黎妍妍 馮吉 王林 付裕 李錫宏

摘? 要：基于大田試驗(yàn)和Illumina Hiseq擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，分析了萬(wàn)壽菊-煙草輪作對(duì)植煙土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)的影響，旨在為緩解煙草連作障礙提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，萬(wàn)壽菊-煙草輪作可提高煙株根際土壤細(xì)菌群落Sobs、Shannon和Chao 1等多樣性和豐富度指數(shù);提升土壤中酸桿菌門（Acidobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度;促使生防菌（Pseudomonas）、功能菌（Candidatus_Solibacter、Bryobacter和Bradyrhizobium）、降解菌（Massilia、Novosphingobium和Ramlibacter）和根際促生菌（Flavisolibacter）等菌屬比例上升，有利于改善土壤微生態(tài)環(huán)境、緩解連作障礙。

關(guān)鍵詞：萬(wàn)壽菊;輪作;細(xì)菌群落;多樣性

Abstract： The research aims to provide a theoretical basis for alleviating the obstacles of tobacco continuous cropping. Field experiments and amplicon sequencing based on Illumina Hiseq were conducted to explore the effects of marigold-tobacco rotation on the diversity and structure of bacterial communities in tobacco rhizosphere soil. The results showed that marigold-tobacco rotation could greatly improve the Sobs， Shannon， Chao 1 indexes of soil bacterial communities. And， marigold-tobacco rotation can also improve the relative abundance of Acidobacteria and Bacteroidetes， and increase the proportion of biocontrol bacterium genera （Pseudomonas）， functional bacteria genera （Candidatus_Solibacter， Bryobacter and Bradyrhizobium）， degrading bacteria genera （Massilia， Novosphingobium and Ramlibacter） and plant growth promoting rhizobacteria （Flavisolibacter）. In conclusion， marigold-tobacco rotation is strongly conducive to the improvement of soil microecological environment and alleviation of the obstacles of tobacco continuous cropping.

Keywords： marigold; rotation; bacterial community; diversity

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，屬茄科忌連作的作物。然而，目前連作是我國(guó)煙草的主要種植制度，煙草連作面積占總種植面積的30%～60%[1]。長(zhǎng)期連作可導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失衡[2]和肥料利用率下降[3];化感物質(zhì)（或潛在化感物質(zhì)）增多[4];根際微生態(tài)失調(diào)，土壤中與營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)相關(guān)的微生物數(shù)量降低，而病原微生物數(shù)量增加[5-6];由此形成連作障礙，即使在正常管理情況下也會(huì)出現(xiàn)煙草生育狀況變差、產(chǎn)量和品質(zhì)降低、病蟲害發(fā)生加重等問(wèn)題。

萬(wàn)壽菊（Tagetes erecta L.）為菊科萬(wàn)壽菊屬植物，多用于色素提取。近年來(lái)的研究表明，萬(wàn)壽菊與煙草、大豆等作物輪作可有效降低土壤中線蟲的數(shù)量，提升線蟲多樣性指數(shù)，有利于線蟲群落結(jié)構(gòu)的平衡[7-8];萬(wàn)壽菊-當(dāng)歸輪作對(duì)土壤真菌群落組成具有顯著影響[9];萬(wàn)壽菊-煙草套作可提高根際土壤細(xì)菌群落多樣性[10]。因此，萬(wàn)壽菊的不同利用方式在調(diào)控土壤微生態(tài)方面具有明顯的積極作用。然而，能否通過(guò)萬(wàn)壽菊-煙草輪作來(lái)調(diào)理植煙土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，緩解煙草連作障礙，卻鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)在連作數(shù)年的煙田進(jìn)行萬(wàn)壽菊-煙草輪作，分析評(píng)價(jià)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，以期為尋求緩解或克服煙草連作障礙的方法提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 田間試驗(yàn)設(shè)置

試驗(yàn)于2016—2018年在湖北省恩施州宣恩縣椒園鎮(zhèn)涼風(fēng)村進(jìn)行。試驗(yàn)地?zé)煵葸B作15年，種植煙草品種為云煙87。試驗(yàn)包括2個(gè)處理，3次重復(fù)，共6個(gè)小區(qū)。處理1：煙草連作（C）;處理2：萬(wàn)壽菊-煙草輪作（R），即2016—2017年種植萬(wàn)壽菊、2018年種植煙草。煙草行株距為1.2 m×0.55 m，每小區(qū)種植烤煙100株，4月25日移栽。

1.2? 土壤樣品采集

2018年，處理1和處理2中煙草移栽后50 d、100 d時(shí)，采用5點(diǎn)取樣法采集煙株根際土壤樣品（與根系結(jié)合較緊密的土壤，在4 mm內(nèi)），分別記作C_50、R_50、C_100和R_100。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，共計(jì)12個(gè)土樣。采集后的土樣置于干冰中帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于–80 ℃冰箱，用于DNA提取。

1.3? 土壤細(xì)菌群落分析

1.3.1? DNA提取及PCR擴(kuò)增? 采用FastDNA Spin Kit試劑盒（MP Biomedicals， USA）提取土樣總DNA。以樣品DNA為模板，采用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)細(xì)菌16S rDNA V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（30 ?L）包括：15 ?L Phusion Master Mix Buffer（2×）、3 ?L引物（2 μmol/L）、10 ?L DNA（1 ng/μL）模板和2 ?L ddH2O。反應(yīng)程序：98 ℃ 1 min;98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（30個(gè)循環(huán)）;72 ℃ 5 min（Bio-rad T100梯度PCR儀）。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)合格后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，在Illumina Hiseq PE250測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（諾禾致源生物信息科技有限公司）。

1.3.2? OTU聚類與物種注釋? 以97%的一致性將所有樣品的有效序列聚類成為OTU（Operational Taxonomic Units）。對(duì)OTU代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種的注釋分析。

1.4? 數(shù)據(jù)處理

利用R軟件（V 2.15.3）繪制稀釋曲線圖。利用Qiime軟件（V 1.9.1）計(jì)算Sobs、Chao1豐富度指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)。用SPSS 22.0中的Student's t-test分析細(xì)菌群落豐富度和多樣性指數(shù)、物種相對(duì)豐度等在煙草連作田和輪作田土壤間的差異（p<0.05水平）。在屬水平上，采用LEfSe（LDA Effect Size）多級(jí)物種差異判別分析（LDA值=3）檢測(cè)連作田和輪作田土壤中具有顯著豐度差異的菌屬。

2? 結(jié)? 果

2.1? 數(shù)據(jù)質(zhì)控

對(duì)煙草連作田和輪作田土壤細(xì)菌群落進(jìn)行了數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析。結(jié)果表明（表1），4組樣品的有效序列數(shù)均在80 000條以上，平均序列長(zhǎng)度在253～254 bp之間。在97%一致性的OTU分類水平下，獲得C_50、R_50、C_100和R_100的細(xì)菌OTU數(shù)量均在5000個(gè)以上，其中煙草移栽后50 d和100 d輪作田（R）土壤細(xì)菌群落OTU數(shù)量分別較煙草連作田（C）高1.26%和5.67%。

2.2? 土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度分析

煙草連作田和輪作田土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度指數(shù)見表2。結(jié)果表明，煙草移栽后50 d，輪作田（R_50）土壤細(xì)菌群落Sobs、Shannon和Chao 1指數(shù)分別較連作田（C_50）增加0.12%、0.41%和2.41%;煙草移栽后100 d，輪作田（R_100）土壤細(xì)菌群落Sobs、Shannon和Chao 1指數(shù)分別較連作田（C_100）增加5.41%、4.00%和13.02%，其中shannon（p=0.025）和Chao 1指數(shù)（p=0.049）在R_100和C_100間存在顯著差異。以上結(jié)果表明，萬(wàn)壽菊-煙草輪作可提高土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度。

2.3? 土壤細(xì)菌門水平的組成及差異分析

對(duì)相對(duì)豐度高于1%的土壤細(xì)菌門進(jìn)行了分析（表3）。結(jié)果表明，煙草連作田和輪作田煙草移栽后50 d時(shí)根際土壤高于1%的細(xì)菌門的相對(duì)豐度分別共占96.39%和95.20%;煙草移栽后100 d時(shí)分別共占96.82%和95.32%。變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和浮霉菌門（Planctomycetes）的相對(duì)豐度在C_50、R_50、C_100和R_100中均高于1%;此外，奇古菌門（Thaumarchaeota）在C_50和C_100中的相對(duì)豐度也高于1%。Students t-test差異分析結(jié)果表明，煙草移栽后50 d時(shí)，輪作田（R_50）土壤中酸桿菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著高于連作田（C_50）;煙草移栽后100 d時(shí)，輪作田（R_100）土壤中奇古菌門的相對(duì)豐度顯著低于連作田（C_100）。

2.4? 土壤細(xì)菌屬水平的組成及差異分析

2.4.1? 土壤細(xì)菌屬水平的組成? 對(duì)相對(duì)豐度高于1%的土壤細(xì)菌屬進(jìn)行了分析（圖1）。結(jié)果表明，煙草移栽后50 d時(shí)，煙草連作田（C_50）和輪作田（R_50）土壤中鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、Pseudarthrobacter、乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、H16、RB41和Bryobacter的相對(duì)豐度均高于1%;此外，unidentified_Gemmatimonadaceae和水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）的相對(duì)豐度在C_50中高于1%，但在R_50中低于1%;馬賽菌屬（Massilia）的相對(duì)豐度在R_50中高于1%，但在C_50中低于1%。煙草移栽后100 d時(shí)，煙草連作田（C_100）和輪作田（R_100）土壤中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、Pseudarthrobacter、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、H16、馬賽菌屬（Massilia）和Ramlibacter的相對(duì)豐度均高于1%;此外，慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）的相對(duì)豐度在R_100中高于1%，但在C_100中低于1%。

2.4.2? 細(xì)菌屬水平上的LEfSe多級(jí)物種差異判別分析? 在細(xì)菌屬水平上，對(duì)煙草連作田和輪作田土壤細(xì)菌群落進(jìn)行了LEfSe物種差異判別分析（圖2）。結(jié)果表明，煙草移栽后50 d時(shí)，煙草連作田（C_50）和輪作田（R_50）根際土壤共有8個(gè)細(xì)菌屬存在顯著性差異，其中C_50中水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）、unidentified_Gemmatimonadaceae和鏈球菌屬（Streptococcus）;R_50中假單胞菌（Pseudomonas）、Candidatus_Solibacter、馬賽菌屬（Massilia）和RB41是煙草連作田和輪作田土壤細(xì)菌群落差異的主要類群。煙草移栽后100 d時(shí)，煙草連作田（C_100）和輪作田（R_100）根際土壤共有9個(gè)細(xì)菌屬存在顯著性差異，其中C_100中Rhodanobacter和Gaiella;R_100中慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、新鞘氨醇桿菌（Novosphingobium）、Bryobacter、水庫(kù)桿菌屬（Piscinibacter）、黃色土源菌（Flavisolibacter）、Ramlibacter和馬賽菌屬（Massilia）是煙草連作田和輪作田土壤細(xì)菌群落差異的主要類群。

3? 討? 論

土壤微生態(tài)是有效評(píng)價(jià)土壤健康狀況的重要指標(biāo)[11]。在引起烤煙連作障礙的諸多因素中，根際微生態(tài)失調(diào)是主要因素[12]。因此，調(diào)理根際土壤微生態(tài)是解決煙草連作障礙的關(guān)鍵。

研究表明，微生物群落多樣性可反映其響應(yīng)脅迫的能力，群落多樣性和豐富度指數(shù)越高，其響應(yīng)脅迫的修復(fù)能力也越強(qiáng)[13]。在細(xì)菌、真菌等微生物群落中，細(xì)菌群落多樣性通常被認(rèn)為是恢復(fù)生態(tài)功能進(jìn)而維持生態(tài)系統(tǒng)平衡的重要指標(biāo)[14]。本研究中，萬(wàn)壽菊-煙草輪作可明顯提高煙株根際土壤細(xì)菌群落Sobs、Shannon和Chao 1等多樣性和豐富度指數(shù)。因此，萬(wàn)壽菊-煙草輪作可提高土壤細(xì)菌群落響應(yīng)脅迫的修復(fù)能力，有助于恢復(fù)微生態(tài)平衡。

研究表明，當(dāng)種植模式等外界環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，土壤微生物迅速響應(yīng)，導(dǎo)致微生物豐度、組成等發(fā)生動(dòng)態(tài)變化[15]。本研究也得到類似結(jié)論，萬(wàn)壽菊-煙草輪作田土壤中酸桿菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著升高。酸桿菌主要參與鐵循環(huán)和單碳化合物代謝，對(duì)植物殘?bào)w降解具有重要作用[16];而擬桿菌門的相對(duì)豐度在施用炭化稻殼復(fù)合土壤調(diào)理劑的土壤中也顯著升高[17]。因此，萬(wàn)壽菊-煙草輪作有利于植物殘?bào)w降解，保持土壤生產(chǎn)力的穩(wěn)定，其作用可能與施用炭化稻殼相當(dāng)。

一些重要的細(xì)菌屬在植物生長(zhǎng)、物質(zhì)轉(zhuǎn)化、降解有害物質(zhì)等方面具有重要作用。Pseudomonas是已明確的生防菌，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、改善植物養(yǎng)分吸收狀況的作用，同時(shí)可有效防治多種作物土傳病害[18];Pseudomonas數(shù)量減少可能是導(dǎo)致連作土壤微生物群落發(fā)生變化的原因[19]。Candidatus_Solibacter、Bryobacter和Bradyrhizobium是與土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)的功能菌，分別具有分解有機(jī)質(zhì)、促進(jìn)土壤碳循環(huán)和固氮的作用，在番茄等作物有機(jī)種植和輪作田塊的土壤中這3種菌屬的相對(duì)豐度顯著升高[20-22]。Massilia、Novosphingobium和Ramlibacter可降解多環(huán)芳烴[23-25]，其中，Massilia通過(guò)產(chǎn)生對(duì)土壤病原真菌以及線蟲具有顯著防治作用的二甲基二硫醚，對(duì)土壤具有熏蒸作用[26]。Flavisolibacter為根際促生菌，可促進(jìn)根系發(fā)育[27]。煙草-萬(wàn)壽菊輪作后，煙株根際土壤中這些菌屬的相對(duì)豐度顯著升高，有利于改善土壤微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)煙株生長(zhǎng)發(fā)育，緩解連作障礙。

4? ?結(jié)? 論

本研究分析了萬(wàn)壽菊-煙草輪作在調(diào)理植煙土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中的作用，為萬(wàn)壽菊綜合利用提供了思路。萬(wàn)壽菊-煙草輪作可提高煙株根際土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度，提升土壤響應(yīng)脅迫的修復(fù)能力。在萬(wàn)壽菊-煙草輪作土壤中，酸桿菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度升高，生防菌（Pseudomonas）、功能菌（Candidatus_Solibacter、Bryobacter和Bradyrhizobium）、降解菌（Massilia、Novosphingobium和Ramlibacter）和根際促生菌（Flavisolibacter）等菌屬的比例上升。因此，萬(wàn)壽菊-煙草輪作對(duì)改善土壤微生態(tài)環(huán)境、緩解連作障礙具有積極作用。

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