于旭東，商建偉，鄧 省，王繼升，劉蕊嘉，司紅梅，劉曉訸，張耀圣

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京100700）

夫妻備孕1 年以上，且性生活規(guī)律，由于丈夫的因素而使妻子不能自然受孕，定義為男性不 育 癥（male infertility）［1］。排 除 妻 子 因 素 后，連續(xù)2 次對(duì)男性患者進(jìn)行精液常規(guī)檢查，兩次檢查結(jié)果提示精子密度均小于20×106/mL，前向運(yùn)動(dòng)的a 級(jí)精子以及b 級(jí)精子之和即a 級(jí)+b級(jí)＜50% 或a 級(jí)精子＜25% 即診斷為少弱精癥（oligospermia and asthenospermia）［2］。隨 著 社 會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，中青年一代社會(huì)壓力與日俱增，以及生活方式的改變，罹患男性不育癥的患者也越來(lái)越多。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前在全球不孕不育的罹患率已經(jīng)提升到15%～18%，其中男性原因所占比例高達(dá)50%，而在這之中精子質(zhì)量 低 下 是 主 要 誘 因［3，4］。在 我 國(guó)，已 有 研 究 表明1995～2008 年間精子濃度以1.40%～2.15% 的速度逐年遞減［5］。并且，隨著二胎政策的開(kāi)放，“高齡父親”不斷涌現(xiàn)，對(duì)于男性少弱精癥的治療面臨越來(lái)越大的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)暫無(wú)治療男性生精障礙的特效藥物，現(xiàn)有的手術(shù)及藥物治療，雖然有一定療效，但適應(yīng)面較窄。輔助生殖技術(shù)雖然很大程度上解決了生育困難的問(wèn)題，但是也存在包括活產(chǎn)率不高、花費(fèi)巨大、副作用較多及存在遺傳、倫理風(fēng)險(xiǎn)等諸多弊端。因此，深入研究男性生精功能下降的可能機(jī)制并尋找更為安全有效的干預(yù)手段對(duì)于男性少弱精癥的治療具有重大意義。

張耀圣教授在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)對(duì)于本病的治療，在傳統(tǒng)補(bǔ)腎的基礎(chǔ)上加以健脾的藥物可以明顯提高療效。因此張教授提出了益腎健脾法治療少弱精癥的新思路，并完成了相關(guān)的臨床研究，研究結(jié)果表明本治療方法對(duì)少弱精癥的改善明顯優(yōu)于傳統(tǒng)補(bǔ)腎療法［6］。其中“菟絲子-枸杞子”是益腎組的核心藥物，“黨參-黃芪”是健脾組的核心藥物。由此可見(jiàn)，益腎健脾法的核心藥對(duì)對(duì)于生殖功能有明顯的改善效應(yīng)，但是作為其起效的確切效應(yīng)有待進(jìn)一步明確。因此筆者選取張耀圣教授臨床上應(yīng)用的核心藥對(duì)“菟絲子-枸杞子”和“黨參-黃芪”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，以期能夠初步揭示益腎健脾法治療少弱精癥的分子機(jī)制，為中醫(yī)藥在少弱精癥中的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法通過(guò)構(gòu)建藥物與疾病的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)GO 和KEGG 富集分析實(shí)現(xiàn)預(yù)測(cè)藥物有效成分在疾病效應(yīng)靶點(diǎn)中的可能作用機(jī)制［7，8］。本 研 究 從 中 醫(yī) 臨 床 實(shí) 踐 出 發(fā)，以 中 醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法從探討益腎健脾法治療少弱精癥的可能機(jī)制，本研究旨在為本病的臨床實(shí)踐提供更多的治療方法，同時(shí)為深入的實(shí)驗(yàn)研究提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 益腎健脾中藥的活性成分

應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢 索 益 腎 健脾法核心藥對(duì)“枸杞子-菟絲子”、“黨參-黃芪”的所有活性成分。根據(jù)研究結(jié)果，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、類(lèi)藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18 為 限 制 條 件 進(jìn) 行篩選。

1.2 少弱精癥的疾病靶點(diǎn)

設(shè)置檢索詞為“oligospermia and asthenosper?mia”，應(yīng) 用GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）進(jìn) 行查找。

1.3 藥物與疾病共同靶點(diǎn)篩選及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

首先將益腎健脾法的兩組核心藥對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行取并集操作，然后通過(guò)R 語(yǔ)言運(yùn)行腳本方法繪制藥物與疾病共同靶點(diǎn)的Venn 圖，同時(shí)輸出藥物與疾病的共同靶點(diǎn)文件；然后應(yīng)用STRING（https：//string-db.org/）平臺(tái)構(gòu)建共同靶點(diǎn)PPI，最低相互作用閾值設(shè)為“highest confi?dence”（＞0.9）。并應(yīng)用R 語(yǔ)言走腳本的方法統(tǒng)計(jì)共同靶點(diǎn)的頻次并繪圖。所有R 包下載通過(guò)R 和 Bioconductor（https：//www. bioconductor.org/）。

1.4 藥物-疾病-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)益腎健脾核心藥物和少弱精癥的互作網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO 分析和KEGG 通路富集分析

應(yīng)用R 語(yǔ)言對(duì)益腎健脾核心藥物與少弱精癥的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。

2 結(jié)果

2.1 益腎健脾核心藥物有效成分篩選

本研究通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到藥物的有效成分如下：枸杞子188 個(gè)、菟絲子29 個(gè)、黨參134 個(gè)、黃芪87 個(gè)，共計(jì)512 個(gè)有效成分。以口服生物利用度（OB）≥30% 和類(lèi)藥性（DL）≥0.18 為條件對(duì)益腎健脾核心藥物的有效成分進(jìn)行限制，最后共篩選出97 個(gè)藥物的有效成分。

2.2 男性少弱精癥的疾病靶點(diǎn)篩選

筆者對(duì)“少精癥”與“弱精癥”進(jìn)行分別檢索并選取并集以避免遺漏，去除重復(fù)后得到少弱精癥的最終疾病靶點(diǎn)，其中GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)分別得到少精癥和弱精癥504 和131 個(gè)疾病靶點(diǎn)，共計(jì)得到635 個(gè)靶點(diǎn)。

2.3 益腎健脾核心藥物與少弱精癥互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

首先對(duì)益腎健脾核心藥物與少弱精癥的靶點(diǎn)取交集，結(jié)果為46 個(gè)，得到韋恩圖，見(jiàn)圖1 及表1；同時(shí)構(gòu)建藥物與疾病的共同靶點(diǎn)PPI，見(jiàn)圖2。此外，通過(guò)運(yùn)行腳本的方法匯總出現(xiàn)頻次前30 的靶點(diǎn)并以條形圖的形式體現(xiàn)，見(jiàn)圖3。

2.4 藥物-疾病-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建藥物-疾病-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)模型，包括86 個(gè)節(jié)點(diǎn)（靶點(diǎn)46 個(gè)，有效 成 分35 個(gè)，疾 病1 個(gè) 和 藥 物4 個(gè)）和271 條邊，其中紅色OA 指疾病-少弱精癥（oligosper?mia and asthenospermia），綠 色GQZ、DS、TSZ、HQ 分別代表枸杞子、黨參、菟絲子、黃芪四種藥物，顯示為紫色的是四種藥物的有效成分，顯示為黃色的是少弱精癥的靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

圖1 藥物與疾病靶點(diǎn)韋恩圖Fig 1 Venn diagram of drug and disease targets

表1 藥物與疾病共同靶點(diǎn)Tab 1 Common targets of drugs and diseases

圖2 共同靶點(diǎn)蛋白出現(xiàn)頻次Fig 2 Frequency of common target proteins

圖3 藥物-疾病-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Drug-disease-target interaction network

2.5 益腎健脾核心藥物治療男性少弱精癥核心通路篩選

通過(guò)R 軟件運(yùn)行腳本的方法進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，見(jiàn)圖4，結(jié)果提示主要包括氧化活性、磷酸酶結(jié)合、內(nèi)源性激素調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程。表3 中列出了位次靠前的20 個(gè)信號(hào)通路（排除廣泛通路后）。統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)46 個(gè)共同靶點(diǎn)主要分布于IL6、ESR1、EGFR、AKT等多條信號(hào)通路中。其中，節(jié)點(diǎn)的大小表示富集到的靶點(diǎn)數(shù)目，因此節(jié)點(diǎn)越大則表明改信號(hào)通路上富集的靶點(diǎn)越多；顏色越接近紅色以及紅色的色度越深則表明該條通路的P 值越小，顯著性就越高［9］。

圖4 通路富集（前20 個(gè)）Fig 4 pathway enrichment（top 20）

表2 靶點(diǎn)通路富集結(jié)果（前20 個(gè)）Tab 2 Result of target pathway enrichment（top 20）

3 討論

益腎健脾中藥治療男性少弱精癥主要以補(bǔ)腎藥代表“菟絲子、枸杞子”及健脾藥代表“黨參、黃芪”四味中藥組成。有學(xué)者整理傳統(tǒng)醫(yī)家文獻(xiàn)并分析發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)醫(yī)家在治療本病方面用藥以補(bǔ)虛藥為主，其中高頻次用藥與本次研究的兩組藥對(duì)相符［10-12］。因此，我們認(rèn)為益腎健脾中藥通過(guò)調(diào)控“先、后天”改善精子活力，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)治療少弱精癥的作用。益腎健脾法核心藥物的有效成分對(duì)于生殖功能有明顯的改善效應(yīng)。本研究經(jīng)初步篩選得到益腎健脾法核心藥對(duì)的97 個(gè)活性成分。在藥物-疾病-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)中degree 值高的活性成分在益腎健脾法核心藥對(duì)的作用機(jī)制中起著較為重要的作用。在藥物活性成分中，degree 靠前的是槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黃豆黃素、豆甾醇，degree 值分別為82、22、18、14、10。在基因中，degree 靠前的是NCOA2、PTGS2、PTGS1、AR、CASP3，degree 值分別為30、21、15、8、6。86 個(gè)節(jié)點(diǎn)中有68 個(gè)與3 個(gè)及3 個(gè)以上節(jié)點(diǎn)發(fā)生作用。以上統(tǒng)計(jì)分析提示益腎健脾法核心藥物作用于多個(gè)靶點(diǎn)，也反映了益腎健脾中藥治療少弱精癥多成分、多靶點(diǎn)的效應(yīng)機(jī)制。通過(guò)分析益腎健脾中藥對(duì)作用靶點(diǎn)與少弱精癥的疾病靶點(diǎn)得到兩者的共同靶點(diǎn)數(shù)為46 個(gè)。在應(yīng)用R 語(yǔ)言繪制的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖和頻次圖中，出現(xiàn)頻次較高的有AKT、IL6、ESR1、EGFR 等。ESR1 是是6號(hào)染色體的基因，該基因編碼雌激素受體，一種配體往往是受激活的轉(zhuǎn)錄因子影響，這就提示DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活可能與少弱精癥的發(fā)生有關(guān)［13-15］。此外，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雌激素在調(diào)控男性生精功能方面起著至關(guān)重要的作用［16］。有研究報(bào)道睪丸支持細(xì)胞凋亡時(shí)涉及到多種信號(hào)通路的調(diào)控，包括線粒體途徑、Fas/FasL 途徑和JAK-STAT 通路等［17-19］，且Go 生物功能分析結(jié)果提示益腎健脾中藥治療少弱精癥的潛在靶點(diǎn)參與氧化與抗氧化活性等生物學(xué)過(guò)程可能性大［20］。因此益腎健脾中藥治療少弱精癥可能通過(guò)調(diào)控HIF-1、PI3K/Akt 等信號(hào)通路改善精子活力。此外，KEGG 通路富集分析結(jié)果提示益腎健脾中藥改善男性少弱精癥的作用機(jī)制可能與調(diào)控雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（estrogen signaling pathway）有關(guān)。PPI 共同靶點(diǎn)構(gòu)建已經(jīng)表明ESR1基因出現(xiàn)頻次位列第三。因此，結(jié)合KEGG 富集分析結(jié)果可以推測(cè)益腎健脾中藥改善男性少弱精整的作用機(jī)制可能與調(diào)控人內(nèi)源性激素有關(guān)。

本研究以系統(tǒng)生物學(xué)為基本原則，從中醫(yī)臨床實(shí)踐出發(fā)，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對(duì)益腎健脾中藥治療少弱精癥的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制進(jìn)行探析。 degree 值排名靠前的槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黃豆黃素、豆甾醇可能在益腎健脾中藥的藥理作用中發(fā)揮重要作用。得到46 個(gè)益腎健脾中藥治療男性少弱精癥的可能靶點(diǎn)，可作為少弱精癥核心治療靶點(diǎn)的有AKT、IL6、ESR1、EGFR 等。此外，ESR1 作為雌激素受體基因在調(diào)控男性生精功能方面的作用不可忽視，益腎健脾中藥改善男性少弱精整的作用機(jī)制可能與調(diào)控人內(nèi)源性激素有關(guān)。以上結(jié)論為本病的臨床實(shí)踐提供更多的治療方法，同時(shí)為深入的實(shí)驗(yàn)研究提供前期基礎(chǔ)。然而基于當(dāng)前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的局限性，本次研究結(jié)果尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。