徐萬里，周 帥，周靜珠，趙瑞瑞，孫魯寧，王永慶，薛明新，陳 歡*，張朝暉*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸科，江蘇 南京 210029；2南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210029；3南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210029

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是臨床最常見的功能性腸病，以腹痛、內(nèi)臟高敏感、腸動力異常以及排便習(xí)慣改變等一系列癥狀為主要表現(xiàn)［1］。近來研究認(rèn)為IBS發(fā)病以“腦?腸交互異常”為基礎(chǔ)，嬰幼時期經(jīng)歷的負(fù)性事件尤其是心理應(yīng)激會極大地改變下丘腦?垂體?腎上腺軸（hypothalamo?pituitary?adrenal axis，HPA 軸）對應(yīng)激的負(fù)反饋調(diào)節(jié)功能，從而導(dǎo)致腸道免疫、動力以及疼痛感覺異常，產(chǎn)生相應(yīng)癥狀［2］。

由前體肽核組蛋白2（nucleobindin?2，NUCB2）衍生而來的nesfatin?1 表達(dá)異常升高是應(yīng)激導(dǎo)致的機(jī)體重要變化之一。Nesfain?1 促進(jìn)下丘腦釋放HPA軸關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子促皮質(zhì)素釋放因子（corticotro?pin releasing factor，CRF），并通過其受體1，2（corti?cotropin releasing factor receptor1/2，CRF1/2R）信號通路介導(dǎo)IBS 的內(nèi)臟高敏反應(yīng)［3］，HPA 軸激活最終誘使胃腸道5?羥色胺（5?hydroxytryptamine，5?HT）系統(tǒng)應(yīng)答，5?HT 在胃腸道中含量占機(jī)體總量的95%，是胃腸重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一。5?HT4 型受體（5?HT4R）在腸道各級神經(jīng)元和腸細(xì)胞廣泛分布，具有促腸動力和保護(hù)腸黏膜的作用［4］，其表達(dá)異常直接導(dǎo)致腸動力、感覺調(diào)節(jié)障礙。

耳針作為針灸重要分支，具有顯著的調(diào)節(jié)中樞/外周神經(jīng)系統(tǒng)的作用，并可通過神經(jīng)?內(nèi)分泌途徑改善相應(yīng)組織器官功能［5-6］，本文通過建立母嬰分離結(jié)合醋酸灌腸誘導(dǎo)內(nèi)臟高敏感大鼠模型，觀察低頻耳電針后大鼠內(nèi)臟痛閾的改變，下丘腦CRF、CRF1R、CRF2R、nesfatin?1 及結(jié)腸5?HT4R 的mRNA 表達(dá)，初步探究耳針降低內(nèi)臟高敏感的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

8只SD孕大鼠由南京大學(xué)模式動物中心提供，單籠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)SPF 級實驗動物中心，室溫22～24 ℃，濕度50%，光照周期12 h/12 h，自由進(jìn)食。新生雄性乳大鼠隨機(jī)分為空白組（10 只）與模型準(zhǔn)備組（30只）。評價造模成功后，采用SAS 軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字法將模型準(zhǔn)備組大鼠分為3 組，每組10只。模型組：模型大鼠不予干預(yù)；耳針1組：模型大鼠取雙耳“胃”穴（雙側(cè)耳甲區(qū)中央）針刺+電刺激［7］；耳針2 組：模型大鼠取雙耳“非穴區(qū)”（耳垂區(qū)中央）針刺+電刺激。所有實驗操作遵循《動物實驗的倫理準(zhǔn)則與指南》并在獲得南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審批（IACUC?1905023）后開始實驗。

PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）、RNAiso Plus TRIzol（9108，TaKaRa 公司，日本）；實時熒光定量PCR 儀（Stepone plus，Applied Biosystems 公司，美國），分光光度計（Nano drop 2000，Thermo Fisher 公司，美國）。多道生理采集系統(tǒng)（BL420，成都泰盟），麻醉機(jī)（ABS?100，上海玉研儀器），電針儀（CMNS6?2 型，無錫佳健醫(yī)療），顯微鏡（H550S，尼康，日本）。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)臟高敏感大鼠模型造模

采用“母嬰分離結(jié)合醋酸灌腸”的造模方法［8］。新生雄性乳大鼠出生后2～21 d 行母嬰分離，每天3 h；并于出生后第8～21 天，給予0.5%醋酸灌腸，建立慢性結(jié)腸高敏感模型，空白組給予相同體積生理鹽水。飼養(yǎng)至6 周，通過結(jié)直腸擴(kuò)張（colorectal dis?tension，CRD）刺激，記錄腹外斜肌肌電活動（electro?myographic，EMG），驗證內(nèi)臟高敏感模型是否建立。

1.2.2 耳針電刺激

第9 周開始，每日上午8～12 點進(jìn)行實驗操作。耳針1組、耳針2組大鼠2.0%～2.5%異氟烷吸入30 s后，采用固定裝置固定大鼠，分別取相應(yīng)部位針刺并連接電針儀（CMNS6?2型，無錫佳健醫(yī)療），雙極電針，大鼠恢復(fù)至清醒狀態(tài)后予以電針刺激，兩組電針參數(shù)與干預(yù)時間相同：頻率2 Hz，強(qiáng)度（3.0±0.5）mA，連續(xù)波，持續(xù)30 min，每天1次，治療5次/周，共治療2周。

1.2.3 腹外斜肌肌電測定

實驗前1 周大鼠雙側(cè)腹外斜肌處埋植電極，導(dǎo)線留置于大鼠背部。測試前禁食24 h，固定大鼠。電極導(dǎo)線經(jīng)切口引出連接BL?420 生物機(jī)能實驗系統(tǒng)。導(dǎo)尿管經(jīng)液體石蠟潤滑后插入大鼠直腸約4 cm。待大鼠安靜后開始記錄，測試參數(shù)：標(biāo)準(zhǔn)電壓2 mV/cm，時間常數(shù)2 s，高頻濾波30 Hz。向?qū)蚬芮蚰页錃猓謩e予20、40、60、80 mmHg 壓力觀察EMG 變化。通過BL?420 配套計算機(jī)軟件截取20、40、60、80 mmHg 壓力4 個時段中1 min 內(nèi)波形EMG，配套軟件計算該時間段曲線下面積（area un?der curve，AUC，單位：μV·s），并計算與靜息狀態(tài)1 min內(nèi)AUC的差值。

1.2.4 遠(yuǎn)端結(jié)腸組織HE染色

3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（4 mg/100 g）后處死，迅速開顱、開腹，冰上快速取下丘腦、結(jié)腸組織，固定于4%多聚甲醛24 h 以上，依次梯度乙醇進(jìn)行脫水。將浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋。修塊，切片，脫蠟至水、染色、沖洗伊紅染色、乙醇脫水封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.2.5 實時熒光定量PCR（Real?time PCR）

同上操作，快速取下丘腦、結(jié)腸組織，置于液氮和-80 ℃冰箱備用。TRIzol 試劑盒提取下丘腦內(nèi)總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列如表1。反應(yīng)體系：反應(yīng)液10 μL，5×Primescript Buffer 4 μL，5×Primescript RT Enzyme Mix 1 μL，RT Primer Mix 4 μL，DEPC 水1 μL。反應(yīng)條件：95.0 ℃10 min；95.0 ℃5 s，60.0 ℃1 min，40個周期；95.0 ℃15 s 熔解曲線。根據(jù)real?time PCR原始檢測結(jié)果，按照2-△△Ct相對定量計算公式，計算目的基因相對定量結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性的兩組計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，多組計量資料比較采用單因素方差分析。組間兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 表示有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)臟高敏感模型大鼠建立

腹外斜肌EMG 顯示，結(jié)直腸內(nèi)置球囊壓力為20 mmHg時，與空白組相比，模型組AUC差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在40、60、80 mmHg壓力時，模型組AUC較空白組明顯升高（P均＜0.05，圖1），提示IBS內(nèi)臟高敏感模型造模成功。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences of qPCR

空白組與模型組大鼠結(jié)腸HE 染色后鏡下觀察，結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，未見炎細(xì)胞浸潤，腸黏膜未見增厚，固有層未見分離，腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見脫落（圖2）。

2.2 低頻耳針電刺激對內(nèi)臟高敏感的作用

結(jié)直腸球囊壓力為20 mmHg時，與模型組AUC比較，耳針1 組AUC 顯著減少（P＜0.05）；耳針2 組AUC有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

在40 mmHg 及60 mmHg 壓力時，與模型組比較，耳針1 組、耳針2 組AUC 均明顯減少（均P＜0.05）。在壓力為80 mmHg時，耳針1組AUC較模型組顯著下降（P＜0.05），耳針2 組有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異（圖3）。腹外斜肌EMG 結(jié)果提示，耳針1 組與耳針2 組均有緩解模型大鼠內(nèi)臟高敏感性的效應(yīng)，且耳針1組效應(yīng)更加顯著。

圖1 不同結(jié)直腸壓力下腹外斜肌肌電AUCFigure 1 AUC of external oblique under different colorec?tal pressure

圖2 結(jié)腸HE染色Figure 2 HE staining of colon tissue

2.3 低頻耳針電刺激后下丘腦基因表達(dá)變化

下丘腦組織CRF mRNA 的表達(dá)比較，模型組比空白組顯著增加（P＜0.05），耳針1 組與耳針2 組較模型組顯著減少（P＜0.05）。nesfatin?1 mRNA 的表達(dá)在模型組及耳針2 組較空白組明顯上升（P＜0.05），耳針1 組較模型組、耳針2 組顯著下降（P＜0.05）。CRF1R mRNA 的表達(dá)在模型組較空白組明顯上升（P＜0.05），耳針1組較模型組顯著下降（P＜0.05）。CRF2R mRNA 與nesfatin?1mRNA 的表達(dá)相似，模型組及耳針2 組較空白組明顯上升（P＜0.05），耳針1 組較模型組、耳針2 組顯著下降（P＜0.05，圖4）。提示耳針對下丘腦CRF、CRF1R，CRF2R、nesfatin?1的表達(dá)具有調(diào)控作用。

圖3 干預(yù)后不同結(jié)直腸壓力下腹外斜肌肌電AUC比較Figure 3 Comparison of AUC of external oblique under different colorectal pressure after intervention

2.4 低頻耳針電刺激后大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸5?HT4R 的mRNA表達(dá)

圖4 下丘腦CRF、nesfatin?1、CRF1R、CRF2R的mRNA相對表達(dá)Figure 4 Relative mRNA expression of hypothalamic CRF，nesfatin?1，CRF1R，and CRF2R

與空白組比較，模型組5?HT4R的mRNA表達(dá)下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.067）；與模型組相比，耳針2組及耳針1組5?HT4R的mRNA表達(dá)均顯著升高（圖5）。提示耳針1組、耳針2組干預(yù)均會上調(diào)5?HT4R mRNA的表達(dá)，其中耳針1組的效果更強(qiáng)。

3 討論

耳穴治療功能性胃腸病具有悠久的歷史［9?10］，早期學(xué)者提出的“耳?迷走反射”理論闡釋了耳穴可通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)對五臟六腑的作用機(jī)制，亦為《靈樞·口問》所記載的“耳者，宗脈之所聚也”這一理論提供科學(xué)依據(jù)［11］。近來，較多學(xué)者關(guān)注耳穴與腦（心理）相關(guān)疾病的研究，從腦功能改變、HPA軸、分子等不同層次闡述了耳穴通過“耳?腦”途徑的調(diào)節(jié)機(jī)制［12-13］。

本研究采用母嬰分離結(jié)合醋酸灌腸的方法［8］建立內(nèi)臟高敏感大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低頻電針耳穴“胃”穴可顯著降低內(nèi)臟高敏感大鼠直腸在不同球囊壓力刺激下的腹外斜肌EMG改變，提示低頻電針耳穴可緩解內(nèi)臟高敏感模型大鼠的腹部癥狀。此外，內(nèi)臟高敏感大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織未出現(xiàn)顯著的炎性改變，表明該模型主要以功能改變?yōu)橹鳌?/p>

圖5 遠(yuǎn)端結(jié)腸5?HT4R mRNA相對表達(dá)量Figure 5 Relative mRNA expression of 5?HT4R in colon tissue

CRF 是下丘腦在應(yīng)激狀態(tài)下釋放的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子，通過激活其G 蛋白偶聯(lián)受體CRF1R、CRF2R 對靶細(xì)胞發(fā)揮作用。外源性腦室注射CRF及應(yīng)激引起的CRF 升高均能誘發(fā)腸動力異常和內(nèi)臟高敏感，使大鼠產(chǎn)生腹痛、腹瀉、焦慮/抑郁等類IBS 癥狀［14］。Nesfatin?1 在下丘腦中與CRF 共表達(dá)，與壓力刺激密切相關(guān)。提高側(cè)腦室nesfatin?1 濃度可顯著增加下丘腦CRF 神經(jīng)元c?Fos 的表達(dá)以及CRF 神經(jīng)元胞漿Ca2+濃度，提高神經(jīng)元活性［15］。此外，IBS 大鼠側(cè)腦室注射nesfatin?1 抗體可顯著減輕內(nèi)臟高敏感［3］。本研究觀察到內(nèi)臟高敏感模型大鼠下丘腦中CRF、CRF1R、CRF2R 及nesfatin?1 的mRNA 表達(dá)均異常升高，提示下丘腦nesfatin?1 與CRF 系統(tǒng)對IBS 大鼠的內(nèi)臟超敏存在關(guān)聯(lián)，與早前的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)低頻電針耳穴“胃”可降低模型大鼠下丘腦CRF、CRF1R、CRF2R及nes?fatin?1 mRNA 的高表達(dá)狀態(tài)，這可能是耳穴刺激能抑制腸道高敏感的中樞機(jī)制之一。然而，CRF 系統(tǒng)與nesfatin?1 在IBS 中的相互作用，以及耳穴刺激對兩者的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

5?HT是胃腸道中的重要動力分子和神經(jīng)遞質(zhì)，其受下丘腦CRF的調(diào)節(jié)而合成釋放，與特異性受體結(jié)合發(fā)揮作用［14，16］，廣泛表達(dá)于突觸前腸神經(jīng)元上的5?HT4R，主要參與腸道運動與感覺的調(diào)節(jié)，對腸神經(jīng)元具有保護(hù)作用［17］。研究發(fā)現(xiàn)，5?HT4R可激活腸黏膜5?HT的釋放、促使杯狀細(xì)胞分泌黏液和腸上皮細(xì)胞分泌氯離子，對抗內(nèi)臟痛［17?18］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，5?HT4R 的部分激動劑替加色羅可以顯著改善內(nèi)臟高敏感患者的直腸壓力敏感度和內(nèi)臟高敏感［19］。因此，5?HT4R成為臨床上治療IBS內(nèi)臟痛的靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組遠(yuǎn)端結(jié)腸5?HT4R 的mRNA 表達(dá)較空白組有下降趨勢（P=0.067），耳針1組與耳針2組均能夠顯著提高模型大鼠結(jié)腸5?HT4R的mRNA 表達(dá)，且耳針1 組較耳針2 組有更強(qiáng)的趨勢。提示耳穴“胃”電刺激具有更好的修復(fù)與改善內(nèi)臟高敏感的效應(yīng)［20］。

此外，發(fā)現(xiàn)耳針1 組在緩解腹痛以及對下丘腦相關(guān)神經(jīng)肽調(diào)控，均明顯強(qiáng)于耳針2 組，表明耳穴“胃”具有顯著的特異性。這可能與不同穴區(qū)所處部位的迷走神經(jīng)分布差異有關(guān)，迷走神經(jīng)?下丘腦支配心臟、胃腸等內(nèi)臟器官的運動與感覺，研究顯示刺激迷走神經(jīng)可激活丘腦室旁核、下丘腦室旁核谷氨酸能神經(jīng)元［21］，電針或可通過該途徑鎮(zhèn)痛［22］，推測這或許也是本研究中耳穴“胃”電刺激鎮(zhèn)痛的機(jī)制之一。此外，發(fā)現(xiàn)耳穴電針調(diào)節(jié)胃腸功能障礙還存在其他神經(jīng)?體液機(jī)制，如本項研究中觀察到電針耳穴“胃”提高腸道5?HT4R mRNA表達(dá)，以及本課題組前期研究結(jié)果顯示電針耳穴“胃”可促進(jìn)糖尿病大鼠胃Cajal細(xì)胞的修復(fù)［23］，均提示耳針對胃腸功能的調(diào)節(jié)并非單一途徑。

中醫(yī)認(rèn)為IBS雖然病位在腸腑，但與心、腦、肝、脾密切相關(guān)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也表明IBS 很大程度上受社會心理因素影響，可見心神失調(diào)是IBS 發(fā)病的關(guān)鍵因素。耳針具有顯著寧心安神功效，臨床上運用于治療失眠、抑郁常獲顯著療效［24］。本研究結(jié)果也證實了耳針調(diào)節(jié)腦功能作為其修復(fù)內(nèi)臟高敏感的重要途徑。

總之，本研究同時從下丘腦與外周遠(yuǎn)端結(jié)腸兩個層面觀察低頻耳電針緩解內(nèi)臟高敏感性的效應(yīng)，初步探討了耳針治療IBS 腸腦共病的生物學(xué)機(jī)制，為今后耳穴治療相關(guān)疾病提供新依據(jù)。