of tobacco endophytes， an endophytic bacterial strain G16 with a high efficiency nicotine-degrading capability was chosen， and its nicotinedegrading characteristics were studied through the methods of nicotine degradation culture and metabolite analysis. The results showed that the strain G16 was identified as Rhizobium sp.G16 and its growth in nicotine medium could be fitted well by the Slogistic model. The growth inhibition concentration of nicotine for strain G16 was 4000 mg/L. The nicotine degradation capability of strain G16 was affected by pH value， inoculation amount of bacterium， and nicotine concentration of broth. Moreover， the results of metabolite analysis by GC-MS showed that the intermediate products of G16 nicotine degradation included nicotyrine， 3-（3，4-dihydro-2H-pyrrol-5-yl） pyridine， nornicotine， cotinine， and so on.

Keywords： nicotine; entophyte; degradation characteristics; dynamics; intermediate product

煙堿又稱尼古丁，是煙草生物堿的主要成分，也是衡量煙草品質(zhì)的重要指標(biāo)[1]。我國(guó)是煙草生產(chǎn)大國(guó)，所產(chǎn)煙葉在外觀質(zhì)量上已接近或達(dá)到先進(jìn)產(chǎn)煙國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)，但其內(nèi)在品質(zhì)還存在一定的差距，其中一個(gè)重要的原因就是上部煙葉中煙堿含量普遍過高，影響了煙葉質(zhì)量和工業(yè)可用性[2]。因此如何降低上部煙葉中的煙堿含量，已成為煙草行業(yè)急需解決的問題。

截止目前，國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)者已在品種選育、農(nóng)業(yè)種植、物化處理、生物降解等多個(gè)領(lǐng)域就如何降低煙葉中煙堿含量進(jìn)行了大量研究[3-6]，雖然取得了一定的進(jìn)展，但種植煙葉質(zhì)量受困于煙堿含量這一問題仍然沒有得到有效解決。近年來，隨著研究的不斷深入，一些具有煙堿降解功能的煙草內(nèi)生菌被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，并引起了研究者的廣泛關(guān)注。如李天麗[7]從陳化煙葉中分離得到具有降解煙堿活性的混合菌群，并通過液體發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)該混合菌群的煙堿降解行為進(jìn)行了研究;趙麗萍等[8]從62個(gè)煙葉樣品中篩選出一株煙堿降解內(nèi)生細(xì)菌，該菌在煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1‰的培養(yǎng)基中培養(yǎng)54 h后，其最高降解率為98.76%;米其利[9]則從曬煙調(diào)制期煙葉中分離出一株P(guān)seudomonas sp.L16，將該菌株的發(fā)酵液噴灑在煙葉表面不但能有效降低煙葉中煙堿含量，還會(huì)使煙葉的內(nèi)在化學(xué)成分更加協(xié)調(diào)。然而，目前有關(guān)內(nèi)生菌降解煙堿方面的研究尚處于初始階段，所涉及內(nèi)容也多集中在分離鑒定及田間施用方面，關(guān)于煙草內(nèi)生菌對(duì)煙堿降解機(jī)制方面的研究，則罕見報(bào)道。而了解這些內(nèi)生菌的煙堿降解機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步探究該類菌株在煙草體內(nèi)煙堿生物合成過程中的功能作用具有重要意義。

本研究以一株從福建三明煙區(qū)篩選的高效煙堿降解內(nèi)生菌為對(duì)象，對(duì)其生長(zhǎng)及煙堿降解特征進(jìn)行研究，其研究成果對(duì)于揭示煙草內(nèi)生菌的煙堿降解機(jī)制，促進(jìn)植物內(nèi)生菌在煙草領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用具有一定的參考價(jià)值。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試煙草植株：供試煙草植株于2019年5月采集于福建省煙科所三明市分所沙陽田間試驗(yàn)場(chǎng)，品種為云煙87。

主要試劑：煙堿（分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%），購(gòu)自羅恩公司;煙堿標(biāo)準(zhǔn)品（色譜級(jí)，HPLC≥98%），購(gòu)自麥卡希;甲醇（色譜級(jí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.99%），購(gòu)自阿拉丁公司;磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀純度均為色譜純，其他試劑均為AR級(jí)試劑。

煙堿培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 13.3 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，微量元素溶液（MnSO4·7H2O 0.4 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2 g使用0.1 mol/L HCl定容至100 mL）0.5 mL，加水定容至1000 mL，pH為7.0，于121 ℃滅菌20 min[10]。煙堿滅菌后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，備用。上述煙堿培養(yǎng)基中加入18 g瓊脂即為煙堿固體培養(yǎng)基。

1.2? 降煙堿內(nèi)生菌的分離

采用組織分離和平板涂布法分離內(nèi)生菌[11]。選取健康的煙草植株，對(duì)其根、莖、葉進(jìn)行清洗、消毒。以最后一次清洗的無菌水為空白對(duì)照，檢驗(yàn)其表面消毒效果。將表面消毒的植物組織研磨成勻漿，稀釋涂布在煙堿固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。挑取不同形態(tài)的單菌落，經(jīng)多次劃線培養(yǎng)得到純菌。

1.3? 菌種鑒定

1.3.1? 菌株形態(tài)特征? 將篩選得到的內(nèi)生菌挑取至煙堿固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，觀察平板中菌落的生長(zhǎng)情況，并在掃描電子顯微鏡下（Phenom ProX

SEM）觀察其形態(tài)特征。

1.3.2? 16S rDNA序列測(cè)定? 內(nèi)生菌的DNA純化與16S rDNA測(cè)序工作由上海美吉生物公司完成。16S rDNA擴(kuò)增的通用引物為27F：5'-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3'。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，25次循環(huán)，72 ℃延伸10 min，40 ℃保存。測(cè)序結(jié)果通過NCBI上的Blast程序進(jìn)行同源性比對(duì)，并利用MEGA6軟件的Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4? 菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究

將內(nèi)生菌種子液按1%的接種量接種至50 mL的煙堿培養(yǎng)基中（pH=7.0，煙堿濃度為500 mg/L），于150 r/min回旋振蕩、30 ℃下恒溫培養(yǎng)30 h，每3 h對(duì)培養(yǎng)進(jìn)行取樣，測(cè)定其在600 nm波長(zhǎng)下的OD值，利用Slogistic模型對(duì)內(nèi)生菌進(jìn)行生長(zhǎng)曲線動(dòng)力學(xué)擬合[12]，并計(jì)算相關(guān)的擬合模型參數(shù)。

式中：t為時(shí)間;和分別表示在時(shí)間t時(shí)和初始時(shí)間的菌株數(shù)量;為最大菌數(shù)與初始菌數(shù)的差值;為菌株達(dá)到最大生長(zhǎng)速率的時(shí)間;為在時(shí)間點(diǎn)的最大生長(zhǎng)速率;為菌株最大比生長(zhǎng)速率;λ為菌株生長(zhǎng)的延滯期。

1.5? 菌株生長(zhǎng)的抑制濃度測(cè)定

分別在煙堿濃度為100、500、1500、2000、3000和5000 mg/L的液體培養(yǎng)基中，接種1%的內(nèi)生菌種子液，150 r/min、30 ℃下恒溫培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，測(cè)定其在600 nm下的吸光值（OD），每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.6? 菌株降解煙堿特性研究

1.6.1? 煙堿濃度測(cè)定? 采用高效液相色譜（Thtermo Fisher U3000）測(cè)定煙堿濃度[13]。色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm），紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。流動(dòng)相為甲醇與0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.5）混合溶液，體積比為60：40，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃。

1.6.2? pH、接種量和煙堿濃度對(duì)菌株降解煙堿能力的單因素影響? 將培養(yǎng)24 h的內(nèi)生菌種子液接種到煙堿培養(yǎng)基中，依次測(cè)定pH值為5、6、7、8、9，接種量為1%、2%、5%，煙堿濃度為500、1500、2000、3000 mg/L時(shí)菌株的生長(zhǎng)及煙堿降解情況，每次都將上一優(yōu)化結(jié)果用于下一因素的優(yōu)化。

1.6.3? 降解動(dòng)力學(xué)? 將內(nèi)生菌種子液按1%的接種量接種至50 mL的煙堿培養(yǎng)基中，在pH=7.0，煙堿初始濃度為500、1500、2000、3000 mg/L條件下培養(yǎng)48 h，每6 h進(jìn)行取樣，測(cè)定其在600 nm波長(zhǎng)下的OD值，采用一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)公式（4）對(duì)煙堿降解情況進(jìn)行擬合。

式中，為煙堿的初始濃度（mg/L）;為t時(shí)刻體系中煙堿的濃度（mg/L）;k為煙堿降解速率常數(shù)（h-1）;t為降解時(shí)間（h）。

1.7? 降解產(chǎn)物分析

將內(nèi)生菌種子液按1%的接種量接種至50 mL的煙堿培養(yǎng)基中（pH=7.0，煙堿濃度為500 mg/L），于150 r/min回旋振蕩、30 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，每6 h進(jìn)行取樣，測(cè)定其在600 nm波長(zhǎng)下的OD值，樣品于4 ℃、12000 r/min，離心30 min后獲得上清液。上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后以高純氮?dú)獯悼s至1 mL，用于氣質(zhì)聯(lián)用儀（島津GCMS-TQ8040）檢測(cè)[14]。檢測(cè)條件為：進(jìn)樣口溫度為250 ℃，分流模式，SH-Rxi-5Sil MS色譜柱。程序升溫：60 ℃保持2 min，以10 ℃/min速率升溫至280 ℃，保持10 min。質(zhì)譜條件為：離子源溫度250 ℃，掃描范圍28～500 m/z，載氣氦氣，流速1.0 mL/min。采集完的數(shù)據(jù)，經(jīng)過GCMS Postrun Analysis定性處理，檢索譜庫(kù)為NIST4譜庫(kù)。

2? 結(jié)? 果

2.1? 降煙堿功能內(nèi)生菌的篩選及鑒定

利用煙堿培養(yǎng)基，從煙草根部分離篩選出1株具有高效降解煙堿功能的內(nèi)生細(xì)菌G16（圖1）。該菌株為半透明的淡黃色濕潤(rùn)菌體，菌落呈現(xiàn)圓凸型，易于挑起，通過掃描電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)菌株G16呈現(xiàn)直桿狀，菌體大小約為0.6～1.0 μm。

通過16S rDNA序列測(cè)定，并經(jīng)Blast程序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株G16與熱帶根瘤菌Rhizobium tropici CIAT 899 （NR-102511.1）的相似度為99%，表明菌株G16為根瘤菌屬，故命名為根瘤菌G16（Rhizobium sp.G16），并且在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株G16也與熱帶根瘤菌Rhizobium tropic處于同一分支（圖2）。同時(shí)，菌株G16的16S rDNA測(cè)序結(jié)果已上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，注冊(cè)登錄號(hào)為MN712240。

2.2? 菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究

采用Slogistic模型對(duì)菌株G16在煙堿培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)過程進(jìn)行擬合（圖3），相關(guān)的擬合參數(shù)如表1所示。由表1的數(shù)據(jù)可知，Slogistic模型的擬合程度較高，R2為0.989，可以較好地描述菌株G16的生長(zhǎng)情況。另外，通過該模型預(yù)測(cè)可知，菌株G16在煙堿培養(yǎng)基中經(jīng)過16.509 h可達(dá)到其最大生長(zhǎng)速率，最高菌體生長(zhǎng)數(shù)量的OD600值為0.173，最大菌體比生長(zhǎng)率約為0.016，生長(zhǎng)延遲期約為11.059 h。

2.3? 菌株G16的生長(zhǎng)抑制濃度

由圖4可知，不同濃度的煙堿會(huì)對(duì)菌株G16生長(zhǎng)產(chǎn)生不同程度的影響，其菌體數(shù)量隨著煙堿濃度的增大呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)煙堿濃度介于1500～3000 mg/L之間時(shí)，G16生長(zhǎng)良好，并且當(dāng)煙堿濃度為1500 mg/L時(shí)，菌株G16的細(xì)胞生長(zhǎng)量最大，而當(dāng)煙堿濃度增至4000 mg/L時(shí)，則該菌株的生長(zhǎng)迅速下降，表明煙堿對(duì)菌株G16的最小生長(zhǎng)抑制濃度為4000 mg/L。

2.4? 菌株G16的煙堿降解特性

2.4.1? pH對(duì)菌株G16降解煙堿的影響? 不同pH對(duì)菌株G16煙堿降解能力的影響如圖5所示。從圖中可知，在pH值為5.0～8.0范圍內(nèi)，菌株G16均能取得較高的煙堿降解率，并且當(dāng)pH值為7.0時(shí)，煙堿的降解率最高，為93%。然而，當(dāng)培養(yǎng)基中pH值超過8.0時(shí)，該菌株的煙堿降解能力則明顯受到抑制。

2.4.2? 接種量對(duì)菌株G16降解煙堿的影響? 菌株G16接種量對(duì)其煙堿降解能力的影響如圖6所示。當(dāng)接種量為1%、2%、5%、10%時(shí)，菌株G16達(dá)到其最高煙堿降解率的時(shí)間分別為24、24、15和12 h，說明菌體接種量的增加可以顯著提升菌株G16對(duì)煙堿的降解速率。然而，經(jīng)過24 h的培養(yǎng)，對(duì)比不同接種量條件下的煙堿最終降解數(shù)量，發(fā)現(xiàn)并無明顯差異，均可達(dá)到約90%左右的降解率，表明菌體接種量對(duì)最終煙堿降解率影響不大。

2.4.3? 煙堿濃度對(duì)菌株G16降解煙堿的影響? 由于不同菌株對(duì)高毒性煙堿耐受程度的不同，其降解能力受煙堿濃度影響的程度也存在著一定的差異。從圖7可以看出，當(dāng)煙堿濃度為500 mg/L時(shí)，菌株G16降解速率最快，在培養(yǎng)24 h后基本降解完全;當(dāng)煙堿濃度為1500和2000 mg/L，其降解速率較慢，在培養(yǎng)48 h后其降解率分別為92%、89%。當(dāng)煙堿濃度為3000 mg/L時(shí)，則在48 h內(nèi)無法完全降解，降解率僅為32%。

2.4.4? 降解動(dòng)力學(xué)分析? 采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)菌株G16的煙堿降解行為進(jìn)行擬合，相關(guān)擬合參數(shù)如表2所示。從表中可知，當(dāng)菌體接種量一定時(shí)，菌株G16的煙堿降解速率常數(shù)隨著濃度的增大而減小。其相關(guān)系數(shù)R2為0.88～0.95，說明該模型可以較好的反映菌株G16的煙堿降解情況。

2.5? 降解產(chǎn)物分析

采用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)菌株G16在降解煙堿過程中的中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測(cè)，結(jié)果如圖8所示。從檢測(cè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，其成分主要包括煙堿（Nicotine，RT=12.303 min）、脫甲基尼古丁（RT=13.326 min）、3-（3，4-dihydro-2H-pyrrol-5-yl） pyridine（RT=13.396 min）、尼古丁提林（RT=14.096 min）、新煙堿（RT=14.286 min）、去氫新煙堿（RT=14.666 min）、2，3-聯(lián)吡啶（RT=14.884 min）、2，5，6-trimethyl-1H-benzimidazole（RT=15.356 min）、可鐵寧（RT=16.97 min）和2-cyclohexylidene- cyclohexanone（RT=17.855 min）等物質(zhì)。

3? 討? 論

植物內(nèi)生菌是指那些在其生活史中的某一段或全部時(shí)期生活在植物組織內(nèi)，對(duì)植物組織沒有引起明顯外觀特征變化的微生物[15]。內(nèi)生菌長(zhǎng)期生活在植物體內(nèi)環(huán)境中并與宿主協(xié)同進(jìn)化，其對(duì)宿主植物的生長(zhǎng)和生理生化均會(huì)產(chǎn)生重要影響。近年來，伴隨著微生物降解煙堿研究的興起，一些具有煙堿降解功能的煙草內(nèi)生菌被不斷分離出來，而了解這些內(nèi)生菌的煙堿降解特征及作用機(jī)制，有助于揭示該類微生物在宿主煙堿合成過程中所扮演的功能角色。

本研究所篩選的煙草內(nèi)生菌Rhizobium sp. G16對(duì)煙堿的降解率最高可達(dá)93%，但其生長(zhǎng)情況卻與培養(yǎng)基中的煙堿濃度密切相關(guān)，濃度過高或過低均不利于該菌株的生長(zhǎng)。而之所以出現(xiàn)這種情況，是由于煙堿作為培養(yǎng)基中唯一的碳源與氮源，當(dāng)其處于低濃度時(shí)，其供給量無法滿足G16的生長(zhǎng)，而隨著煙堿濃度的升高，G16獲取了生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，菌體數(shù)量明顯增加，但當(dāng)煙堿的濃度超出了G16生長(zhǎng)所需，過量的煙堿又會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)。另外，不同煙堿降解菌受pH值的影響也不盡相同，如萬虎等[16]從煙草廢棄物中篩選出一株惡臭假單胞菌P. putida，但該菌株只有在pH為6.5～7.5時(shí)才具有較高的煙堿降解活性。而本研究篩選的內(nèi)生菌G16，在pH值為5.0～8.0范圍內(nèi)，煙堿降解率均可達(dá)到90%上下，擁有更好的酸堿適應(yīng)能力。

目前，盡管已報(bào)道了多株微生物對(duì)煙堿的降解途徑，然而由于微生物種類眾多，有關(guān)根瘤菌屬（Rhizobium sp.）代謝煙堿的途徑，至今尚未見報(bào)道。在Rhizobium sp. G16的煙堿降解中間產(chǎn)物中，脫甲基尼古?。∟ornicotine，產(chǎn)物I）、尼古丁提林（Nicotyrine，產(chǎn)物II）、可鐵寧（Cotinine，產(chǎn)物III）為煙堿常見的代謝產(chǎn)物[17-20]，與Pseudomonas sp.HF-1代謝煙堿的產(chǎn)物有一定的相似性，而新煙堿和去氫新煙堿兩種化合物也是在煙堿降解過程中常見的物質(zhì)，并且為含量較高的次要生物堿成分。至于3-（3，4-dihydro-2H-pyrrol-5-yl）pyridine，WANG等[21]在研究Pseudomonas sp. CS3的煙堿代謝過程時(shí)，也曾檢測(cè)到該化合物，并推測(cè)其是由煙堿去甲基化而形成的;而2，3-聯(lián)吡啶也曾在Pseudomonas sp. Nic22[22]和Sphingomonas sp. TY[14]的煙堿代謝過程中被檢測(cè)出來過，但該物質(zhì)在微生物煙堿代謝中究竟是如何生成的，至今還未見相關(guān)的報(bào)道。綜上所述，由于Rhizobium sp. G16的煙堿降解中間產(chǎn)物與Pseudomonas sp.菌屬的煙堿降解產(chǎn)物具有較多的重合性，推測(cè)二者可能具有類似的煙堿降解途徑。

4? 結(jié)? 論

本研究篩選的高效煙堿降解內(nèi)生菌經(jīng)鑒定為Rhizobium sp. G16，其生長(zhǎng)符合Slogistic模型，降解活性最高抑制濃度為4000 mg/L。菌株G16在pH為5.0～8.0范圍內(nèi)，降解率均為90%以上，具有較好的穩(wěn)定性和適應(yīng)范圍。G16對(duì)煙堿的降解速率隨著接種量的增加而增加，但對(duì)24 h后煙堿的最終降解程度并無顯著差異。菌株G16為新發(fā)現(xiàn)的降煙堿微生物，通過中間產(chǎn)物分析，推測(cè)其與Pseudomonas sp.菌屬具有類似的煙堿降解途徑。下一步將繼續(xù)對(duì)不同階段煙堿降解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)及深入分析，以揭示菌株G16的煙堿降解機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1]尹鵬嘉，任民，孫鑫，等. 烤煙主要農(nóng)藝性狀變異特征以及與煙堿含量的相關(guān)分析[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2018，39（1）：10-16.

YIN P J， REN M， SUN X， et al. Variation of main agronomic traits and correlation analysis of nicotine content in flue-cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39 （1）： 10-16.

[2]鄧高毅，彭宇，王遠(yuǎn)亮. 降煙堿融合子及其親株大田降解煙葉中煙堿的研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（1）：23-29.

DENG G Y， PENG Y， WANG Y L. Study on degrading nicotine in tobacco leaves bynicotine-degrading fusant and its parent strains[J]. Guangdong Agricultural Sciences，2017， 44 （1）： 23-29.

[3]李宗平，覃光炯，陳茂勝， 等. 不同栽培方式對(duì)白肋煙煙堿轉(zhuǎn)化率及TSNA含量的影響[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2015，36（6）：62-67.

LI Z P， QIN G J， CHEN M S， et al. Influence of different cultivation methods on nicotine conversion and tsna content of burley tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2015， 36 （6）： 62-67.

[4]邱堯，周冀衡，黃劭理，等. 打頂后氮素供應(yīng)和腋芽生長(zhǎng)互作對(duì)烤煙煙堿積累的影響[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2016，37（4）：19-23.

QIU Y， ZHOU J H， HUANG S L， et al. Interaction effects of nitrogen supply and axillary bud growth after topping on nicotine accumulation in flue-cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37 （4）： 19-23.

[5]陳辰，朱潤(rùn)琪，倪新程，等. 一株新的尼古丁降解菌的分離鑒定及降解特性[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2019，40（1）：89-97.

CHEN C， ZHU R Q， NI X C， et al. Isolation， identification and characteristics of a new nicotine degrading strain[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40 （1）： 89-97.

[6]李宗平，李進(jìn)平，陳茂勝，等. 晾制溫濕度對(duì)白肋煙生物堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化的影響研究[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2009，15（4）：61-64.

LI Z P， LI J P， CHEN M S， et al. Effects of temperature and humidity on alkaloid content and nicotine conversion in burley tobacco curing[J]. Acta Tabacaria Sinica，， 2009， 15 （4）： 61-64.

[7]李天麗. 陳化煙葉中煙堿降解菌的分離和特性研究[D]. 南京：南京大學(xué)，2012.

LI T L. Isolation and characterization of bacterium with nicotine-degrading ability from aging flue-cured tobacco leaves[D]. Nanjing： Nanjing University， 2012.

[8]趙麗萍，夏振遠(yuǎn)，雷麗萍，等. 煙堿降解菌株11L140的鑒定及降解特性研究[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2013，28（3）：366-371.

ZHAO L P， XIA Z Y， LEI L P， et al. Isolation and nicotine degrading characterization of strain 11l140[J].Journal of Yunnan Agricultural University （Natural Science）， 2013， 28 （3）： 366-371.

[9]米其利. 曬黃煙調(diào)制期煙葉微生物多樣性和功能菌株在煙葉調(diào)制中的應(yīng)用[D]. 昆明：云南大學(xué)，2017.

MI Q L. Microbial diversity of yellow sun-cured tobacco leaves and application of functional strains to tobacco leaves during curing[D]. Kunming： Yunnan University， 2017.

[10]韓紹印，李永寬，席宇，等. 尼古丁降解菌的分離篩選及初步鑒定[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（9）：48-51.

HAN S Y， LI Y K， XI Y， et al. Isolation and identification of nicotine-deg rading microbes[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences， 2007（9）： 48-51.

[11]王伯勛，王學(xué)東，段桂蘭. 水稻不同生長(zhǎng)時(shí)期不同組織中抗砷內(nèi)生菌的篩選與鑒定[J]. 環(huán)境科學(xué)，2018，39（5）：2464-2471.

WANG B X， WANG X D， DUAN G L. Screening and identification of arsenic-resistant endophytic bacteria from different rice tissues （Oryza sativa l.） in different growth stages[J]. Environmental Science， 2018， 39（5）： 2464-2471.

[12]GIBSON A M， BRATCHELL N， ROBERTS T A. The effect of sodium chloride and temperature on the rate and extent of growth of clostridium botulinum type A in pasteurized pork slurry[J]. The Journal of Applied Bacteriology， 1987， 62（6）： 479-490.

[13]儲(chǔ)志兵，周新光，水恒福，等. 超聲提取-高效液相色譜法測(cè)定煙草中煙堿含量[J]. 化工技術(shù)與開發(fā)，2007，36（2）：46-48.

CHU Z B， ZHOU X G， SHUI H F， et al. Determination of nicotine content from tobacco by HPLC[J]. Technology & Development of Chemical Industry， 2007， 36（2）： 46-48.

[14]楊貴芹. 兩株高效尼古丁降解菌的分離鑒定及其尼古丁代謝途徑的分析[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2011.

YANG G Q. Isolation， identification and nicotine metabolism pathways analysis of two nicotine-degrading bacteria[D]. Hangzhou： Zhejiang University， 2011.

[15]PETRINI O. Fungal endophytes of tree leaves. In： Microbial Ecology of Leaves[M]. New York： Springer-Verlag， 1991.

[16]萬虎. 煙堿降解菌PSEUDOMONAS PUTIDA ZB-16A的分離篩選及降解特性研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

WAN H. Study on isolation and characterization of nicotine degrading bacterium strain pseudomdnas putida ZB-16A[D]. Wuhan： Huazhong Agricultural University， 2008.

[17]邵鐵娟. 假單胞菌菌株HF-1的尼古丁代謝途徑及其分子生物學(xué)研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2007.

SHAO T J. Studies on nicotine metabolic pathway as well as molecular biology in pseudomortas sp. HF-1[D]. Hangzhou： Zhejiang University， 2007.

[18]JIANG H J， MA Y， QIU G J， et al. Biodegradation of nicotine by a novel Strain Shinella sp HZN1 isolated from activated sludge[J]. Journal of Environmental Science And Health Part B-Pesticides Food Contaminants And Agricultural Wastes， 2011， 46（8）： 703-708.

[19]WANG H H， YIN B， PENG X X， et al. Biodegradation of nicotine by newly isolated pseudomonas sp CS3 and its metabolites[J]. Journal of Applied Microbiology， 2012， 112（2）： 258-268.

[20]LIU Y， WANG L， HUANG K， et al. Physiological and biochemical characterization of a novel nicotine-degrading bacterium pseudomonas geniculata N1[J]. Plos One， 2014， 9 （1）： 1-9.

[21]WANG H H， YIN B， PENG X X， et al. Biodegradation of nicotine by newly isolated pseudomonas sp CS3 and its metabolites[J]. Journal of Applied Microbiology， 2012， 112（2）： 258-268.

[22]CHEN C， LI X， YANG J， et al. Isolation of nicotine-degrading bacterium Pseudomonas sp. Nic22， and its potential application in tobacco processing[J]. International Biodeterioration & Biodegradation， 2008， 62（3）： 226-231.