桂倫，陳莎莎，黃振俠，吁安，姚健，陳柳萌*

（1.江西省農業(yè)科學院農業(yè)應用微生物研究所，南昌 330200；2.江西省農業(yè)生態(tài)與資源保護站，南昌 330046）

生豬養(yǎng)殖是我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分，保障了國內肉制品的穩(wěn)定供應，但也產生了大量養(yǎng)殖廢棄物。據2016 年統(tǒng)計數據顯示，我國每年約產生不少于10億t的生豬養(yǎng)殖糞污，需要進行無害化處理和資源化利用。由于生豬糞便中易降解有機物的含量高，具有較高的產氣潛力[1]，因此，長期以來一直是我國沼氣工程發(fā)酵原料的首選。

目前，我國大型沼氣工程多采用以高濃度有機廢棄物聯合消化為特點的CSTR 工藝，發(fā)酵罐內加裝攪拌系統(tǒng)，并配備熱電聯產系統(tǒng)，發(fā)酵原料的進料濃度需達到6%～12%[2]。由于傳統(tǒng)收集方式（如水沖糞、水泡糞等）獲得的糞污的固形物（TS）濃度較低（3%～4%），沼氣工程未能充分利用，產氣率低、經濟效益差。而近年來，隨著豬舍節(jié)水、用水設施改造和糞污收集方式升級，生豬養(yǎng)殖糞污的TS濃度有明顯提高，滿足了沼氣工程對高濃度進料的需求。但相關研究[3-6]發(fā)現，豬糞單獨進行厭氧發(fā)酵雖然可以獲得較佳的產氣效率，但容易形成游離氨的累積，抑制產甲烷菌的活性并降低甲烷產率，尤其是在進料TS 濃度提升時，游離氨對甲烷的抑制效果越發(fā)明顯。丁福貴等[7]采用不同進料TS 濃度（TS=4%～14%）的豬糞開展厭氧發(fā)酵產沼氣試驗，發(fā)現TS濃度在8%時的中溫連續(xù)厭氧產氣效果最佳；在超過8%時，沼氣產量和COD 去除率出現不同程度的下降。勒系意等[8]在水力停留時間（Hydraulic retention time，HRT）為30 d 的條件下，開展了豬糞的進料負荷梯度提升試驗（TS=4.6%～12.1%），研究發(fā)現豬糞的日產甲烷量隨進料濃度提升而增加；但進料TS 濃度超過9.6%后，豬糞的甲烷產率因游離氨的抑制出現明顯下降。此外，也有研究發(fā)現豬糞發(fā)酵會出現酸累積風險，常華等[9]研究不同進料TS 濃度（4%～12%）對豬糞中溫連續(xù)厭氧發(fā)酵的影響，試驗結果表明TS 濃度為6%時，其發(fā)酵系統(tǒng)穩(wěn)定、產氣性能最好；當進料TS濃度超過6%后，發(fā)酵系統(tǒng)因丁酸和乙酸累積出現酸化風險。

為規(guī)避豬糞高濃度進料引發(fā)的發(fā)酵失穩(wěn)、挖掘沼氣工程的運營潛力，研究人員引入高含碳的農作物秸稈與豬糞進行混配，通過篩選原料組合及優(yōu)化配比來實現更高的進料濃度和沼氣產率。陳廣銀等[10]在揮發(fā)性固形物（Volatile solids，VS）負荷5%的批次發(fā)酵試驗中，比較了稻草與豬糞的VS 配比為1∶1、3∶1 和1∶3 的產氣量，發(fā)現VS=3∶1 的處理日產氣量比較穩(wěn)定，累積產氣量達12 080 mL，較稻草與豬糞VS 配比為1∶1 和1∶3 的處理分別高11.8%和16.8%。石利軍等[11]在豬糞與稻草混合發(fā)酵原料C/N=25～30、TS=20%、（36±1）℃的條件下進行干式發(fā)酵，發(fā)酵僅持續(xù)了一周，發(fā)酵過程可能受到了氨氮的抑制。Shen等[12]考察了有機負荷對預處理的稻草與豬糞共發(fā)酵的影響，發(fā)現有機負荷在0.4～2.5 kg COD·m-3·d-1時發(fā)酵過程穩(wěn)定。Darwin 等[13]報道不同TS 濃度（2%～4%）對稻草與豬糞水的產甲烷量的影響，發(fā)現TS=3%的稻草，C/N=10.6∶1 時，具有最高的甲烷產量，達到（141.4±3.70）mL·g-1VS。Li 等[14]在恒定HRT 為19 d 的條件下開展了豬糞混合稻稈（VS 配比為1∶1）的連續(xù)產氣試驗，研究發(fā)現容積產氣率隨進料濃度提升而不斷增加，且沼氣產率相對穩(wěn)定。綜上所述，混合原料發(fā)酵較單一原料可以承受更高的有機負荷，合適的進料濃度和配比可以提高發(fā)酵效率，同時防止抑制的發(fā)生。然而上述研究多為批次發(fā)酵試驗，未系統(tǒng)研究進料濃度對混合發(fā)酵的穩(wěn)定運行機制，尤其是涉及進料濃度提升對豬糞混合稻稈的連續(xù)厭氧發(fā)酵特性研究更為缺乏，對沼氣工程周年穩(wěn)定運行的技術支撐有限。

為此，本研究選擇我國存儲量大、易規(guī)模化收集的稻稈與豬糞進行發(fā)酵原料的組配，通過批次發(fā)酵試驗摸清豬糞與稻稈的原料配比規(guī)律；然后選擇不同配比進行連續(xù)厭氧發(fā)酵試驗，在進料濃度梯度提升（TS=4.6%～12.1%）的條件下，研究發(fā)酵系統(tǒng)的甲烷產率（Specific methane production，SMP）、容積產甲烷率（Volumetric methane production rate，VMPR）以及發(fā)酵過程監(jiān)測指標pH 值、氨氮（Ammonia nitrogen，NH+4-N）濃度、小分子揮發(fā)酸（Volatile fatty acids，VFAs）濃度、碳酸氫鹽堿度（Total inorganic carbonate，TIC）和VFAs/TIC 值的變化趨勢，分析其連續(xù)厭氧產甲烷特性，以期為豬糞混合稻稈厭氧發(fā)酵工藝的工程應用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵原料與接種物

新鮮豬糞取自江西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所豬場，經簡單剔除動物毛發(fā)和大塊石子等雜物后置于4 ℃冰柜保存?zhèn)溆茫坏径捜∽越魇∞r業(yè)科學院水稻研究所試驗田，自然晾干后用粉碎機粉碎，過16 目篩（約1 mm），備用。接種物取自江西省新余市羅坊鎮(zhèn)沼氣站穩(wěn)定運行的沼氣工程發(fā)酵罐中段（發(fā)酵原料為豬糞，HRT 為30 d）。發(fā)酵原料和接種物的基本理化性質見表1。

表1 沼氣發(fā)酵原料及接種物的基本特性Table 1 Basic characteristics of raw materials and inoculum

1.2 試驗裝置

1.2.1 批次厭氧發(fā)酵試驗裝置

本試驗采用全自動產甲烷潛力分析測試系統(tǒng)（AMPTA3），由瑞典Nova Skantek 公司研制。該系統(tǒng)分為A（發(fā)酵單元）、B（酸性氣體吸附單元）、C（甲烷氣體計量單元）3 個單元。其中：A 單元有15 個發(fā)酵瓶，每個發(fā)酵瓶配有可調轉速及攪拌頻率的機械攪拌系統(tǒng)；B 單元有15 個吸收瓶，每個吸收瓶內裝有3 mol·L-1的NaOH溶液，用以吸附沼氣中的酸性氣體（H2S和CO2等）；C 單元為甲烷氣體計量系統(tǒng)，內置模型與算法能結合溫度、壓力傳感器，以弱化水蒸氣和發(fā)酵瓶中高估氣量對實際產甲烷量的影響，最終記錄的甲烷氣體數值為標準狀況（0 ℃，101.3 kPa）下的體積。實驗溫度為（37±1）℃，持續(xù)時間為30～68 d（以當日甲烷量小于總產氣量的1%為止）。

1.2.2 連續(xù)厭氧發(fā)酵裝置

連續(xù)厭氧發(fā)酵裝置采用自行改裝的厭氧發(fā)酵反應器（圖1），該裝置分A（發(fā)酵單元）、B（酸性氣體吸附）和C（甲烷體積測量）3 個單元。其中：A 單元是購自瑞典Nova Skantek 的2 L 裝厭氧發(fā)酵罐，每個發(fā)酵瓶配有可調轉速的機械攪拌系統(tǒng)；B 單元配有3 mol·L-1的NaOH 溶液以吸附沼氣中的酸性氣體（CO2和H2S 等，溴百里酚酞指示劑顯示吸收容量上限）；C 單元采用排水法收集、測量甲烷體積。

為避免厭氧發(fā)酵罐管路堵塞和原料膨脹，發(fā)酵總容積控制在1.8 L。在試驗啟動環(huán)節(jié)，加入接種物7.688 kg（TS=3.9%）和豬糞2.456 kg（TS=6%），純凈水加到1.8 L，使混合發(fā)酵物TS=4.6%。隨即使用橡膠塞密封，并通過橡膠塞頂部的排氣孔向反應器中吹氮氣30～45 s，以排出發(fā)酵罐內部空氣，確保發(fā)酵的厭氧環(huán)境；在37 ℃條件下進行接種物的活化，直至發(fā)酵罐內日產甲烷量低于100 mL·d-1后，進入連續(xù)厭氧發(fā)酵階段；在連續(xù)厭氧發(fā)酵期間，水浴鍋溫度控制在（37±1）℃；發(fā)酵罐每日攪拌6次，每次30 min。

1.3 試驗設計

1.3.1 批次厭氧發(fā)酵試驗

厭氧發(fā)酵接種物在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)5～7 d，以減少接種物自身的產甲烷量?；旌显现胸i糞與稻稈的VS 配比（PM/RS）設7 個處理（表2），依次為0∶1、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、1∶0（下文VS 配比均以PM/RS 計），每個處理設3 個重復[15]；實驗過程中接種物和混合原料的VS 配比為2∶1，接種物和混合原料的總濕質量共400 g，TS 濃度平均值為5.24%，原料的VS質量平均值為4.54 g。

圖1 厭氧發(fā)酵反應器示意圖Figure 1 Sketch map of anaerobic fermentation reactor

表2 沼氣發(fā)酵原料及接種物的添加量Table 2 Feed amount of raw materials and inoculum

1.3.2 連續(xù)厭氧發(fā)酵試驗設計

基于批次厭氧發(fā)酵試驗結果，選擇混合原料的VS 配比為1∶1 和4∶1 分別進行連續(xù)厭氧發(fā)酵試驗。HRT 設為30 d，每日進料總濕質量為60 g，進料TS 濃度分別為4.6%、7.1%、9.6%和12.1%，當混合原料的TS 濃度超過13%時，稻稈吸水溶脹會降低發(fā)酵原料的流動性，使得試驗裝置存在進料、出料困難和攪拌效果差等情況，故本研究中的進料濃度上限設為12%左右；每日上午9：00 記錄甲烷體積；每隔3 d 取樣品檢測pH、TIC、NH+4-N 和VFAs 濃度；不同進料濃度下的發(fā)酵原料的日進料量見表3。

1.4 分析方法

總固形物濃度和揮發(fā)性固體濃度采用質量法測定[16]。C和N含量采用Vario EL Ⅲ元素分析儀進行測定（C 和N 含量以總固形物計）。甲烷產量采用沼氣通過3 mol·L-1的NaOH 溶液后排水法測定體積。發(fā)酵液pH 在取樣后立即采用上海雷磁PHS-3C 型酸度計測定。發(fā)酵液在室溫條件下12 000 r·min-1離心10min，取上清液分別進行VFAs、TIC 和-N 濃度的測定，其中：VFAs 和TIC 采用Nordmann 聯合滴定法[17]測定，-N濃度采用納氏分光光度法[18]測定。

表3 連續(xù)厭氧發(fā)酵試驗中發(fā)酵原料的日進料量（g）Table 3 Daily amount of substrate feed in the continuous bench experiments（g）

1.5 計算方法

1.5.1 混合原料的總C/N

豬糞與稻稈混合后C/N采用公式（1）進行計算：

式中：Ci是單一i原料中碳的質量分數，%；Ni是單一i原料中氮的質量分數，%TS；Xi是混合原料中i原料的質量，g。三者均以TS計。

1.5.2 甲烷產率的計算方法

甲烷產率由公式（2）[15]進行計算：

式中：Mt是每克揮發(fā)性固體混合原料產甲烷的量，即甲烷產率，mL·g-1VS；VTotal(t)是樣品組中混合原料和接種物的總產甲烷量，mL；VIC(t)是空白組（接種物）中的產甲烷量，mL；mIS是樣品組中接種物的揮發(fā)性固體質量，g；mIC為空白組中接種物的揮發(fā)性固體質量，g；mVS,SS為樣品組中原料的揮發(fā)性固體質量，g；t為厭氧發(fā)酵天數，d，取值為0，1，2，…，n。

1.5.3 甲烷產率數據的擬合

采用修正的Gompertz模型（公式3）對由公式2計算獲得的甲烷產率數據進行擬合處理[14，19]：

式中：Mt為發(fā)酵期間某一時間t的甲烷產率，mL·g-1VS；P為反應終止時的累積甲烷產率，即產甲烷潛力，mL·g-1VS；Rm為最大產甲烷速率，mL·g-1VS·d-1；e=2.718 28；λ為延滯時間，d；P、Rm和λ通過指數回歸分析獲得。

tmax為甲烷產率達到最大值的時間，d，由公式（4）計算獲得：

k為反應動力學常數，d-1，代表發(fā)酵原料的轉化速率，由公式（5）計算獲得：

1.5.4 游離揮發(fā)酸（Free violate fat acids，FVFAs）和游離氨（Free ammonia，FAN）濃度的計算方法

FVFAs 和FAN 濃度由公式（6）和公式（7）計算獲得[20]：

式中：[HA ]和[NH3]分別為FVFAs 和FAN 的濃度，mL·g-1VS；CT和CTotal為總VFAs 和總-N 濃度，mg·L-1；[ H+]為氫離子濃度，mg·L-1；KA和KB為VFAs和NH3的解離平衡常數，pKA和pKB在37 ℃時為4.8和8.9。

1.5.5 數據處理

實驗數據的顯著性差異分析采用SPSS 軟件對數據進行處理；甲烷產率數據的擬合采用Origin 軟件中修正的Gompertz模型進行處理。

2 結果與討論

2.1 豬糞與稻稈原料在不同VS 配比下的厭氧產甲烷變化

圖2 豬糞混合稻稈批次厭氧發(fā)酵的日產甲烷量（DMP）及累積產甲烷量（CMP）Figure 2 Daily methane production（DMP）and cumulative methane production（CMP）in the anaerobic batch co-digestion of PM with RS

日產甲烷量（Daily methane production，DMP）和累積甲烷產量（Cumulative methane production，CMP）能夠直觀反映發(fā)酵原料在一個厭氧發(fā)酵周期中產甲烷的動態(tài)變化過程。圖2a 和圖2b 分別為不同VS 比例混合原料的DMP 和CMP，二者在產甲烷過程中變化趨勢基本一致。其中：DMP 在第4～7 d 內出現產甲烷高峰期，隨后迅速回落，并在第13 d 后進入平緩下降階段，直至產氣結束。在第一個產氣高峰時，VS 配比為1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1 處理發(fā)酵原料的產甲烷峰值分別為（200.7±4.1）、（236.5±7.7）、（227.6±7.7）、（208.7±9.5）、（198.3±5.3）、（172.7±4.3）、（144.8±3.6）mL·d-1。表明當VS 配比＞1∶1 后，混合物料的DMP 在第一個產氣高峰時的表現等于或優(yōu)于豬糞原料。這與Li 等[14]在牛糞與稻稈的混合厭氧試驗結果基本一致。在第13 d之后的平緩下降階段中，純稻稈處理（PM/RS=0∶1）出現第二個坡度較為平緩的產氣峰（43.3 mL·d-1）；而純豬糞處理（PM/RS=1∶0）無明顯的第二個產氣峰，表明在厭氧發(fā)酵過程中，稻稈的降解與豬糞相比存在滯后性。當產氣結束后，原料VS配比為1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1 的CMP依次為（397.31±4.23）、（396.33±11.16）、（392.79±9.85）、（389.23±11.26）、（373.00±9.60）、（347.72±8.68）、（300.80±10.03）mL·g-1VS。

動力學常數是化學動力學中一個重要的物理量，它的大小反映了體系反應的快慢。在實際應用中，最終產甲烷潛力可以通過數學模型進行估計，得到產甲烷動力學常數，產氣速率、發(fā)酵遲滯期時長等。本研究先通過公式（2）對試驗數據進行甲烷產率計算，后采用修正的Gompertz 模型及公式3～公式5 對獲得的數據進行擬合處理，其產甲烷潛力（P）、最大產甲烷速率（Rm）、反應動力常數（k）和甲烷產率達到峰值的時間（tmax）等計算結果見表4。

從表4 可知，產甲烷潛力P值在VS 配比1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1 處理分別為389.6、380.3、373.9、372.6、358.2、340.7、295.6 mL·g-1VS。豬糞的P值最高，之后隨豬糞VS 比例降低，P值逐漸降低，純稻稈的P值最小。分析其原因是稻稈中存在不能轉化為甲烷的木質素，混合物料中稻稈VS占比越高，可甲烷化的物質量越少。結合Rm、tmax和k值做進一步分析發(fā)現：VS 配比為4∶1、2∶1 的兩個試驗組的表現均優(yōu)于豬糞，其中VS 配比為4∶1 的數值最高，Rm、k和tmax分別為37.2 mL·g-1VS·d-1、0.098 d-1和4.4 d。表明當原料組配合適時（C/N 20～30∶1），混合發(fā)酵能夠提升發(fā)酵原料的降解速度和轉化效率、縮短達到產甲烷高峰的時間。另外，當VS 配比為1∶1 時，除tmax外，Rm和k值均弱于豬糞原料。綜合上述研究發(fā)現，豬糞與稻稈組合時，提高豬糞的比例有助于加快甲烷轉化速度和轉化效率。

通過批次發(fā)酵試驗，發(fā)現VS 配比4∶1 為最佳配比。但文獻[14，21]報道VS 配比1∶1 為最佳配比，為此，本研究后續(xù)連續(xù)發(fā)酵試驗，選擇VS 配比為4∶1（優(yōu)于豬糞原料）和1∶1（弱于豬糞原料）的兩組不同配比開展連續(xù)厭氧產甲烷特性對比分析。

2.2 進料濃度提升下的混合物料厭氧發(fā)酵產甲烷特性

VMPR 和SMP 是評估發(fā)酵系統(tǒng)產甲烷性能的兩個重要指標。其中，VMPR 用于評價發(fā)酵原料在發(fā)酵系統(tǒng)中的產甲烷能力，SMP則反映發(fā)酵原料的利用效率。圖3a 和圖3b 分別為兩種不同VS 配比（PM/RS=1∶1、4∶1）的混合原料在進料濃度提升過程中的VM?PR和SMP變化情況。

如表5 所示，隨進料濃度提升，2 個VS 配比（1∶1和4∶1）下的SMP 平均值均無顯著變化，整體保持相對穩(wěn)定，SMP 的總平均值分別237.2 mL·g-1VS 和354.8 mL·g-1VS。SMP的變化趨勢與Li等[14]的研究結論一致。另外，與修正Gompertz模型擬合的P值對比分析發(fā)現：VS 配比為4∶1 的SMP 總平均值為P值（380.3 mL·g-1VS）的93.3%，這表明此條件下混合物料的產甲烷潛力轉化率較高，在HRT 為30 d 的條件下得到較為充分的釋放；而VS 配比1∶1 時混合物料的產甲烷潛力轉化率為63.7%，表明仍有一定比例的發(fā)酵原料未被充分利用，推測與其較低的k值（0.072 d-1）有關。此外，與本團隊前期相關研究[8]相比，同樣HRT 為30 d，豬糞、稻稈作為單一原料在進料TS 濃度達到12.1%時，其SMP 分別下降了13.6%和25.1%。而混合原料在此進料濃度條件下，優(yōu)勢顯現出來，其SMP保持相對穩(wěn)定。

VMPR 隨進料濃度提升呈不斷增加趨勢，且與進料濃度呈正相關性（圖4）。依據數據擬合的線性回歸方程，計算獲得VS配比為1∶1時VMPR 在4種進料濃度下分別為0.23、0.36、0.48 L·L-1·d-1和0.61 L·L-1·d-1，VS 配比為4∶1 時VMPR 分別為0.35、0.53、0.71、0.88 L·L-1·d-1。進一步綜合分析國內外同類研究的SMP和VMPR數據（表6）可知，本研究中，豬糞與稻稈混合厭氧發(fā)酵的SMP相對穩(wěn)定，而VMPR隨進料濃度提高而增加，這一變化趨勢與Li等[14]的研究結論基本一致，但VMPR值低于Li等[14]研究結果，主要原因是該研究采用更短的水力停留時間和更高的進料負荷，進料負荷越高，VMPR也相應越高。此外，與豬糞單獨連續(xù)厭氧發(fā)酵相比，混合發(fā)酵的SMP不隨進料濃度增加而下降，而且其VMPR也高于豬糞單獨發(fā)酵，尤其在進料TS 濃度達到12.1%時，VS 配比4∶1 條件下VMPR（0.88 L·L-1·d-1）優(yōu)于其他文獻[7-9，14]所報道的結果。

表4 不同VS配比條件下甲烷產率的擬合Table 4 Fitting model parameters of methane production for anaerobic digestion with various VS ratios

圖3 連續(xù)厭氧穩(wěn)定發(fā)酵的容積產甲烷率（VMPR）及甲烷產率（SMP）Figure 3 Volumetric methane production rate（VMPR）and specific methane production（SMP）for the anaerobic continuous co-digestion

表5 不同進料濃度下的甲烷產率Table 5 Specific methane production at various feedstock concentrations

圖4 連續(xù)厭氧發(fā)酵過程中VMPR與進料濃度（TS）的相關性Figure 4 Relationship between VMPR and TS for the anaerobic continuous co-digestion

表6 不同混合原料在連續(xù)厭氧發(fā)酵中SMP和VMPR的對比分析Table 6 Comparison of SMP and VMPR on the continuous co-digestion of different mixed feedstock

2.3 混合厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定性分析

pH 值、VFAs、NH+4-N 和VFAs/TIC 等發(fā)酵過程監(jiān)測指標與厭氧發(fā)酵的物質代謝和發(fā)酵活動密切相關。

2.3.1 pH

pH 值是衡量厭氧發(fā)酵系統(tǒng)健康性的重要指標之一。Park 等[22]和Wang 等[23]研究表明，產甲烷菌和產酸菌的最適pH 值并不相同。適宜產甲烷菌的pH 值在7.0 左右，而水解酸化細菌的最適pH 則在5.5～6.5之間。單級的全混式厭氧發(fā)酵系統(tǒng)將pH 維持在6.8～8.0 之間[24]以降低酸化抑制，因此當pH 處于6.5～8.0時，發(fā)酵系統(tǒng)被視為正常。本研究中，隨著進料濃度的提升，2 種不同VS 配比的pH 值（圖5a）呈逐步下降趨勢，但均處于最適pH 的穩(wěn)定范圍內，其中進料TS濃度達到12.1%時，2個不同VS配比（PM/RS=1∶1和4∶1）的pH分別降至7.54和7.65。

2.3.2 小分子揮發(fā)酸（VFAs）

VFAs主要是指厭氧發(fā)酵過程中由水解酸化細菌產生的一系列小分子揮發(fā)酸，主要包括乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸和異戊酸等，它們不僅是發(fā)酵原料水解酸化的產物，同時也是甲烷合成的底物。因此，相對穩(wěn)定的VFAs 濃度表明水解酸化細菌和甲烷古菌之間處于動態(tài)平衡狀態(tài)，而且對于穩(wěn)定的厭氧發(fā)酵系統(tǒng)來說[25]，VFAs 濃度始終穩(wěn)定在一個較低水平，則表明水解酸化產生的VFAs能夠迅速被產甲烷菌用于烷合成，VFAs 未過量積累而致使甲烷菌的活性受到抑制。為此，VFAs 濃度是監(jiān)測厭氧發(fā)酵系統(tǒng)正常運行的一個重要指標[26-27]，當VFAs 低于1 000 mg·L-1時，發(fā)酵系統(tǒng)被視為正常；當VFAs＞1 000 mg·L-1時，發(fā)酵系統(tǒng)穩(wěn)定性與發(fā)酵原料的種類與進料濃度有關。由圖5b可知，2種不同VS 配比的VFAs 濃度隨進料濃度增加而提升；在進料TS濃度達到12.1%時，VS配比1∶1、4∶1 的VFAs 濃度的平均值分別達到（388.4±41.0）mg·L-1和（447.5±49.1）mg·L-1，遠遠低于1 000 mg·L-1的穩(wěn)定范圍上限[28]。此外，VFAs/TIC 比值常作為判斷發(fā)酵系統(tǒng)是否受到抑制的重要指標[28]，當VFAs/TIC 比值小于0.3 時，發(fā)酵系統(tǒng)被視為穩(wěn)定；當VFAs/TIC 比值處于0.3～0.8 之間時，發(fā)酵系統(tǒng)被視為不穩(wěn)定；當VFAs/TIC 比值大于0.8 時，發(fā)酵系統(tǒng)處于嚴重失穩(wěn)狀態(tài)。如圖5d 所示，2 種不同VS 比例的VFAs/TIC 比值始終低于0.1，發(fā)酵系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)，均未出現VFAs 累積抑制的情況。

氨是由蛋白質、多肽以及氨基酸等物質降解形成，它不僅為微生物生長繁殖提供氮源，而且是中和VFAs的一個關鍵性pH 值穩(wěn)定分子，然而高濃度的氨也會抑制產甲烷菌的活性。當進料濃度提升時，氨濃度隨混合原料中豬糞用量的增加而增加，必然促使反應NH3+H2O+CO2()aq →+(TIC)向右進行，使得發(fā)酵系統(tǒng)的-N 濃度也不斷增加。在本研究中，2種不同VS配比的-N 濃度（圖6）隨進料濃度提升呈不斷增加的趨勢。在進料TS 濃度達到12.1%時，VS 配比1∶1、4∶1 條件下-N 濃度分別達到（3 666.4±224.1）mL·g-1和（4 245.9±328.2）mL·g-1，低于出現氨抑制的安全閾值（-N 濃度超過5 000 mg·L-1）[29]。而豬糞在進料TS 濃度為9.6%的單獨發(fā)酵時，其-N 濃度已經超過5 000 mg·L-1[8]，這表明稻稈的添加有助于減緩發(fā)酵系統(tǒng)中-N 濃度的增加，而且稻稈占比越高，-N濃度的增幅越小。

圖5 連續(xù)厭氧發(fā)酵過程中pH值、VFAs濃度、NH+4-N濃度和VFAs/TIC值的變化Figure 5 Change of pH，VFAs，N and ratio of VFAs/TIC during the anaerobic continuous co-digestion

圖6 -N與TIC的相關性Figure 6 Relationship between TIC and -N for the anaerobic continuous co-digestion

厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中的pH值是由一個以總堿度進行定量的緩沖體系予以控制[20]。當pH 值在6.0～8.0 之間時，緩沖作用則主要來自TIC 堿度[17]。如圖6所示，2 種不同VS 配比的TIC 與-N 濃度之間呈現一定的正相關性，說明TIC 與-N 堿度同步增加，符合反應式的變化規(guī)律，表明豬糞降解產生的NH3是緩沖體系中最主要的堿度物質來源。

2.3.4 游離揮發(fā)酸（FVFAs）和游離氨（FAN）

FVFAs和FAN 能夠自由穿透細胞膜[30]，被認為是引起厭氧發(fā)酵抑制的主要因素。這類疏水性分子常以被動擴散的形式進入細胞中，引起質子失穩(wěn)和鉀離子流失[5]。其中FVFAs 對水解酸化細菌和產甲烷菌均有抑制作用；但FVFAs 對產甲烷菌（抑制濃度為30～60 mg·L-1）的抑制作用強于水解酸化細菌（抑制濃度為2 400～3 000 mg·L-1）[5，31]。FAN 在中溫厭氧發(fā)酵條件下抑制的是產甲烷菌，特別是嗜乙酸型產甲烷菌（甲烷鬃毛菌），對嗜氫型產甲烷菌和酸化細菌無顯著抑制作用[5]。對FAN 最低抑制濃度的研究，不同學者結論也各有不同，Koster 等[32]和De Baere 等[33]的研究發(fā)現FAN 的最低抑制濃度為80 mg·L-1；Mccarty[34]和Braun 等[35]的研究認為150 mg·L-1為最小抑制濃度；而Liu 等[6]發(fā)現在200 mg·L-1以內，FAN 有助于厭氧發(fā)酵，但超過200 mg·L-1之后，厭氧發(fā)酵受到抑制。此外，Hashimoto[36]研究也發(fā)現，產甲烷菌對FVFAs 和FAN 的抑制具有可逆性和適應性，對于長期馴化下已適應的產甲烷菌，其FVFAs 和FAN 的IC50（具備50%抑制能力的濃度）較對照組分別提高了1.6 倍和1.7倍。

在本研究中，2 種不同VS 配比的VFAs 濃度整體較低，依據公式（6）折算，約1 mg·L-1不會對厭氧發(fā)酵產生不利影響；而豬糞中的富氮類物質降解產生的氨則是形成抑制的潛在風險因子，圖7 所示為采用公式（7）折算出的2 種不同VS 配比的FAN 濃度。與-N濃度不斷增加的趨勢相比，FAN濃度并未出現相應增加趨勢，即使是在進料TS 濃度達到12.1%時，VS 配比1∶1、4∶1 條件下FAN 濃度分別為（152.1±9.6）mg·L-1和（223.2±15.6）mg·L-1，未超過發(fā)酵起始的FAN 濃度（237.8、266.4 mg·L-1）。其原因是在發(fā)酵溫度恒定時，pH值是影響FAN濃度的唯一因素，氫離子濃度增加（pH值下降）從一定程度上抑制-N濃度增加對FAN 濃度的影響。此外，考慮到接種物是取自以豬糞為發(fā)酵原料且穩(wěn)定運行3 年的沼氣工程，厭氧發(fā)酵微生物在長期的發(fā)酵過程中已經適應富氮類的豬糞原料，因此，即使是FAN 濃度略高于相似的研究[6，34-36]，其發(fā)酵系統(tǒng)也未發(fā)生明顯抑制情況[36]。但不能忽略的是，豬糞的占比越高，發(fā)酵系統(tǒng)面臨FAN 的抑制風險越高。

圖7 連續(xù)厭氧發(fā)酵過程中的游離氨濃度變化Figure 7 Change of free ammonia during the anaerobic continuous co-digestion

3 結論

（1）批次厭氧發(fā)酵試驗表明：混合發(fā)酵能夠提高發(fā)酵原料的降解速率和甲烷產率。經修正后的Gom?pertz 模型擬合數據顯示，豬糞與稻稈VS 配比為4∶1時產甲烷特性最好，產甲烷潛力（P值）為380.3 mL·g-1VS；該配比的反應動力常數（k）、最大產甲烷速率（Rm）及甲烷產率達到峰值的時間（tmax）分別為0.098 d-1、37.2 mL·g-1VS·d-1和4.4 d，均優(yōu)于豬糞單獨發(fā)酵（0.083 d-1、32.2 mL·g-1VS·d-1和5.0 d）。

（2）連續(xù)厭氧發(fā)酵試驗表明：混合物料VS配比為4∶1 時產甲烷特性優(yōu)于1∶1 配比，表現為更高的甲烷產率（354.8 mL·g-1VS）和容積產甲烷率（0.88 L·L-1·d-1），單位原料的甲烷轉化效率更好，能夠釋放出93.3%的產甲烷潛力，明顯高于VS 配比1∶1 時的63.7%。在進料TS 濃度達到12.1%時，VS 配比4∶1 條件下，游離氨濃度達到223.2 mg·L-1，發(fā)酵系統(tǒng)面臨游離氨的抑制風險。建議江西省商業(yè)沼氣工程的運行條件為：豬糞與秸稈混合原料VS 配比為4∶1，原料組配的C/N=22～23∶1，進料TS 濃度低于12.1%（有機負荷率為2.87 g VS·L-1·d-1）。