張何堅，柏 蓉，鮑麗琴，張學(xué)會，孫魯寧，馬夢圓，程紫萍，陳安九*，王永慶*

1徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點實驗室，江蘇 徐州 221004；2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210029；3江蘇盛澤醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 蘇州 215228

質(zhì)子泵抑制劑（如蘭索拉唑）是一種強效胃酸抑制劑，前藥形式的質(zhì)子泵抑制劑因其良好的脂溶性可以經(jīng)簡單擴散自由通過細(xì)胞膜，進入胃壁細(xì)胞后在酸性環(huán)境中發(fā)生質(zhì)子化，轉(zhuǎn)變?yōu)榇位酋０奉惢钚孕问?，不可逆地抑制H+/K+?ATPase 的功能，阻止H+進入胃腔。因而對各種原因引起的胃酸分泌增加都有良好的抑制作用，是臨床治療消化性潰瘍、胃食管反流病等酸相關(guān)性疾病的一線藥物［1］。然而，隨著此類藥物臨床應(yīng)用越發(fā)廣泛，其潛在的不良反應(yīng)也逐漸顯現(xiàn)。有研究指出，長期使用質(zhì)子泵抑制劑可能增加骨質(zhì)疏松等疾病的發(fā)生風(fēng)險［2］，還可能增加住院患者的病死率［3］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者逐漸關(guān)注質(zhì)子泵抑制劑潛在的心血管風(fēng)險。有研究指出，質(zhì)子泵抑制劑會通過抑制CYP2C19酶的活性而影響氯吡格雷的活化，從而增加此類用藥人群的心血管風(fēng)險［4］。然而，也有研究報道，質(zhì)子泵抑制劑的心血管風(fēng)險可能與藥物相互作用無關(guān)，因為在沒有使用氯吡格雷的正常人群中，長時間使用質(zhì)子泵抑制劑也會增加心血管事件的發(fā)生風(fēng)險［5］。Yepuri 等［6］研究結(jié)果表明，長期使用質(zhì)子泵抑制劑會通過抑制溶酶體酸化而加速內(nèi)皮細(xì)胞衰老，而Ghebremariam 等［7］的研究證實，質(zhì)子泵抑制劑可以顯著增加內(nèi)皮和血清中不對稱二甲基精氨酸的含量，從而減弱一氧化氮合酶的血管保護作用。這些結(jié)果表明，質(zhì)子泵抑制劑可能直接作用于血管內(nèi)皮而影響其正常功能。有研究報道，質(zhì)子泵抑制劑會增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度［8］，而胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)長期失衡可能活化鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）并進一步誘導(dǎo)活化T 細(xì)胞核因子（nuclear fac?tor of activated T cell，NFAT）向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，引起組織功能障礙。另有研究報道，CaN 活化與血管內(nèi)皮中白介素6（interleukin 6，IL?6）、細(xì)胞間黏附分子?1（intercellular adhesion molecule?1，ICAM?1）和血管細(xì)胞黏附分子?1（vascular cell adhesion molecule?1，VCAM?1）表達增加密切相關(guān)，這也是一部分血管毒性物質(zhì)發(fā)揮作用的重要途徑［9］。因此，本研究以內(nèi)皮細(xì)胞中CaN為基礎(chǔ)，探究質(zhì)子泵抑制劑增加心血管風(fēng)險的可能機制，為臨床安全用藥提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endo?thelial cell，HUVEC）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

蘭索拉唑標(biāo)準(zhǔn)品購于中國食品藥品檢定研究院（純度：99.6%）；DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國），胎牛血清（Biological Industries 公司，以色列）；Trypsin?EDTA 消化液（Gibco 公司，美國）；FK506（APExBIO 公司，美國）；DMSO（Sigma 公司，美國）；GAPDH 抗體、IL?6 抗體、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記驢抗兔IgG、抗熒光淬滅封片劑（武漢塞維爾生物科技有限公司）；NFAT抗體、CaN抗體、ICAM?1抗體、VCAM?1抗體、Lamin B1抗體（Abcam 公司，英國）；PMSF、RIPA裂解液、核蛋白漿蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PVDF 膜（Mer?ck 公司，美國）；化學(xué)發(fā)光液（Millipore 公司，美國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本），內(nèi)參引物GAP?DH，其余引物由生工生物工程有限公司合成，引物序列信息見表1。

CO2培養(yǎng)箱HF100（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；渦旋震蕩儀（Eppendorf 公司，德國）；離心機（Eppendorf 公司，德國）；倒置熒光顯微鏡IX73（Olympus 公司，日本），熒光顯微鏡LSM 5（德國Zeiss 公司）；電泳儀PowerPacTMBASIC（Bio?Rad 公司，美國）；酶標(biāo)儀（Bio Tek公司，美國）；實時熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems 公司，美國）；超聲破碎儀（Sonics 公司，美國）；化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)Tanon 5200 Multi（上海天能科技有限公司）；MilliQ超純水機（Millipore公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HUVEC細(xì)胞貼壁生長，正常培養(yǎng)階段使用含有1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，隔天換液。細(xì)胞給藥階段用含有0.1%DMSO、1%雙抗和10%胎牛血清的培養(yǎng)基或相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每天換液。細(xì)胞于37 ℃、含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至80%匯合時進行傳代，傳代比例為1∶2，取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

第一階段實驗以蘭索拉唑10 μmol/L 分別處理細(xì)胞0、24、48、72 和96 h，各處理組細(xì)胞間DMSO含量、總培養(yǎng)時間保持一致。第二階段實驗分為Veh 組、LPZ 組、FK506 組、LPZ+FK506 組共4 組。Veh 組為對照組；LPZ 組中含有10 μmol/L 蘭索拉唑；FK506 組中含有1 μmol/L FK506；LPZ+FK506組中含有1 μmol/L的FK506和10 μmol/L的蘭索拉唑，各組間DMSO含量保持一致，共同培養(yǎng)96 h。

1.2.2 qRT?PCR法檢測各組細(xì)胞中IL?6、ICAM?1和VCAM?1 mRNA表達

用濃度為10 μmol/L 的蘭索拉唑孵育細(xì)胞0、24、48、72、96 h后，用TRIzol試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，調(diào)齊濃度后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以每孔5 μL SYBR Green、0.2 μL 正向引物、0.2 μL 反向引物、3.6 μL 無酶水和1 μL 經(jīng)稀釋的cDNA 配成10 μL 反應(yīng)體系。每個樣本設(shè)置3 個復(fù)孔，上樣結(jié)束后經(jīng)4 ℃2 000 r/min離心5 min以除盡氣泡。上機進行IL?6、ICAM?1 和VCAM?1 等基因的擴增，以GAPDH 為內(nèi)參分析經(jīng)不同時間藥物作用后相關(guān)基因mRNA 表達水平的變化。

1.2.3 Western blot法檢測蛋白表達

細(xì)胞經(jīng)不同藥物處理后，用RIPA 裂解液和核漿蛋白提取試劑盒（使用前2 min 內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）分別提取細(xì)胞總蛋白、核蛋白和漿蛋白。提取的蛋白用細(xì)胞破碎儀超聲3～5 次，每次5 s，隨后離心取上清。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)齊濃度后加入5×蛋白上樣緩沖液煮沸10 min，變性后的蛋白樣本立即使用或保存于-80 ℃冰箱。使用SDS?PAGE按照每孔35 μg的上樣量進行電泳，待蛋白分離后停止電泳。用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫條件下用5%脫脂奶粉溶液封閉90 min，經(jīng)TBST 漂洗后放入相應(yīng)的一抗中，4 ℃孵育過夜。次日用TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min。室溫條件下在搖床上孵育二抗約1 h，結(jié)束后仍用TBST 緩沖液漂洗3次，最后使用Tanon顯色系統(tǒng)進行顯影。以GAPDH 為內(nèi)參，用Image J 軟件對Western blot 條帶進行半定量分析，各給藥組目的蛋白的表達用對照組進行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.4 免疫熒光

細(xì)胞經(jīng)不同藥物處理后，在室溫條件下固定15 min，結(jié)束后用Triton 破膜15 min，棄去Triton，用山羊血清室溫封閉1 h，結(jié)束封閉后加入一抗過夜，次日加入熒光二抗室溫孵育1 h，PBS 漂洗3 次后用DAPI 染液對細(xì)胞核進行染色，3 min 后用PBS 洗凈殘余DAPI 染液，以488 nm 為激發(fā)波長在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）的形式表示，所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，多組間的比較使用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。每項實驗均獨立重復(fù)3 次，使用Graph?Pad Prism 5軟件進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 蘭索拉唑能時間依賴性激活CaN，并促進NFAT向核內(nèi)轉(zhuǎn)移

為了研究蘭索拉唑長期作用對HUVEC 中CaN表達的影響，分別用蘭索拉唑處理細(xì)胞24、48、72、96 h后，應(yīng)用Western blot技術(shù)進行檢測。結(jié)果如圖1A 所示，蘭索拉唑可以時間依賴性地上調(diào)細(xì)胞中CaN 蛋白的表達。此外，本研究進一步探索了細(xì)胞中NFAT 的表達情況。結(jié)果如圖1B、C所示，蘭索拉唑能減少細(xì)胞漿中NFAT的表達，并能時間依賴性上調(diào)細(xì)胞核中NFAT蛋白的表達，免疫熒光結(jié)果（圖1D）與Western blot結(jié)果一致，共同說明蘭索拉唑長期反復(fù)刺激會誘導(dǎo)細(xì)胞漿中的NFAT向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。

2.2 蘭索拉唑誘導(dǎo)血管炎癥，增加HUVEC 黏附分子表達

為了研究蘭索拉唑?qū)UVEC 黏附分子和炎癥因子表達的影響，分別用蘭索拉唑處理細(xì)胞24、48、72、96 h 后，用Western blot 和qRT?PCR 技術(shù)進行檢測。結(jié)果顯示，蘭索拉唑可以增加HUVEC 中IL?6蛋白的表達，且在96 h時最為明顯（圖2A、B）。蘭索拉唑還可以時間依賴性增加ICAM?1 蛋白的表達（圖2A、C），而對于VCAM?1，雖然未呈現(xiàn)時間依賴性，給藥48、72、96 h 后蛋白表達也出現(xiàn)顯著上調(diào)（圖2A、D）。此外qRT?PCR 結(jié)果顯示，蘭索拉唑能時間依賴性增加ICAM?1 mRNA 的表達（圖3B），而對于IL?6 及VCAM?1 mRNA 的表達水平，雖然未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，但隨著給藥時間的增加也出現(xiàn)了上調(diào)趨勢（圖3A、C）。這些結(jié)果共同說明長時間的蘭索拉唑刺激可能誘發(fā)血管內(nèi)皮炎癥，并增加內(nèi)皮細(xì)胞黏附。

2.3 CaN抑制劑能緩解蘭索拉唑誘導(dǎo)的血管損傷

圖1 各組HUVEC中CaN和NFAT的表達量Figure 1 Expression of CaN and NFAT of HUVECs in each group

為了進一步驗證CaN 活化在蘭索拉唑誘導(dǎo)的血管炎癥中發(fā)揮的作用。本研究使用CaN 抑制劑FK506（1 μmol/L）單獨或聯(lián)合蘭索拉唑共同孵育細(xì)胞96 h，并使用Western blot檢測蛋白表達水平的變化。結(jié)果如圖4A 所示，F(xiàn)K506 對蘭索拉唑誘導(dǎo)的CaN表達升高有顯著的抑制作用。圖4B～D顯示，與Veh 組相比，LPZ 組NFAT 的核轉(zhuǎn)位顯著增加，而FK506 組NFAT 的核轉(zhuǎn)位情況無顯著變化，LPZ+FK506 組NFAT 的核轉(zhuǎn)位情況雖然也有升高，但是與LPZ 組相比升高幅度顯著降低。此外，與Veh 組相比，LPZ組IL?6、ICAM?1和VCAM?1的蛋白表達量顯著增加，而FK506組與LPZ+FK506組IL?6、ICAM?1和VCAM?1的蛋白表達量無顯著變化（圖5），說明蘭索拉唑誘導(dǎo)的血管炎癥及黏附增加與CaN 的激活密切相關(guān)。

3 討論

圖2 Western blot 檢測各組IL?6、ICAM?1、VCNM?1蛋白表達Figure 2 Expression of IL?6，ICAM?1 and VCAM?1 proteins in each group detected by Western blot

圖3 qRT?PCR檢測各組IL?6、ICAM?1、VCAM?1 mRNA Figure 3 mRNA of IL?6，ICAM?1，VCAM?1 in each group detected by qRT?PCR

質(zhì)子泵抑制劑廣泛用于治療酸相關(guān)性疾病，臨床使用量逐年增加，但在發(fā)揮強效抑酸作用的同時，其潛在的不良反應(yīng)也逐漸引起人們的重視［10］。在心血管領(lǐng)域，質(zhì)子泵抑制的潛在作用一直存在爭議。Lin 等［11］指出，蘭索拉唑可以通過抑制Akt/GSK3β/β?catenin 信號通路的激活而緩解高血壓誘導(dǎo)的心臟重構(gòu)。而Sehested 等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，長期使用質(zhì)子泵抑制劑會使缺血性腦卒中的風(fēng)險增加13%，使急性心肌梗死的風(fēng)險增加31%。Sun等［5］一項包含17 項RCT 的meta 分析表明，質(zhì)子泵抑制劑可能增加患者心血管事件的發(fā)生風(fēng)險，且在長期用藥人群中風(fēng)險會進一步增加。

心血管疾病是威脅人類生活的嚴(yán)重疾病之一，因心血管疾病死亡的人數(shù)占每年全球疾病死亡總?cè)藬?shù)的30%以上。而血管內(nèi)皮炎癥引起的內(nèi)皮功能障礙是各種心血管疾?。▌用}粥樣斑塊形成、心肌梗死等）發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟［13］。正常情況下，炎癥因子IL?6 和黏附分子ICAM?1 及VCAM?1 在血管組織中表達量較低，而發(fā)生內(nèi)皮炎癥時，表達量會顯著升高［14］。Yu 等［9］的研究結(jié)果表明，在TNF?α誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥中，CaN的激活發(fā)揮了關(guān)鍵作用，抑制CaN 可以顯著減弱TNF?α誘導(dǎo)的NFAT 核轉(zhuǎn)位，并降低IL?6、ICAM?1 和VCAM?1 的表達量。CaN 是一種鈣調(diào)蛋白/鈣離子依賴性的蛋白磷酸酶，在血管內(nèi)皮中表達較為豐富。CaN對胞內(nèi)鈣離子變化有較高的敏感性，胞內(nèi)鈣離子升高會顯著增加CaN 的表達并進一步誘導(dǎo)NFAT 向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移［11］。Schil?linger等［8］的研究結(jié)果表明，質(zhì)子泵抑制劑急性給藥會減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣容量，并能顯著增加心肌細(xì)胞中舒張期游離鈣離子濃度，而長期使用質(zhì)子泵抑制劑對血管內(nèi)皮細(xì)胞中CaN的影響，尚未見報道。

圖4 FK506對蘭索拉唑誘導(dǎo)的HUVEC中CaN和NFAT表達的影響Figure 4 The effects of FK506 on expression of CaN and NFAT induced by lansoprazole in HUVECs

在本研究中，用蘭索拉唑孵育HUVEC 不同時間后發(fā)現(xiàn)，蘭索拉唑能時間依賴性地增加CaN 的表達，并顯著增加NFAT的核轉(zhuǎn)位。此外，蘭索拉唑還能顯著增加HUVEC 中IL?6、ICAM?1 及VCAM?1 的表達，提示蘭索拉唑長時間作用能激活CaN 并進一步誘發(fā)血管內(nèi)皮炎癥。為了進一步驗證蘭索拉唑誘導(dǎo)的血管炎癥與CaN 激活的相關(guān)性，本研究將CaN抑制劑FK506單獨或聯(lián)合蘭索拉唑共同作用于細(xì)胞96 h。結(jié)果顯示，1 μmol/L 的FK506 單獨作用于HUVEC 96 h后對NFAT的核轉(zhuǎn)位沒用影響，也不會增加IL?6、ICAM?1 和VCAM?1 蛋白的表達，但是它能顯著減弱由蘭索拉唑誘導(dǎo)的NFAT 核轉(zhuǎn)位，并能很大程度上抑制由蘭索拉唑誘導(dǎo)的IL?6、ICAM?1和VCAM?1 表達增加，這些結(jié)果進一步證實了蘭索拉唑誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮炎癥和細(xì)胞黏附增加與CaN的活化有較大相關(guān)性。

圖5 FK506對蘭索拉唑誘導(dǎo)的HUVEC 中IL?6、ICAM?1、VCAM?1表達的影響Figure 5 The effects of FK506 on the expression of IL?6，ICAM?1 and VCAM?1 induced by lansoprazole in HUVECs

雖然質(zhì)子泵抑制劑在發(fā)揮抑酸作用時需要先被活化，但考慮到體循環(huán)及血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的pH不足以使質(zhì)子泵抑制劑發(fā)生質(zhì)子化，因此本研究采用蘭索拉唑的原型藥物進行實驗符合藥物在體內(nèi)的實際情況。以往在研究蘭索拉唑心血管效應(yīng)時較少關(guān)注該藥物對心肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞的長期影響［8，11］，而心血管不良事件往往發(fā)生在長期使用質(zhì)子泵抑制劑的患者中［12］。本研究通過比較不同時間的蘭索拉唑?qū)UVEC 的作用，探討質(zhì)子泵抑制劑產(chǎn)生心血管效應(yīng)的潛在規(guī)律，為臨床質(zhì)子泵抑制劑的安全使用提供參考。

綜上所述，臨床相關(guān)濃度的蘭索拉唑可能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮炎癥，并增加內(nèi)皮細(xì)胞黏附，且這一作用與內(nèi)皮細(xì)胞中CaN 的活化密切相關(guān)。本研究表明CaN可作為預(yù)防質(zhì)子泵抑制劑相關(guān)心血管不良反應(yīng)的潛在靶點，值得進行更加全面和深入的研究，這對于促進質(zhì)子泵抑制劑在臨床的安全合理使用具有重要意義。