張楚楚 白 穎 李福軍 金燦輝

口腔鱗狀細胞癌是常見的口腔頜面部腫瘤，其惡性程度高、侵襲能力強，患者5 年生存率不超過50%，存活下來的患者也常常因手術致殘而嚴重影響生活質量[1]，同時其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[2]，嚴重威脅著人類的健康安全。因此，找到影響口腔鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的關鍵調控因素就成為提高患者生存率并改善預后的重要途徑。近年許多研究指出，轉錄因子SNAI2(zinc-finger transcription factor-2)與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關[3]，但其在口腔鱗狀細胞癌中的生物學效應尚不明確。本研究擬在口腔鱗狀細胞癌組織中檢測SNAI2 的表達水平，探究SNAI2 對口腔鱗癌細胞增殖侵襲能力的影響，為SNAI2 對口腔鱗狀細胞癌的臨床診斷、預后評估及靶向治療提供研究基礎。

1.材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗使用的臨床樣本組織取自我院口腔外科2015 年7 月至2017 年3 月收治的53 例口腔鱗狀細胞癌患者，其中男29 例，女24例，年齡60～74 歲，平均年齡65.6±5.2，其中發(fā)生于舌根27 例、軟腭22 例、腭扁桃體6 例。手術切除的癌變組織及癌旁組織(距原發(fā)灶邊緣距離大于5cm)均采用液氮保存。

1.1.1 實驗儀器 主要實驗儀器包括：超凈工作臺(Thermo Scientific Heraguard ECO1.8)，生化培養(yǎng)箱(Thermo Scientific 3111)，冷凍離心機(Sigma 2-16KL)，超微量分光光度計(Nanodrop 2000)，熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems 9700)，電泳儀及轉膜儀(Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra)，化學發(fā)光儀(Bio-Rad ChemiDocEQ)，光學顯微鏡(Olympus DSX100)，切片機(德國徠卡RM2235)。

1.1.2 實驗細胞及材料 細胞來源：人口腔鱗癌細胞SCC-090 細胞購自蓋寧生物，產品編號CMH-269，人腎上皮細胞293T 購自蓋寧生物，產品編號CMH-010。主要實驗材料：RPMI1640 及高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、嘌呤霉素puromycin、脂質體Lipofectamine2000(Thermo Scientific Hyclone 公司)，病毒包裝質粒pLP1-gag/pol、REV 和VSV-G(addgene)，轉染促進因子polybrene(sigma 公司)，RNA 提取試劑Trizol、逆轉錄試劑盒及SYBR Green 核酸熒光染料(Takara公司)。蛋白酶抑制劑、蛋白裂解液及BCA 蛋白定量試劑盒(sigma 公司)。MTT 細胞增殖能力檢測試劑盒(Promega)。Matrigel 膠(BD Biosciences)。二甲苯、甲醇、無水乙醇及過氧化氫(H2O2)(國藥集團化學試劑有限公司)，GTVisionTM Ⅲ抗鼠/ 兔通用型免疫組化檢測試劑盒(上海基因科技股份有限公司)等?？贵w包括β-Actin(abcam，ab5694)，SNAI2(abcam，ab51772)，金屬基質蛋白酶-2(matrix-metalloproteinase-2，MMP-2)(abcam，ab37150)，金屬基質蛋白酶-9(matrix-metalloproteinase-9，MMP-9)(abcam，ab38898)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2 恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SCC-090 使用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，293T 使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 RT-PCR 檢測組織及細胞中SNAI2 mRNA 的表達水平 RNA 抽提：①組織RNA 抽提：將組織從液氮中取出，低溫無合酶的條件下研磨器研磨組織，取約30mg 組織加入1ml Trizol，冰上裂解5min，嚴格按說明書進行抽提。②收集6cm 培養(yǎng)皿中的細胞，細胞融合度約80%，0.4ml胰蛋白酶消化細胞后1ml 培養(yǎng)基終止消化，500g離心5min，PBS 沖洗3 次，去上清，加入1ml Trizol，冰上裂解5min，嚴格按說明書進行抽提。Nanodrop2000 超微量分光光度計檢測RNA 濃度，取1μg 行逆轉錄，嚴格按說明書進行反應，得到20μl PCR cDNA 產物后，無核酶水稀釋至500μl。在熒光定量96 孔板中上樣，上樣體系為：10μl SYBR Green 核酸熒光染料，5μl cDNA 及5μl 引物，設置5 個重復孔，反應條件：預變性94℃4min；擴增條件94℃30 s，60℃1min，總共40 個循環(huán)。β-actin 片段大小186bp，SNAI2 片段大小249bp。

表1 熒光定量引物表

1.2.3 IHC 檢測組織中SNAI2 蛋白的表達水平 新鮮組織用固定液處理24h，石蠟切片浸于二甲苯后10min，取出切片稍晾干后置于無水乙醇、90%、85%、80%、75%及70%各級酒精中各5min。0.3%H2O2處理切片10min，用蒸餾水沖洗3 次，切片放入抗原修復液中，放入高壓鍋中加熱至沸騰，蓋上壓力閥至噴汽后持續(xù)4min。修復完成后待切片自然冷卻，蒸餾水沖洗5min。37℃條件下干燥后，滴加3%過氧化氫于組織上，避光孵育15min。蒸餾水沖洗5min。滴加1∶1000 SNAI2的一抗于組織上，總體積100μl。室溫孵育1h，蒸餾水沖洗5min，擦干組織周圍的蒸餾水。滴加100μl 免疫組化試劑盒中的A 液于組織上，室溫孵育30min，蒸餾水沖洗3 次，每次5min，擦干組織周圍的蒸餾水。滴加100μl 顯色劑DAB 溶液于組織上，室溫孵育10min，蒸餾水沖洗終止顯色。依次置于70%、75%、80%、85%、90%及無水乙醇中脫水，各3min，脫水后浸于二甲苯中15min，中性樹膠封片。IHC 染色切片采用光學顯微鏡進行觀察，每張切片選取10 個高倍視野，每個視野觀察100 個腫瘤細胞，計算其中平均陽性的細胞比例。以細胞核或細胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判斷標準，無陽性細胞或陽性細胞＜10%的為陰性(-)，≥10%的為陽性(+)。

1.2.4 慢病毒轉染構建穩(wěn)定干擾SNAI2 細胞系 干擾質粒靶序列為shSNAI2 1# ：TGAGGCGGGACCCTCAGGCC，shSNAI2 2# ：TTCACAGCTGTCCCAGAGGG，陰性對照序列shcontrol：GCTGTTTTTTGAGATTTCAG。載體構建方法見參考文獻[4]，①包裝病毒：在六孔板中接種293T細胞，當細胞密度達到融合度80%左右，每孔加入包裝質粒pLP1-gag/ pol 0.75μg、REV 0.3μg和VSV-G 0.45μg 及1.5μg 目的質粒，與10μL Lipofectamine 2000 轉染試劑充分混合，室溫放置20min，PBS 沖洗2 次293T 細胞，加入1ml 無血清DMEM，20min 后將混合好的質粒逐滴加入孔中，輕輕搖動混勻后37℃，5%CO2培養(yǎng)8h，更換DMEM＋10%FBS 培養(yǎng)，收集24h 及48h 后的病毒懸液，0.45μm 濾器過濾，收集于新的離心管中，-80℃保存。②慢病毒感染：在六孔板中接種SCC-090 細胞，保證細胞融合度40%左右時RPMI1640＋10%FBS 培養(yǎng)基與病毒懸液2∶1 加入相應孔中，總體積3ml，3μL Polybrene，重復感染2d 后，使用puromycin 篩選穩(wěn)定細胞系，篩選濃度2μg/ ml，待細胞生長良好后完成建系。

1.2.5 MTT 檢測細胞增殖活力 將細胞系shcontrol、shSNAI2 1#、shSNAI2 2# 以2000 個每孔接種至96 孔板中，設置5 個重復孔，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待12h 細胞貼壁后，在0h，24h，48h 以及72h 時間點將MTT 溶液與培基以1:9 的比例混合均勻，棄去上清液，每孔加入100μl MTT 混合液，37℃培養(yǎng)箱中孵育1h 后，多孔板酶標儀檢測490nm 處吸光度。

1.2.6 Transwell 侵襲實驗檢測細胞侵襲能力50μg/ ml Matrigel 膠稀釋液包被Transwell 小室底的上室面，4℃下風干。50μl 1%BSA 無血清培養(yǎng)液加入基底膜，生化培養(yǎng)箱中37℃放置30min。shcontrol、shSNAI2 1#、shSNAI2 2# 3 種建系細胞胰酶消化，終止消化后轉移至1.5ml 離心管，去上清后PBS 洗3 次，更換1%BSA 無血清培養(yǎng)液重懸，細胞計數(shù)，取5×105/ 孔的細胞加入Transwell上小室，下室加入500μl 的RPMI1640＋10%FBS培養(yǎng)基，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，注意盡量減少晃動。48h 后甲醇固定10min，結晶紫染色15min，光鏡下細胞計數(shù)，計數(shù)方法為200×光鏡下觀察膜背面侵襲的細胞數(shù)，五點取樣法觀察孔中央及四周各5 個視野，重復取樣3 次，求平均值及標準差。

1.2.7 Western Blot 檢測細胞SNAI2、MMP-2及MMP-9 蛋白的表達水平 ①蛋白收集及準備工作：SCC-090 shcontrol、SCC-090 shSNAI2 1#、SCC-090 shSNAI2 2# 3 種建系細胞在10cm 培養(yǎng)皿中細胞融合度達80%左右時，0.4ml 胰酶消化后1ml RPMI1640＋10%FBS 培養(yǎng)基終止消化，細胞懸液轉移至1.5ml 離心管，800rpm，5min，4℃離心，去上清后PBS 洗3 次，配置1ml 蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑的混合溶液，每種細胞加入300μl，充分混合后冰上裂解2h，期間不斷混勻，16000rpm，15min，4℃離心，收集上清液。使用BCA 試劑盒進行蛋白定量分析，配平體系，上樣量50μg。②Western Blot 實驗：配置10%丙烯酰胺膠，上樣(兩個重復孔)后80V 穩(wěn)壓跑出積層膠，調整電壓至110V 穩(wěn)壓跑至膠底，濕轉至PVDF膜，轉膜穩(wěn)流250mA，10%脫脂奶粉封閉2h，一抗SNAI2、MMP-2 及MMP-9 于4℃孵育12h，濃度分別為SNAI2(1∶1000)、MMP-2(1∶1000)、MMP-9(1 ∶1000)及β-actin(1 ∶2000)，二抗于37℃孵育1.5h，β-actin、MMP-2、MMP-9 及SNAI2 均為鼠二抗(1∶2000)，發(fā)光液曝光顯影，ImageLab 4.1 行灰度掃描，待測蛋白樣品灰度比值為樣品DPI 值(dots per inch 值)與內參基因β-actin 的比值。

1.3 統(tǒng)計方法 本實驗統(tǒng)計分析使用SPSS17.0軟件。計量資料以平均數(shù)±標準差()表示，方差分析比較計量資料間的統(tǒng)計學差異，SNK 法進行多組資料間的兩兩比較，χ2檢驗比較計數(shù)資料間的統(tǒng)計學差異，檢驗水準α 均取0.05。

2.結果

2.1 口腔鱗狀細胞癌臨床樣本組織SNAI2 mRNA 及蛋白的表達水平 RT-PCR 結果示口腔鱗狀細胞癌組織中SNAI2 mRNA 相對表達量為0.171±0.010 顯著高于癌旁組織0.106±0.007，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，見圖1。IHC 結果示患者口腔鱗狀細胞癌組織SNAI2 的陽性率為58.49%(31/ 53)顯著高于癌旁組織SNAI2 的陽性率26.45%(14/ 53)，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.002)，見圖2。

2.2 SCC-090 穩(wěn)定干擾SNAI2 細胞系的構建RT-PCR 結果示SCC-090shSNAI21# 及shSNAI2 2# 細胞系SNAI2 mRNA 的相對表達量顯著低于shcontrol 細胞系(F=40.71，P＜0.0001)，見圖3 及表2。Western Blot 半定量的結果也與一致，進一步證實了干擾SNAI2 細胞系的成功構建，見圖4。

圖1 口腔鱗狀細胞癌組織與癌旁組織SNAI2 mRNA表達的比較

圖2 口腔鱗狀細胞癌組織與癌旁組織SNAI2 免疫組化結果的比較

表2 SCC-090 穩(wěn)定干擾SNAI2 細胞系SNAI2 表達量比較

圖3 SCC-090 shSNAI2 細胞系mRNA 水平的驗證

圖4 SCC-090 shSNAI2 細胞系蛋白水平的驗證

2.3 SCC-090 shSNAI2 細胞系增殖能力的變化 MTT 的結果顯示SCC-090 shSNAI2 細胞系增殖能力在48h 及72h 顯著低于對照組SCC-090 shcontrol 細胞，差異具有統(tǒng)計學意義，見圖5 及表3。

表3 SCC-090 穩(wěn)定干擾SNAI2 細胞系增殖能力的比較

圖5 SCC-090 shSNAI2 細胞系增殖能力的變化

2.4 SCC-090 shSNAI2 細胞系侵襲能力的變化Transwell 侵襲實驗結果顯示SCC-090 shSNAI2 1# 及shSNAI2 2# 在48h 后穿過基底膜的細胞數(shù)顯著低于shcontrol 細胞，差異具有統(tǒng)計學意義，見圖6、7 及表4。

表4 SCC-090 穩(wěn)定干擾SNAI2 細胞系侵襲能力的比較

圖6 SCC-090 shSNAI2 細胞系侵襲能力的變化

圖7 SCC-090shSNAI2 細胞系穿過基底膜細胞數(shù)量的比較

2.5 SCC-090 shSNAI2 細胞系MMP-2 及MMP-9 的變化 Western Blot 結果顯示，shcontrol細胞的MMP-2 及MMP-9 相對灰度值均顯著高于shSNAI2 1# 及shSNAI2 2# 的灰度值，差異存在統(tǒng)計學意義，見圖8、圖9 及表5。

表5 SCC-090 shSNAI2 細胞系MMP-2 及MMP-9 蛋白表達的比較

圖8 SCC-090 shSNAI2 細胞系MMP-2 及MMP-9表達的變化

圖9 SCC-090 shSNAI2 細胞系MMP-2 及MMP-9相對灰度值的比較

3.討論

SNAI2 位于染色體8q11.21 上，是重要的轉錄激活因子，在正常機體內參與早期的神經系統(tǒng)發(fā)育[5]，近年來許多研究指出，SNAI2 在多種惡性腫瘤中表達異常，且一致的認為其表達能夠促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在乳腺癌中，SNAI2 高表達于惡性程度較高的基底細胞樣癌，且其表達與患者TNM分期呈正相關[6]，SNAI2 還可促進乳腺癌細胞上皮間充質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)過程的發(fā)生及癌細胞干性的維持，促進細胞增殖及侵襲能力[7]，并介導細胞化療藥物抵抗的形成[8]。在胃癌中，SNAI2 高表達于胃癌組織，且與患者的預后呈負相關[9]，體外實驗中發(fā)現(xiàn)SNAI2可促進胃癌細胞的增殖侵襲能力[10]。在非小細胞肺癌中，SNAI2 的高表達不利于患者的預后[11]，體外干擾SNAI2 的表達后，A549 肺癌細胞的增殖侵襲能力均降低，并可促進細胞EMT 過程的發(fā)生[12]，同時有研究指出SNAI2 可通過促進EMT 過程進而介導癌細胞放化療抵抗[13]。

本研究我們應用RT-PCR 及IHC 技術在臨床水平發(fā)現(xiàn)，SNAI2 在口腔鱗狀細胞癌組織中高表達，提示SNAI2 可能在口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。我們進一步在體外實驗中探究了SNAI2 與口腔鱗癌細胞SCC-090 增殖侵襲能力的關系，慢病毒穩(wěn)定干擾SNAI2 的表達后，MTT結果顯示SCC-090 細胞的增殖能力顯著下降，提示SNAI2 在口腔鱗癌細胞的增殖過程中起著促進作用，Transwell 侵襲實驗結果顯示SCC-090 細胞的侵襲能力顯著下降，提示SNAI2 可能對口腔鱗癌細胞的局部侵襲、淋巴結及遠處轉移過程中發(fā)揮重要作用。MMP-2 及MMP-9 是與多種惡性腫瘤侵襲轉移能力密切相關的兩種分子，其可降解細胞間質，在癌細胞侵襲轉移能力中發(fā)揮著重要作用[14-16]。本研究在穩(wěn)定干擾SNAI2 的SCC-090細胞中檢測了MMP-2 和MMP-9 的表達，發(fā)現(xiàn)干擾SNAI2 表達后，MMP-2 和MMP-9 表達也顯著降低，由此我們推測SNAI2 可能通過促進其下游靶基因MMP-2 和MMP-9 的表達介導細胞侵襲能力的增強。

我們將在接下來的臨床研究中對患者進行長期隨訪，繪制生存曲線，從流行病學的角度探究SNAI2 與患者預后的關系，并補充體內實驗，進一步證實SNAI2 對口腔鱗癌細胞增殖能力的影響，對SNAI2 與MMP-2 及MMP-9 的相互作用深入研究，進行免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)實驗證實其相互作用，并對相互作用的位點進行分析，為揭示SNAI2 在口腔鱗狀細胞癌中的確切作用提供線索，為SNAI2 的分子靶向治療及患者預后的評估提供新的依據(jù)。