秦豪男，劉星婧，丁其瑞，馬 成，魏易凡，任永信*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210029；2東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210009

實(shí)驗(yàn)動物既是生命科學(xué)研究的對象和模型，又是生命科學(xué)研究的材料和支撐，無論是在基礎(chǔ)理論研究、臨床試驗(yàn)，還是在新藥和生物制品的生產(chǎn)與檢定中都處于不可替代的位置［1］。常用的實(shí)驗(yàn)動物有小鼠、大鼠、兔子、犬等，這其中以小鼠應(yīng)用最為廣泛。小鼠通常性情溫馴，但被抓取時會反抗，實(shí)驗(yàn)者被小鼠抓傷、咬傷情況時有發(fā)生，為保證實(shí)驗(yàn)者安全，常需要固定裝置予以輔助。尾靜脈注射、斷尾采血、肌肉及膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射是小鼠實(shí)驗(yàn)中常用的操作技術(shù)［2-4］，對小鼠進(jìn)行有效的固定是操作成功的前提之一。目前，市場上小鼠固定裝置多用金屬或有機(jī)玻璃制成，個人加工制作不易，購買成本較高，且體積較大，重量較重，攜帶不便。以往文獻(xiàn)報道的自制小鼠固定裝置或制作較為復(fù)雜、易于損壞［5］，或無法滿足同時固定多只小鼠的需求［6-9］。因此，本課題組自制了一種簡易、多用途的小鼠固定裝置并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該固定裝置制作簡單、實(shí)用性強(qiáng)，在操作中對小鼠實(shí)現(xiàn)了較好的固定?，F(xiàn)將制作及使用方法介紹如下。

1 材料和方法

1.1 材料

60 只8 周齡的SPF 級健康雄性C57BL/6J 小鼠，體重21～23 g，購于常州卡斯文實(shí)驗(yàn)動物有限公司［SCXK（蘇）2016?0010］，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［SYXK（蘇）2016?0015］。將60 只小鼠隨機(jī)分為對照組及研究組，每組30 只，對照組采用傳統(tǒng)固定器固定，研究組則采用自制固定裝置固定，先后對小鼠進(jìn)行尾靜脈注射、斷尾采血及膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)獲本校倫理委員會批準(zhǔn)（1903009），并按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

廢棄50 mL 離心管（賽默飛世爾科技公司，美國），4 mL離心管（無錫耐思），15 mL離心管（康寧公司，美國），28 孔多用試管架（深圳南實(shí)地科技有限公司），手術(shù)刀柄及刀片、酒精燈、1 mL 一次性無菌注射器（江蘇蘇云），10 μL微量注射器（上海高鴿），0.9%氯化鈉注射液（批號19092842，天津中國大冢制藥有限公司），濃度1%的甲苯胺藍(lán)染液（廣州勞斯生物科技有限公司），外科顯微鏡、康尼D7100 單反相機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 固定裝置的制作

①取洗凈的廢棄50 mL 離心管，在其底端和管蓋正中分別開一直徑約5 mm 的小孔，打磨平滑；底端小孔以作小鼠呼吸之用，管蓋小孔以作小鼠尾部操作中鼠尾通道之用（圖1A）。50 mL離心管質(zhì)地較硬，切割前可先用酒精燈行局部加熱以降低硬度便于切割。②根據(jù)小鼠體重大小，在管壁合適刻度間切割出兩個關(guān)于離心管中心軸線相對稱的直徑約為14 mm的圓孔（或正六邊形），以能恰好通過4 mL離心管為準(zhǔn)（圖1B）。本研究采用的是在20～25 mL刻度線之間切割，可同時滿足下肢和尾部相關(guān)操作的固定要求。③配合4 mL離心管、15 mL離心管、28孔多用試管架（倒置），實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求組裝成“一拖二”、“一拖五”等多種組合的小鼠固定裝置（圖1C～F）。

1.2.2 固定裝置的使用方法

1.2.2.1 小鼠尾靜脈注射給藥、斷尾采血

圖1 小鼠固定裝置實(shí)物及其實(shí)際應(yīng)用Figure 1 The fixation device and its practical application

將固定裝置管蓋旋開平置于實(shí)驗(yàn)臺上，從籠盒中取出小鼠，按標(biāo)準(zhǔn)方式左手抓取，然后右手持固定裝置（圖2A），左手持小鼠身體送入固定裝置并用右手順勢封住管口并捏住鼠尾（圖2B～C），左手再持離心管蓋，將鼠尾由通道中穿出，并旋緊管蓋（圖2D～E）。隨后將固定裝置安裝至倒置的試管架上（圖2F），即可進(jìn)行小鼠尾靜脈注射給藥或斷尾采血等操作。部分實(shí)驗(yàn)如葡萄糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn)（glucose?stimulated insulin secretion，GSIS）［10］、葡萄糖耐受試驗(yàn)（glucose tolerance test，GTT）和胰島素耐受試驗(yàn)（insulin resistance test，ITT）［11］等，需要短時間內(nèi)對較多小鼠按時間點(diǎn)行多次斷尾采血，則可采用“一拖五”自制小鼠固定裝置（圖1D、F），采樣前提前固定小鼠，屆時只需依次采血即可。

1.2.2.2 小鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射

以膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射為例：右手封住離心管雙側(cè)圓孔，左手持已麻醉好的小鼠送入離心管并推至底端（注意將小鼠鼻腔對準(zhǔn)管底小孔），旋緊管蓋（圖3A～C）；持鑷子輕輕將小鼠下肢從側(cè)壁圓孔中牽出，用拇指和食指固定，并充分屈曲膝關(guān)節(jié)，定位膝關(guān)節(jié)腔位置，即可進(jìn)行膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射（圖3D～F）。如需雙側(cè)注射，則將已注射下肢回納，同樣方法注射另一下肢。此外，對于單人徒手行小鼠肌肉注射有困難的實(shí)驗(yàn)人員，可借助本固定裝置輔助固定，方法同上，但由于肌肉注射無需麻醉，右手封住雙側(cè)圓孔處應(yīng)墊硬紙板以保護(hù)手指防止咬傷抓傷。

圖2 小鼠固定裝置使用流程Figure 2 Instruction for use of the fixation device

圖3 膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射固定方法Figure 3 Procedure of intra?articular injection

1.2.3 觀察指標(biāo)

1.2.3.1 操作時間

從將小鼠取出鼠籠開始計時，至注射或采血完成將小鼠放回籠內(nèi)為止，計時每只小鼠操作時間（尾靜脈注射組：注射生理鹽水0.3 mL/只；斷尾采血組：采血量為0.3 mL/只；膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射組：注射甲苯胺藍(lán)染液10 μL/關(guān)節(jié)腔，計時注射雙側(cè)膝關(guān)節(jié)總時間，預(yù)先麻醉過程及注射后按壓時間不計入操作時間內(nèi)）。

1.2.3.2 成功率

尾靜脈注射及斷尾采血組：以一次性完整完成上述操作為成功標(biāo)準(zhǔn)；膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射組：以關(guān)節(jié)囊內(nèi)軟骨組織明顯藍(lán)染、且甲苯胺藍(lán)染液無溢出及異位染色為成功標(biāo)準(zhǔn)，成功率以關(guān)節(jié)計數(shù)。成功率=成功注射或采血小鼠數(shù)量/該組實(shí)驗(yàn)小鼠總數(shù)量×100%。

1.2.3.3 膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射的穩(wěn)定性及可重復(fù)性

采用甲苯胺藍(lán)染液進(jìn)行膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，對比傳統(tǒng)單純手法固定與該自制固定裝置固定，染料在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的分布情況，驗(yàn)證自制固定裝置關(guān)節(jié)腔內(nèi)微量注射的穩(wěn)定性與可重復(fù)性［12］。麻醉小鼠后備皮消毒，采用相應(yīng)固定方法予以固定，用拇指和食指固定并充分屈曲膝關(guān)節(jié)，定位膝關(guān)節(jié)腔位置，應(yīng)用微量注射器以髕韌帶內(nèi)緣中點(diǎn)為進(jìn)針點(diǎn)，順關(guān)節(jié)間隙方向約1.5 mm 深度注射甲苯胺藍(lán)染液入關(guān)節(jié)腔，拔針后稍用力加壓針眼處2 min。取膝關(guān)節(jié)正中縱向皮膚切口，長約2 cm，暴露關(guān)節(jié)囊觀察染液充盈情況。處死小鼠后，切開關(guān)節(jié)囊，切斷前后交叉韌帶，充分暴露關(guān)節(jié)面，觀察軟骨組織染色情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自制小鼠固定裝置相關(guān)參數(shù)

本自制小鼠固定裝置主要取材于50 mL 離心管，其質(zhì)量為12 g，長約11.6 cm，直徑約3.4 cm；全套“一拖五”小鼠固定裝置（圖1D）總質(zhì)量為164 g，大小為20.5 cm×10.0 cm×9.4 cm；制作采用廢棄離心管，成本為0；全套制作時間約15 min。

2.2 操作時間、成功率、實(shí)驗(yàn)人員受傷及小鼠意外死亡情況

在整個實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠平靜、無激惹，未發(fā)生小鼠意外傷殘、窒息死亡等情況；實(shí)驗(yàn)人員沒有發(fā)生被咬傷抓傷等情況。具體各組尾靜脈注射、斷尾采血及膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射操作時間及成功率見表1。

2.3 甲苯胺藍(lán)染液膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射

小鼠正常膝關(guān)節(jié)囊及膝關(guān)節(jié)解剖如圖4A～B所示，關(guān)節(jié)囊薄而柔潤，關(guān)節(jié)腔內(nèi)分泌有透明蛋清樣滑液。成功注射甲苯胺藍(lán)染液可見關(guān)節(jié)囊內(nèi)充盈藍(lán)染，切開關(guān)節(jié)囊后軟骨組織明顯藍(lán)染（圖4C、D）。相對于傳統(tǒng)單純手法固定組，自制固定裝置固定組的關(guān)節(jié)囊內(nèi)軟骨組織藍(lán)染更加充分，甲苯胺藍(lán)染液溢出、異位染色等情況發(fā)生率更低，膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射成功率更高（表1）。

表1 對照組與研究組完成注射或采血的操作時間及成功率Table 1 Operation time and success rate of injection or blood collection in control and study groups

3 討論

良好的固定是進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，也是眾多科研工作的前提。在大多無需麻醉的實(shí)驗(yàn)中，小鼠活動性較強(qiáng)，會對操作產(chǎn)生一定的干擾，常需要固定裝置予以輔助固定。但市售的傳統(tǒng)固定裝置存在以下幾個缺點(diǎn)：①購買價格較高，增加實(shí)驗(yàn)成本；②多為金屬或有機(jī)玻璃制成，制作過程復(fù)雜，個人制作不易；③市售“一拖五”固定器架體積重量較大，占據(jù)空間，攜帶不便?；谝陨系囊恍┰颍簧賹?shí)驗(yàn)者在實(shí)驗(yàn)過程中摸索出了一些實(shí)用的固定方法，但依舊存在著制作過程較為復(fù)雜、裝置易于損壞，或無法滿足同時固定多只小鼠的需求等不足。為此，有必要設(shè)計一種制作簡單、固定牢靠、方便易攜、用途多樣，且可同時固定多只小鼠的固定裝置。在實(shí)踐過程中，利用實(shí)驗(yàn)室中廢棄的離心管，配合閑置的試管架，進(jìn)行了如上設(shè)計。為了檢驗(yàn)自制小鼠固定裝置的安全性和實(shí)用性，本課題組進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

圖4 小鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Figure 4 Intra?articular injection of mouse knee

在小鼠尾靜脈注射及斷尾采血實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)對照組和研究組的注射及采血成功率均達(dá)到100%，相對于對照組，研究組的注射及采血操作時間相對較少。對于小鼠尾靜脈注射，李軼倞等［13］采用籠蓋壓制法在一定程度上解決了小鼠的固定問題，但由于小鼠在鼠籠里活動范圍廣，實(shí)驗(yàn)過程中小鼠容易因外界環(huán)境以及人為操作發(fā)生激惹而影響操作，實(shí)驗(yàn)人員需要較高的熟練度才能順利快速完成注射；同時，籠蓋壓制法固定效果有限，小鼠尾部受壓較嚴(yán)重，且小鼠身體相較尾部體位更低，無法應(yīng)用于小鼠斷尾采血實(shí)驗(yàn)。而本固定裝置對小鼠固定牢靠，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要隨意調(diào)整固定器位置，滿足了小鼠尾靜脈注射及斷尾采血操作的固定要求，尤其在采血小鼠數(shù)量較多、采血時間點(diǎn)有要求的情況下，配合實(shí)驗(yàn)助手及備用固定器（圖1B），采用“一拖五”組合（圖1D），可以更好地提高實(shí)驗(yàn)效率，保障實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

相對于小鼠尾靜脈注射，小鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射精確度要求更高、難度更大，通常需要預(yù)先麻醉小鼠。傳統(tǒng)固定器因體積較大、筒壁較厚，導(dǎo)致手持不便、小鼠下肢暴露不充分，不適合作為小鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射的固定器；而傳統(tǒng)單純手法固定無法實(shí)現(xiàn)小鼠的充分固定，小鼠常因麻醉效果欠佳及疼痛刺激而產(chǎn)生抵抗活動，不僅會影響操作的流暢性、增加注射失敗率，還存在實(shí)驗(yàn)人員被抓傷咬傷的風(fēng)險。目前市面上及以往文獻(xiàn)報道中，還未出現(xiàn)針對于小鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射的固定器。為了研究該自制固定裝置關(guān)節(jié)腔內(nèi)微量注射的穩(wěn)定性與可重復(fù)性，分別采用傳統(tǒng)單純手法固定與自制固定裝置固定的方法，進(jìn)行小鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射甲苯胺藍(lán)染液實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對于傳統(tǒng)單純手法固定，自制固定裝置組固定牢靠、小鼠膝關(guān)節(jié)暴露充分，操作時間更少，一人即可順利完成小鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射；同時，自制固定裝置組關(guān)節(jié)囊內(nèi)軟骨組織藍(lán)染更加充分，甲苯胺藍(lán)染液溢出、異位染色等情況發(fā)生率低，相對于傳統(tǒng)單純手法固定成功率更高。此外，對于徒手進(jìn)行肌肉注射有難度的實(shí)驗(yàn)人員，也可以利用本固定裝置，順利完成肌肉注射。

在全部實(shí)驗(yàn)中，小鼠平靜、無激惹，未發(fā)生小鼠意外傷殘、窒息死亡等情況；同時，實(shí)驗(yàn)人員也沒有發(fā)生被咬傷抓傷等情況，證明了該自制固定裝置對于小鼠及實(shí)驗(yàn)人員都具有較高的安全性。整體而言，該自制固定裝置與傳統(tǒng)固定器及其他自制固定器對比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①取材于廢棄的50 mL離心管，材料易得，環(huán)保，且制作簡單、不易損壞、方便清洗消毒；②結(jié)構(gòu)小巧，攜帶方便，可隨時組裝拆卸，按“一拖五”模式組裝可同時固定多只小鼠，提高工作效率；③一物多用，在滿足傳統(tǒng)固定器的小鼠尾靜脈注射、斷尾采血的固定要求基礎(chǔ)上，進(jìn)一步滿足了小鼠肌肉及膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射的固定要求；④裝置透明且無毒無害，利于隨時觀察小鼠狀態(tài)，保障小鼠安全；⑤操作方便，固定牢靠，很好地保證了實(shí)驗(yàn)人員的安全。需要指出的是自制小鼠固定器的使用也與實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)熟練程度有關(guān)，隨著熟練程度的增加，操作時間會隨之減少。由于本課題組實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員均能熟練地應(yīng)用這種固定方法，因此在用時上較短。新的操作人員可能需要一定時間的練習(xí)才可在較短時間內(nèi)完成一系列注射操作。此外，實(shí)驗(yàn)人員可以根據(jù)自己的操作習(xí)慣尋找適宜自己的固定步驟，如利用小鼠的鉆孔習(xí)性，操作者可右手提起待操作小鼠尾巴，使其頭部對準(zhǔn)離心管開口處，順勢將小鼠裝進(jìn)離心管內(nèi)而代替抓取步驟等。這里將最常使用的傳統(tǒng)固定器與本實(shí)驗(yàn)自制小鼠固定器固定法從安全性、觀察性、消毒性、適用范圍、費(fèi)用、便攜性、大批量操作方面進(jìn)行了比較，供實(shí)驗(yàn)人員參考。

綜上所述，該自制小鼠固定裝置及使用方法切實(shí)可行，具有實(shí)際應(yīng)用價值，不僅可以代替市售的傳統(tǒng)固定器滿足小鼠尾靜脈注射、斷尾采血等操作固定要求，同時也為小鼠肌肉及膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射提供了一種安全、有效的固定方法。