王美皓，劉文凱 綜述，喬自林，王家敏 審校

1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030

從詹納在擠奶女工手上接種牛痘患者的膿液開始，直至20 世紀(jì)初，疫苗的來源主要為受感染的人或動物的組織，以及被感染的血清等，如從兔子、綿羊或山羊中提取的神經(jīng)組織，哺乳動物的腦等（小鼠、大鼠或兔子）。20 世紀(jì)30 年代以后，生產(chǎn)和制造人用、獸用疫苗主要使用雞胚培育病毒的方法，這種工藝存在許多限制，如生產(chǎn)周期長、操作繁瑣、工作量大、易污染等。隨著病毒對雞胚的逐漸適應(yīng)，病毒抗原性發(fā)生了改變，一些疫苗種子無法在雞胚上增殖，因此，從安全性菌株的選擇到疫苗產(chǎn)品供應(yīng)之間需要較長的時間。事實(shí)上，在大流行暴發(fā)的情況下，更具體地說，在禽流感暴發(fā)時，雞胚供應(yīng)量會嚴(yán)重不足。據(jù)中國動物疫病預(yù)防控制中心報(bào)告，2020 年初，湖南省發(fā)生一起家禽H5N1 亞型高致病性禽流感疫情，養(yǎng)殖戶存欄肉雞7 850 只，發(fā)病死亡就已達(dá)到4 500 只?？梢?，傳統(tǒng)疫苗工藝不能快速響應(yīng)疫情并及時有效地提供大量的疫苗劑量。

隨著時間的推移，疫苗生產(chǎn)工藝已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，更安全和更具免疫原性的新型疫苗生產(chǎn)工藝的開發(fā)，使疫苗生產(chǎn)商獲得了更高的產(chǎn)率。以細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)病毒性疫苗，對提高產(chǎn)品安全性以及應(yīng)對日益增長的疫苗需求量和降低相關(guān)生產(chǎn)成本具有重要意義。

本文將重點(diǎn)介紹用于生產(chǎn)人用病毒性疫苗的細(xì)胞基質(zhì)的安全性評估，為新型病毒性疫苗的上市提供細(xì)胞基質(zhì)安全性評估的相關(guān)參考。

1 細(xì)胞基質(zhì)在疫苗開發(fā)中的應(yīng)用

為克服雞胚的限制，在疫苗生產(chǎn)的上游工藝中引入了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，比起傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝，細(xì)胞基質(zhì)的疫苗生產(chǎn)工藝具有更高的靈活性。細(xì)胞基質(zhì)疫苗生產(chǎn)工藝的首次嘗試是在1954 年，SALK 等［1-2］使用原代猴腎細(xì)胞生產(chǎn)出脊髓灰質(zhì)炎疫苗，此后一直將原代細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)。原代細(xì)胞直接來源于動物組織，屬于正常細(xì)胞，沒有DNA 突變及致瘤性，具有廣泛的病毒敏感性，但來源不同的原代細(xì)胞的質(zhì)量及敏感性存在差異，且自我增殖能力有限，細(xì)胞培養(yǎng)條件嚴(yán)苛，獲得的疫苗可能存在潛在的病毒等外源因子的污染問題。因此，基于疫苗安全性的考慮，原代細(xì)胞并不作為細(xì)胞庫存儲或者僅在一定程度上有限存儲，這都促使生產(chǎn)商積極開發(fā)出更適用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)。

細(xì)胞基質(zhì)疫苗生產(chǎn)工藝的第二次變革是從原代細(xì)胞中獲得連續(xù)細(xì)胞系，即二倍體細(xì)胞系和傳代細(xì)胞系。如人肺來源的MRC-5 和WI-38 細(xì)胞［3-4］，是從原代細(xì)胞中獲得的二倍體細(xì)胞系，具有正?；蚪咏５暮诵?，與原代細(xì)胞相比，可通過鑒定建立細(xì)胞種子庫進(jìn)行系統(tǒng)化生產(chǎn)，以保證疫苗生產(chǎn)過程的可控性以及疫苗產(chǎn)品的穩(wěn)定性。但生產(chǎn)過程難以規(guī)?；?，對培養(yǎng)液以及血清營養(yǎng)成分的高要求，增加了外源物污染的風(fēng)險(xiǎn)，給疫苗的安全性帶來了挑戰(zhàn)，且這類細(xì)胞增殖能力有限，最終會出現(xiàn)衰老和凋亡。不同于二倍體細(xì)胞系，傳代細(xì)胞系具有無限的自我增殖能力，可以適應(yīng)現(xiàn)代培養(yǎng)技術(shù)，能夠通過生物反應(yīng)器進(jìn)行高密度大規(guī)模生產(chǎn)，如MDCK 細(xì)胞和Vero 細(xì)胞等［5-6］，但隨著細(xì)胞的多次傳代，遺傳修飾可能發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)致瘤性的表型。如在代次高的Vero 細(xì)胞系（P162）顯示出遺傳的不穩(wěn)定性，并表現(xiàn)出發(fā)展成為腫瘤的可能性。因此，僅有低傳代的非致瘤性細(xì)胞才可以用于疫苗生產(chǎn)，但由于這類細(xì)胞的廣泛使用，種子庫存正在減少。

面對傳代細(xì)胞系存在的限制，生產(chǎn)商結(jié)合基因工程、克隆等分子技術(shù)，探索性的建立了專有細(xì)胞系，迎來了疫苗生產(chǎn)工藝的第三次飛躍［7］。目前這類細(xì)胞系已經(jīng)作為新型細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)用于特定的生產(chǎn)工藝中，為滿足生物制品的監(jiān)管及安全性的要求已被廣泛表征。如基因治療中腺病毒的生產(chǎn)（PER.C6?細(xì)胞系）或流感疫苗的生產(chǎn)等［8］。見表1［9］。

2 生物制品的監(jiān)管

自第一代疫苗生產(chǎn)以來，監(jiān)管部門以及公共衛(wèi)生當(dāng)局監(jiān)察的重點(diǎn)一直是細(xì)胞成分和可能存在的外源因子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些重要的污染來源［10］。如20 世紀(jì)60 年代用于生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎疫苗的猴腎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了猴病毒（SV40）；20 世紀(jì)70 年代早期輪狀病毒疫苗（Rotarix?和RotaTeq?）中檢測出豬圓環(huán)病毒序列等［11］。

表1 常見生產(chǎn)用疫苗的細(xì)胞基質(zhì)Tab.1 Common cell substrates for vaccine production

科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步以及分析方法的完善，已經(jīng)能夠證明存在以前未知或無法檢測到的污染物，監(jiān)管部門也開始實(shí)施新的生產(chǎn)和控制策略，并將其指定為指導(dǎo)疫苗生產(chǎn)的藥典。藥典中詳細(xì)說明疫苗生產(chǎn)的原材料和起始材料的選擇及表征、中間產(chǎn)品和最終產(chǎn)品的控制以及生產(chǎn)過程的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證，現(xiàn)已涉及到疫苗用細(xì)胞基質(zhì)的相關(guān)問題，如這類細(xì)胞基質(zhì)通常表現(xiàn)出的致瘤性和成瘤性等。通過定期修訂，藥典為生產(chǎn)商提供了關(guān)于疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的選擇、表征和維護(hù)等要求［12］。

首先，生產(chǎn)病毒性疫苗的細(xì)胞基質(zhì)必須具有良好的特征，符合預(yù)期的目的，且經(jīng)過仔細(xì)的記錄。對于所有類型的細(xì)胞，根據(jù)生產(chǎn)規(guī)范（GMP）和細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范（GCCP）［13］的一般原則，需要制備主細(xì)胞庫（MCB）和工作細(xì)胞庫（WCB），此方案可確保細(xì)胞的可靠性和一致性，以及用于生產(chǎn)之前的安全檢測。細(xì)胞庫適合儲存在長期穩(wěn)定的環(huán)境中，如液氮或超低溫冰箱，并需要定期進(jìn)行檢測，以此保證其表型和基因型的穩(wěn)定性。

其次，為了保證疫苗制品的安全性，生產(chǎn)商根據(jù)國家監(jiān)管當(dāng)局的規(guī)定以及細(xì)胞的特性，規(guī)定了用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞檢測程序，包括來源、穩(wěn)定性和增殖性、無菌性以及病毒性的分析等。如核型、同工酶圖譜、DNA、生長速率、特定染色體或表面標(biāo)記等；其中非病毒劑的檢測有細(xì)菌、真菌、支原體和分枝桿菌等；病毒劑的檢測有血凝試驗(yàn)、在不同細(xì)胞系中觀察細(xì)胞病變、物種的體內(nèi)試驗(yàn)等；逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測有透射電子顯微鏡（TEM）和生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERT）試驗(yàn)等［14］。此外，必須建立標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，以降低細(xì)胞基質(zhì)與供體分離后，在細(xì)胞基質(zhì)上進(jìn)行適應(yīng)、工程或克隆時外源物污染的風(fēng)險(xiǎn)。人或動物來源的原材料，必須針對潛在污染物進(jìn)行徹底的記錄和分析。建議對來源物種或衍生過程中使用的原材料中的病毒進(jìn)行化驗(yàn)，如使用化學(xué)誘導(dǎo)劑方法檢測潛伏病毒（DNA 病毒和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒）是否存在［15］。

很多安全性疫苗是由原代細(xì)胞和二倍體細(xì)胞為基質(zhì)生產(chǎn)的，監(jiān)管部門已認(rèn)定這類細(xì)胞的殘余DNA無危險(xiǎn)性，即使用該細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)疫苗不存在致瘤性的潛在危險(xiǎn)，反觀傳代細(xì)胞，因?yàn)檎{(diào)控生長的基因失調(diào)才具備了無限增殖的能力，因此理論上認(rèn)為傳代細(xì)胞系的DNA 具有使其他細(xì)胞生長失控以及產(chǎn)生致瘤性的潛在能力。細(xì)胞基質(zhì)的致瘤性表型可在至少4 個月的觀察中通過評估在107、105、103和101cells／animal 的劑量下腫瘤形成的動力學(xué)來定義，評估的參數(shù)包括50%動物的腫瘤產(chǎn)生劑量（TPD50）、腫瘤發(fā)展所需的時間和形成轉(zhuǎn)移的能力等。目前的理解是，較低的TPD50（101～ 104cells ／ animal 時形成腫瘤的能力，包括HeLa 細(xì)胞）與腫瘤的誘導(dǎo)發(fā)生具有相關(guān)性［16］。鑒于隨著細(xì)胞代次增加，致瘤性概率的相對提高，必須對所有的二倍體細(xì)胞系（特征良好的MRC-5 和WI-38 除外）和傳代細(xì)胞系進(jìn)行致瘤性評估。

致瘤性細(xì)胞是指將完整的細(xì)胞注射至遺傳免疫缺陷動物后，具有形成腫瘤能力的細(xì)胞。使用細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)疫苗需要進(jìn)行細(xì)胞的致瘤性評估，即必須將細(xì)胞DNA（≥100 g）和細(xì)胞裂解物（從107個細(xì)胞中獲得）注射至新生裸鼠、新生倉鼠或新生大鼠中，在至少4 個月的時間內(nèi)對動物進(jìn)行檢查，尋找形成的結(jié)節(jié)。在觀察期結(jié)束時，人道處死動物并檢查注射部位結(jié)節(jié)形成情況及病灶轉(zhuǎn)移情況。

自20 世紀(jì)90 年代以來，使用永生化細(xì)胞系生產(chǎn)病毒性疫苗是人們一直在討論的課題［17］。與細(xì)胞基質(zhì)致瘤性相關(guān)的主要為誘導(dǎo)同種異體腫瘤移植、轉(zhuǎn)移已知或者未知的病毒以及轉(zhuǎn)移可能引發(fā)腫瘤的致癌劑或細(xì)胞成分等。目前監(jiān)管部門認(rèn)為，制造疫苗的首要安全問題是致瘤細(xì)胞系或來源于腫瘤的細(xì)胞系中的細(xì)胞DNA 和外源因子。因此，需要在生產(chǎn)過程中對細(xì)胞基質(zhì)中的外源因子及細(xì)胞DNA進(jìn)行清除。

3 生 產(chǎn)

生產(chǎn)過程中細(xì)胞基質(zhì)的選擇對疫苗制品的安全性以及穩(wěn)定性均有很大的影響。由于部分細(xì)胞基質(zhì)有可能本身攜帶內(nèi)源性病毒或外界污染的病毒，若無法保證生產(chǎn)過程的絕對安全，通過細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的疫苗也會含有污染的病毒，這直接影響疫苗制品的安全性。細(xì)胞基質(zhì)的敏感性直接影響疫苗生產(chǎn)的產(chǎn)量，只有進(jìn)行規(guī)?；姆€(wěn)定生產(chǎn)，才能保證使用該細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的疫苗能夠真正起到預(yù)防傳染性疾病的作用。因此，細(xì)胞基質(zhì)的敏感性評價(jià)不僅要監(jiān)控病毒在細(xì)胞基質(zhì)上適應(yīng)的全過程，更要評估疫苗制品生產(chǎn)的可行性。此外，在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，應(yīng)盡可能接種少量的病毒，但盡可能多的收獲病毒液，同時為了在降低成本的前提下達(dá)到高生產(chǎn)性能，必須考慮以下幾個方面。

3.1 用于病毒生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)的培養(yǎng) 許多疫苗生產(chǎn)工藝均是在轉(zhuǎn)瓶或者細(xì)胞工廠中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞系進(jìn)行的。由于成本、占用樓層和勞動力等限制，這些技術(shù)無法擴(kuò)大培養(yǎng)［18］。雖然，固定床表面系統(tǒng)等新的替代方案有稍許改進(jìn)［19-20］，但貼壁細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)主要是依靠攪拌式生物反應(yīng)器中的微載體系統(tǒng)。在這個控制良好的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中，隨著微載體表面積與生物反應(yīng)器體積的增加，細(xì)胞得以擴(kuò)大培養(yǎng)，并且操作簡單，勞動強(qiáng)度低。然而，微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的技術(shù)，即在擴(kuò)大培養(yǎng)的過程中伴隨著昂貴和繁瑣的細(xì)胞分離操作［21］。因此，隨著科技的進(jìn)步，開發(fā)出MDCK、PER.C6?、EB66?或AGE1.CR?等懸浮細(xì)胞系，能夠?qū)崿F(xiàn)無微載體培養(yǎng)，有效解決貼壁細(xì)胞培養(yǎng)中面臨的許多安全性問題，提高細(xì)胞培養(yǎng)過程中的成本效益、可操作性及安全性［22］。如2012 年Novartis 公司利用懸浮MDCK細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗Optaflu ／Flucelvax（三價(jià)），該疫苗在歐盟及美國已獲準(zhǔn)上市。同年，MedImmune公司以懸浮MDCK 細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗Flumist（四價(jià)），已在美國獲準(zhǔn)上市。

每種細(xì)胞基質(zhì)均有其自身的自然屬性和特性，包括細(xì)胞的營養(yǎng)需求、代謝控制、剪切敏感性、需氧量、遺傳穩(wěn)定性、代謝副產(chǎn)物、最佳溫度、pH 值、滲透壓等。因此，培養(yǎng)基的優(yōu)化在整個工藝流程中起著至關(guān)重要的作用，其不僅可確保細(xì)胞的高密度生長，還能夠提高病毒的產(chǎn)毒量。疫苗生產(chǎn)的培養(yǎng)基中大多含有胎牛血清（FBS），F(xiàn)BS 存在批間差，經(jīng)常導(dǎo)致生產(chǎn)工藝的不穩(wěn)定［23］，并且FBS 作為外源因子，導(dǎo)致疫苗制品存在較大的安全性隱患，這就促使生產(chǎn)商將培養(yǎng)基的優(yōu)化方向轉(zhuǎn)為無動物成分的細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞特異性培養(yǎng)基的開發(fā)及生產(chǎn)［24-26］。通常情況下，培養(yǎng)基的開發(fā)和生產(chǎn)會外包給專門的培養(yǎng)基供應(yīng)商，而培養(yǎng)基供應(yīng)商的目標(biāo)則是選擇出達(dá)到生產(chǎn)力目標(biāo)、符合GMP 的質(zhì)量和監(jiān)管要求的最佳培養(yǎng)基配方，在保證安全性的前提下滿足疫苗生產(chǎn)過程中對培養(yǎng)基的需求。

3.2 病毒純化 經(jīng)過生產(chǎn)商的不斷探索，病毒在細(xì)胞基質(zhì)上的產(chǎn)量得到了顯著提高。相比之下，由于嚴(yán)格的監(jiān)管規(guī)則，病毒回收率通常較低，且生產(chǎn)過程中存在的細(xì)胞殘留蛋白屬于異源蛋白，很可能會引發(fā)機(jī)體的過敏反應(yīng)，在使用傳代細(xì)胞生產(chǎn)疫苗時，應(yīng)進(jìn)行分離純化，盡可能去除異源蛋白，并進(jìn)行純化工藝的驗(yàn)證，以保證疫苗制品的安全性。

細(xì)胞基質(zhì)用于疫苗生產(chǎn)，必須考慮到病毒與其他可傳播因子、細(xì)胞DNA 和促生長蛋白等對疫苗安全性帶來的影響。但目前對異源蛋白的檢測手段仍不完善，仍以疫苗的蛋白總量進(jìn)行間接質(zhì)控。事實(shí)上，許多純化步驟是必要的，從細(xì)胞裂解，通過宏觀和微過濾去除細(xì)胞碎片，濃縮和酶解，層析或區(qū)帶離心純化，再到使用納濾殺菌。為了符合藥典要求，對需純化的物質(zhì)的分析必須包括無菌、產(chǎn)品特性和效力，以及生產(chǎn)過程殘留物的定量，如牛血清白蛋白、抗生素、苯甲酶、HCD 和蛋白質(zhì)等。然而這種操作過程不僅引發(fā)病毒顆粒的重大損失，且占主要的生產(chǎn)成本消耗［27-28］。為了獲得更高的病毒產(chǎn)率，生產(chǎn)商不斷嘗試新的純化技術(shù)。目前，病毒產(chǎn)率已經(jīng)成為疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域技術(shù)訣竅中非常重要的一部分。

4 展 望

生物制品的質(zhì)量控制不僅指對最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制，更包括對整個生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制，包括原材料、中間產(chǎn)品、最終產(chǎn)品及生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制等。細(xì)胞基質(zhì)作為疫苗生產(chǎn)的主要原材料，其質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響疫苗的質(zhì)量和產(chǎn)量以及疫苗的安全性。細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)疫苗時，焦點(diǎn)在于可能存在的外源因子污染和某些情況下細(xì)胞本身的特性，以及細(xì)胞培養(yǎng)中各個環(huán)節(jié)的操作。這些均推動疫苗行業(yè)在保證安全性的前提下，向更高的反應(yīng)性、靈活性和降低運(yùn)營成本的方向發(fā)展，以確保經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)性。怎樣以一種較智能的方式生產(chǎn)疫苗，同時保持對生產(chǎn)高質(zhì)量產(chǎn)品的堅(jiān)定承諾［29］，這是新時代疫苗生產(chǎn)工藝面臨的巨大挑戰(zhàn)。

目前，疫苗生產(chǎn)中的相關(guān)設(shè)施可以快速地建立和調(diào)試，使用模塊化設(shè)施替代運(yùn)營復(fù)雜、成本高昂、產(chǎn)品周期長的不銹鋼設(shè)施，相對地減少資本和運(yùn)營支出［30］，這些改進(jìn)使得各種生物制品在給定空間內(nèi)生產(chǎn)成為可能。整合上游和下游的全連續(xù)加工模式，預(yù)計(jì)將提供比傳統(tǒng)批量生產(chǎn)戰(zhàn)略更高的效益。這種能夠快速高效且以低成本運(yùn)營的生產(chǎn)工藝，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)始終保持恒定，有毒副產(chǎn)品被有效排放，工藝之間無停頓，可以提供更高的產(chǎn)品收獲率，并且能夠更好地解決疫苗生產(chǎn)過程中存在的安全性隱患。

隨著行業(yè)中疫苗生產(chǎn)的趨勢從以雞胚為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝轉(zhuǎn)向以細(xì)胞基質(zhì)為基礎(chǔ)的疫苗生產(chǎn)工藝，但鑒于目前仍然僅有相對較少數(shù)量的細(xì)胞基質(zhì)這一事實(shí)，建立和驗(yàn)證新的疫苗用細(xì)胞基質(zhì)引起了生產(chǎn)商的關(guān)注。因此，安全細(xì)胞基質(zhì)的多樣性保證了現(xiàn)在和未來的高標(biāo)準(zhǔn)疫苗供應(yīng)。

綜上所述，疫苗用細(xì)胞基質(zhì)的理想特征是其應(yīng)該對多數(shù)病毒敏感，能夠在短時間內(nèi)無限增殖到高細(xì)胞密度，并易于放大，能夠達(dá)到較高的安全性評估標(biāo)準(zhǔn)。此外，由于細(xì)胞基質(zhì)是疫苗制品的重要組成部分，因此必須根據(jù)許多不斷完善的安全性和法規(guī)要求對其進(jìn)行廣泛表征，在選擇開發(fā)新疫苗的細(xì)胞基質(zhì)前，要多方面考慮。需要強(qiáng)調(diào)的是，當(dāng)前沒有任何細(xì)胞基質(zhì)滿足所有的標(biāo)準(zhǔn)，僅能在保證疫苗安全性的前提下考慮和評價(jià)不同的細(xì)胞基質(zhì)，為每個新疫苗選擇最優(yōu)的細(xì)胞基質(zhì)。