黃偉峰 廖發(fā)杰 陳光星

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院2020級碩士研究生，廣東 廣州 510405)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種炎癥性自身免疫性疾病，以累及周圍關(guān)節(jié)為主，以滑膜炎為基本病理改變[1]。其病變部位以手足小關(guān)節(jié)為主，表現(xiàn)為疼痛、腫脹及功能受限，嚴重者會導(dǎo)致軟骨破壞，造成關(guān)節(jié)畸形，甚至導(dǎo)致殘疾?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要應(yīng)用非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素和改善病情抗風(fēng)濕藥治療RA[2]，但是此類藥物對患者會造成一定的副作用。而中醫(yī)藥治療RA發(fā)揮重要作用，副作用較少，臨床應(yīng)用廣泛。

中醫(yī)學(xué)對RA的認識歷史悠久，早在《內(nèi)經(jīng)》中己有與本病近似的疾病記載，RA屬痹證范疇，《素問·痹論》謂“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹”。后世醫(yī)書中的“尪痹”“歷節(jié)病”“骨痹”及“鶴膝風(fēng)”等與RA癥狀相似[3]。國醫(yī)大師路志正認為，RA主要病因病機為先天稟賦不足，素體正氣虧虛，營衛(wèi)不固，感受風(fēng)寒濕熱諸邪，或攝生不當感受非時之氣，邪襲經(jīng)絡(luò)，留滯關(guān)節(jié)，氣血不暢，痰瘀互結(jié)，深入骨骱而發(fā)病[4]。

桂枝為肉桂干燥嫩枝入藥，味辛、甘，性溫，功效發(fā)汗解肌，溫通經(jīng)脈，助陽化氣，平?jīng)_降逆。附子為烏頭子根入藥，味辛、甘，性大熱，有毒，功效回陽救逆，補火助陽，散寒止痛。白術(shù)為白術(shù)根莖入藥，味甘、苦，性溫，功效健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎[5]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載桂枝有“利關(guān)節(jié)，補中益氣”作用，而白術(shù)則“主風(fēng)寒濕痹死肌，痙疸”，附子有治療“躄拘攣，腳痛，不能行步”的作用?！侗静輩R言》曰“白術(shù)，乃扶植脾胃，散濕除痹，消食除痞之要藥也”。魯賢昌教授認為，痹證之寒勝者可選用桂枝、附子，而濕勝者則可選白術(shù)酌情加減[6]。馬武開教授論治RA要重視脾胃，常用炒白術(shù)化濕邪，生氣血[7]。相關(guān)藥理研究表明，附子治療RA的機制與其抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用有關(guān)[8-9]。

中醫(yī)藥調(diào)治RA在改善癥狀方面有較大優(yōu)勢。許飛等[10]通過回顧性分析 4028 例 RA 住院病例資料，認為RA 患者不同年齡段中醫(yī)證候分布均以風(fēng)寒濕痹為主要證候。金成等[11]回顧分析的438例RA患者中，風(fēng)寒濕痹證最多。王建等[12]通過多中心收集1019例RA患者病例資料，結(jié)論得出濕熱痹阻證占比最高，其次為寒濕痹阻證。根據(jù)對中醫(yī)經(jīng)典理論的探討并結(jié)合臨床經(jīng)驗，認為RA主要病機為風(fēng)寒濕阻，治宜祛風(fēng)散寒除濕，桂枝、附子、白術(shù)分別祛風(fēng)、祛寒、祛濕，三藥相伍，契合祛風(fēng)散寒除濕之法。

隨著中醫(yī)藥治療RA研究日益深入，越來越需要從多成分、多靶點、多途徑的角度解釋中醫(yī)藥發(fā)揮治療作用的機制。因此，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桂枝、附子、白術(shù)治療RA的作用機制，為中藥現(xiàn)代化提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 中藥活性成分和作用蛋白質(zhì)靶點的篩選 分別以“桂枝”“附子”“白術(shù)”為關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)[13]進行檢索，設(shè)置篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.15，收集符合條件的活性成分和其作用的蛋白質(zhì)靶點。OB代表到達全身循環(huán)的未給藥藥物的口服劑量百分比，DL是用于藥物設(shè)計的定性概念，是評價藥代動力學(xué)的重要參數(shù)。

1.2 蛋白質(zhì)靶點名稱的標準化及“中藥-活性成分-靶點”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將1.1中收集到的靶點名稱分別輸入Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)[14]，設(shè)置限定條件為已驗證的人類基因，獲取靶點蛋白基因名的標準表達。將1.1項中中藥、活性化合物成分、蛋白質(zhì)靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，并分析網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)以獲取中藥治療的關(guān)鍵成分。

1.3 RA疾病相關(guān)基因的篩選 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)和DisGeNet數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org)對RA的相關(guān)基因進行檢索，在2個數(shù)據(jù)庫分別輸入關(guān)鍵詞“rheumatoid arthritis”，設(shè)置種屬為“智人”，分別獲取疾病相關(guān)基因靶點。根據(jù)Relevance score值排序，若靶點信息過多，則選取大于中位數(shù)的靶點作為疾病的潛在靶點。因為Relevance score值表示該靶點與疾病聯(lián)系的緊密度，數(shù)值越高聯(lián)系越密切。收集到相關(guān)靶點信息后，合并2個數(shù)據(jù)庫結(jié)果，除去重復(fù)值，獲取最終預(yù)測的疾病靶點信息。

1.4 獲取中藥與疾病的共同靶點 將1.2和1.3中收集到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel工作表中，篩選中藥“桂枝、附子、白術(shù)”和RA的交集靶點，作為此組中藥干預(yù)RA的潛在作用靶點，交集結(jié)果通過韋恩圖展示。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建 為了明確這組藥物靶點與疾病靶點的相互作用，將1.4中篩選出的交集靶點導(dǎo)入STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)[15]構(gòu)建PPI。為確保可信度，選擇基于證據(jù)的網(wǎng)絡(luò)意義，將交互分數(shù)限定為>0.4，除去無相互作用的單一蛋白，利用 Cytoscape 3.7.2軟件將 PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化，展示“桂枝、附子、白術(shù)”作用靶點蛋白與RA靶點蛋白之間的相互作用關(guān)系。

1.6 基因本體(GO)功能和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)平臺[16]分析“桂枝、附子、白術(shù)”治療RA相關(guān)靶點信號通路，把1.4篩選出的共同靶點基因?qū)朐撈脚_進行GO和 KEGG 通路分析。GO富集分析包括分析生物功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)、細胞組成(cellular components，CC)，而KEGG 富集分析可以篩選“桂枝、附子、白術(shù)”治療RA的潛在作用信號通路。

1.7 分子對接驗證 從TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索桂枝、附子、白術(shù)關(guān)鍵成分的結(jié)構(gòu)，并保存為mol 2格式。分析1.5中網(wǎng)絡(luò)圖的度值，把相關(guān)參數(shù)排名前5的靶點作為核心靶點，查找其PDB ID，核心靶點的3D結(jié)構(gòu)從 PDB 數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載，并使用Pymol軟件進行刪除蛋白結(jié)構(gòu)的水分子和小分子配體等預(yù)處理。通過 AutoDock 軟件進行分子對接，先將靶點蛋白和小分子配體進行處理，轉(zhuǎn)換成pdbqt文件，然后用AutoDockTools對接并計算結(jié)合能，最后用Pymol 進行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果

2.1 “桂枝、附子、白術(shù)”中藥活性成分和作用靶點的獲取 通過 TCMSP 檢索桂枝、附子、白術(shù)中符合條件的主要活性成分共20個，其中來自白術(shù)的7個，來自附子的6個，來自桂枝的8個，而谷甾醇為附子與桂枝共有成分，分別給各個活性成分做標記(見表1)。白術(shù)成分作用靶點19個、附子成分作用靶點18個、桂枝成分51個，合并后刪除重復(fù)值共得到靶點70個。

表1 中藥“桂枝、附子、白術(shù)”的主要活性成分

2.2 “中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將桂枝、附子、白術(shù)對應(yīng)的20個活性成分、70個蛋白質(zhì)靶點的相互關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖 1)。對該網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，按連接度(Degree)排序，活性成分中GZ3為最大值38，其后依次為BZ6、GZ6、GZ4、FZ3，故預(yù)測以上5個成分為主要治療成分，并結(jié)合表1獲取成分的名稱，分別是β-谷甾醇(GZ3)、3β-白術(shù)乙酰基(BZ6)、花旗松素(GZ6)、兒茶素(GZ4)、德爾妥因(FZ3)。

圖1 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 RA疾病相關(guān)基因的篩選和中藥活性成分與疾病共同靶點的獲取 以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索獲取疾病靶點2238個，其中Relevancescore最大值為110.06，最小值為1.44，中位數(shù)為3.28，故設(shè)定Score>3.28的靶點為潛在靶點。結(jié)合DisGeNet數(shù)據(jù)庫補充相關(guān)靶點，合并后刪除重復(fù)值，最終得到1870個疾病相關(guān)靶點。通過分析得到中藥活性成分與RA疾病的共同靶點36個(見圖2)，這36個共同靶點作為“桂枝、附子、白術(shù)”治療RA的預(yù)測靶點。

圖2 中藥活性成分靶點與RA疾病靶點交集韋恩圖

2.4 PPI構(gòu)建 將2.3中獲取的36個交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中進行分析，得到“桂枝、附子、白術(shù)”治療RA對應(yīng)靶點的 PPI初步圖(見圖3)，刪去無相互關(guān)系的蛋白后，共涉及34個靶點。將生成的tsv文件導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2軟件，對所獲取PPI進行可視化處理(見圖4)。

圖3 STRING制作的PPI初步圖

圖4 Cytoscape可視化圖

Cytoscape 3.7.2網(wǎng)絡(luò)拓撲分析提示，該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的平均度值7.310，有13個大于平均度值，其中白細胞介素6(IL-6)(連接度為26，介度為 0.1287，緊密度為0.8048)，其次為腫瘤壞死因子(TNF)(連接度為24，介度為0.0867，緊密度為0.7674)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)(連接度為23，介度為0.0664，緊密度為0.7174)、IL-1β(連接度為21，介度為0.0446，緊密度為0.6875)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)(連接度為20，介度為0.0847，緊密度為0.6875)，故設(shè)定IL-6、TNF、VEGFA、IL-1β、PTGS2為中藥“桂枝、附子、白術(shù)”治療RA的核心靶點。

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析 將36個交集靶點基因提交至Metascape數(shù)據(jù)庫進行信號通路分析，其中KEGG 富集顯示182條通路，剔除廣泛通路后共獲得34條信號通路，按-log10(P)值排序后繪制成高級氣泡圖(見圖5)。而GO功能富集分析結(jié)果顯示BP包含了982個GO術(shù)語條目，CC 40個，MF53個，按-log10(P)值排序后取排名前20個GO條目繪制成柱狀圖(見圖6)。

圖5 KEGG通路富集分析

圖6 排名前20的 GO功能富集分析

2.6 分子對接驗證 將2.4中篩選得到的核心靶點與“桂枝、附子、白術(shù)”的5個主要活性成分進行分子對接，其中最低結(jié)合能≤-5 kJ/mol表明藥物活性成分與核心靶點蛋白具有較好的結(jié)合作用。對接結(jié)果說明了“桂枝、附子、白術(shù)”中活性成分與 RA 中核心靶點有著良好的結(jié)合作用。其中TNF與β-谷甾醇結(jié)合力最好，PTGS2與花旗松素、IL-6與3β-白術(shù)乙?；?、IL-1β與花旗松素、TNF與德爾妥因?qū)右灿休^好的結(jié)合活性(見表2、圖7)。

圖7 桂枝、附子、白術(shù)主要活性成分與靶點對接的部分結(jié)果

表2 分子對接結(jié)果 kJ/mol

3 討論

本研究從“桂枝、附子、白術(shù)”中篩選得到20個活性成分和70個活性成分作用靶點。通過分析“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，推測β-谷甾醇、3β-白術(shù)乙?；?、花旗松素、兒茶素和德爾妥因5個成分是“桂枝、附子、白術(shù)”治療RA的主要活性成分。相關(guān)研究表明，β-谷甾醇可調(diào)節(jié)巨噬細胞功能，可能是有希望的RA治療藥物[17]?；ㄆ焖伤乜蓽p少促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β，具有抗炎作用[18]，通過抑制核因子κB(NF-κB)信號通路抑制破骨細胞生成，對破骨細胞生成相關(guān)疾病如骨質(zhì)疏松癥、骨溶解和RA具有治療潛力[19]。3β-白術(shù)乙?；鶎儆诎仔g(shù)內(nèi)酯類成分，有研究顯示白術(shù)揮發(fā)油成分在抗炎、抗腫瘤方面有一定效果，能降低TNF-α、IL-1細胞因子水平[20]。相關(guān)動物實驗表明，兒茶素可能通過抑制滑膜細胞分泌前列腺E2(PGE2)、IL-1和TNF-α等環(huán)節(jié)降低關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜細胞分泌功能[21]。德爾妥因相關(guān)研究較少，但本研究發(fā)現(xiàn)該分子能與較多RA靶點連接。分子對接驗證結(jié)果亦表明，這組中藥的主要成分與RA主要靶點的結(jié)合活性較強。通過PPI分析并構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，篩選到IL-6、TNF、VEGFA、IL-1β、PTGS2等36個核心靶點蛋白，這些蛋白共同參與調(diào)控RA的發(fā)展。IL-6、TNF、IL-1β等都是RA的經(jīng)典靶點，PTGS2是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶，已證實PTGS2在許多病理生理過程中具有重要作用，它的表達也與關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)[22]。這些靶點參與了調(diào)節(jié)治療RA的眾多復(fù)雜通路。

GO功能富集結(jié)果提示，“桂枝、附子、白術(shù)”可能主要是通過促進成骨細胞分化、抑制凋亡、控制炎癥等途徑發(fā)揮對RA的治療作用。對34條KEGG信號通路進行分析，發(fā)現(xiàn)主要發(fā)揮了2類作用。①調(diào)控炎癥因子的水平：TNF信號通路(hsa04668)是富集得到的關(guān)鍵通路，已有研究表明TNF可通過級聯(lián)反應(yīng)增加趨化因子的產(chǎn)生，從而促進炎癥因子的表達和釋放，在RA患者中加重炎性反應(yīng)[23]。通過干預(yù)IL-17細胞信號通路(ko04657)可有效影響IL-17的分泌[24]，在RA患者滑膜中IL-17可與其他細胞因子協(xié)同促進炎性反應(yīng)[25]。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)可激活NLRP3的表達，而NLRP3參與了炎癥小體的組裝和IL-1β的加工[26]。②調(diào)控細胞周期：有研究認為，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路(hsa04151)參與滑膜細胞的增殖與凋亡調(diào)節(jié)，在RA滑膜細胞中處于異常激活狀態(tài)[27]，它的激活促使PI3K和Akt蛋白高表達，降低促凋亡蛋白的表達，抑制軟骨細胞的凋亡，從而減緩軟骨細胞的退變[28]。晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號通路(ko04933)在RA的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，誘導(dǎo)細胞凋亡，促進新生血管生成。由此可見，“桂枝、附子、白術(shù)”對RA的治療作用可能是通過活性成分調(diào)控炎癥因子水平、調(diào)控細胞周期而實現(xiàn)。

綜上所述，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探究了“桂枝、附子、白術(shù)”治療RA的機制，同時采用分子對接方法對核心靶點與關(guān)鍵成分進行對接驗證。該組中藥可能是通過β-谷甾醇、3β-白術(shù)乙?；⒒ㄆ焖伤氐然衔锍煞终{(diào)控IL-6、TNF、VEGFA、IL-1β、PTGS2等疾病靶點，干預(yù)AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等炎癥經(jīng)典通路，從調(diào)控炎癥因子水平和細胞周期方面發(fā)揮對RA的治療作用。這項研究有一些局限性，如在中藥劑量和水溶性等方面尚需進行深入探索，僅挖掘現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫并預(yù)測了“桂枝、附子、白術(shù)”治療RA的藥理作用機制，然而其結(jié)果的可靠性和合理性尚需實驗進一步驗證。